THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

Microsoft Word THỰC HÀNH VSĐC docx TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM THỰC TẬP VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG................

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

THỰC TẬP

VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Biên soạn: Th.S Nguyễn Minh Hiền

NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

GIỚI THIỆU CHUNG

1 Giáo trình phục vụ môn học

SV có thể sử dụng bất kỳ giáo trình nào về Thực hành Vi sinh đại cương

2 Nội dung học

Các thiết bị trong PTN Vi sinh, chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, phương pháp khử

trùng Phân lập, cấy chuyền VSV

Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV

Đếm tế bào men bằng buồng đếm hồng cầu

Khảo sát 1 số phản ứng sinh hoá của vi khuẩn

3 Yêu cầu của GV với SV

Yêu cầu kiến thức: Chuẩn bị bài trước khi đến phòng thí nghiệm GV sẽ kiểm tra bài, nếubất kỳ SV nào trong nhóm không chuẩn bị bài, cả nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và khôngđược dạy và học lại

Sau khi kết thúc môn học, SV có 5 -10 ngày để viết báo cáo Nộp bài cho 1 bạn (có chỉđịnh) trong nhóm Bài báo cáo ghi rõ họ tên, nhóm, tổ Bài báo cáo SV có thể đánh máyhoặc viết tay

Yêu cầu kỹ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu cầu khi thực hiệnthao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV)

Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định trong PTN và các yêucầu của GV Tham gia tích cực trả lời câu hỏi của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học

BÀI 1:

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG

1.1 Các thiết bị trong PTN Vi sinh

Sinh viên quan sát và tìm hiểu Sau đó, liệt kê đầy đủ thông tin vào Bảng 1

Bảng 1 Một số thiết bị trong PTN vi sinh

1 Tủ sấy Sấy khô, diệt khuẩn và tiệt trùng các dụng cụ dùng trong các thí nghiệm

2 Tủ ủ Tạo ra và duy trì mức nhiệt độ và độ ẩm thích hợp cho môi trường theo yêu cầu của người nghiên cứu

3 Máy đồng nhất mẫu Đồng hóa các loại mẫu

4 Máy ly tâm Tách những hỗn hợp các chất có tỉ trọng khác nhau

5 Bếp khuấy từ Làm nóng và khuấy đều môi trường bằng lực từ trường

6 Máy đếm khuẩn lạc Xác định và đếm sinh vật sống trong mẫu nghiên cứu

7

Nồi hấp tiệt trùng(Autoclave)

Khử trùng những vật dụng trong phòng thí nghiệm

8

Tủ lạnh Đảm bảo điều kiện lưu trữ, bảo quản tối ưu các vật

phẩm nghiên cứu trong thời gian dài ở nhiệt độ ổn định

9

Lò vi sóng Làm lỏng, nóng môi trường

10 Kính hiển vi Dùng để phóng đại các mẫu sinh học mà mắt thường không thể nhìn thấy được, tế bào động vật,

thực vật, vi khuẩn có kích thước cực kỳ nhỏ

1.2 Môi trường nuôi cấy VSV

1.2.1 Khái niệm:

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật là môi trường có điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển, chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết và nồng độ pH phù hợp

1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV

- Đủ chất dinh dưỡng cần thiết

- Độ pH thích hợp

- Độ nhớt nhất định

- Không chứa các yếu tố độc hại

- Hoàn toàn vô trùng

1.2.3 Phân loại

1.2.3.1 Phân loại môi trường theo thành phần

- Môi trường nuôi cấy tự nhiên: không xác định về mặt hóa học

- Môi trường nuôi cấy tổng hợp: xác định về thành phần hóa học

- Môi trường bán tổng hợp: Môi trường tự nhiên nhưng một số thành phần hóa học đã được xác định rõ

1.2.3.2 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lý

- Môi trường rắn: chứa thạch với nồng độ 1,5-2% hoặc một số khác

=> Công dụng: phân lập và nhân giống

- Môi trường bán rắn: chứa thạch với nồng độ 0.5% hoặc ít hơn

=> Công dụng: kiểm tra khả năng di động của vi sinh vật, phù hợp cho việc nuôi cấy vi khuẩn Microaerophilic

- Môi trường lỏng: khong chứa gelatin hoặc agar

=> Công dụng: nhân giống, nghiên cứu lên men và các thử nghiệm khác

1.2.3.3 Phân loại môi trường theo công dụng

Môi trường cơ bản (General purpose media)

- Phù hợp với hầu hết vi sinh vật Chúng thường chứa nguồn carbon, năng lượng

(thường là glucose), muối, axit amin và vitamin Các nguyên liệu thô phức tạp khác nhau (chẳng hạn như peptone, chiết xuất thịt, và chiết xuất nấm men- Yeast) được sử dụng trong việc chuẩn bị các môi trường này

Môi trường tăng sinh (Enrich media)

- Dành cho vi sinh vật khó mọc.Môi trường tăng sinh cung cấp cả tác nhân hóa học và vật lý để tăng số lượng vi sinh vật Không có tác nhân ức chế nào được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn

Môi trường phân biệt (Differential media)

- Chúng chứa các chất làm cho màu sắc của các cụm khuẩn lạc Nhờ môi trường này

mà ta có thể phân biệt được chủng này và chủng kia trên cùng một đĩa nuôi cấy

Môi trường chọn lọc (Selective media)

- Chúng cho phép một số loại vi sinh vật phát triển do không có một số chất dinh dưỡngquan trọng trong môi trường khiến nó không thuận lợi cho hầu hết các vi sinh vật, các

chất ức chế trong môi trường ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn và cung cấp các chất hỗ trợ phân lập và nhận dạng nhanh chóng cho vi sinh vật bằng cách ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn.

1.2.4 Công thức môi trường

Ví dụ: Môi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng để nuôi cấy men, mốc

Các thông tin có trong công thức môi trường (GV chỉ định loại môi trường)

Môi trường PCA (Plate Count Agar): xác định tổng số lượng vi khuẩn hiếu khí sống trong mẫu

pH 7.4 +/- 0.2 ở 25ºC

1.2.5 Các bước để nấu môi trường (GV hướng dẫn cách làm)

Chuẩn bị môi trường

Bước 1: Cân, đong ( bằng ống đong ) môi trường theo công thức.

Bước 2: Đun ( nếu cần ), kiểm tra pH.

Bước 3: Phân phối môi trường vào dụng cụ vô trùng.

Bước 4: Khử trùng theo yêu cầu

1.3 Phương pháp khử trùng

1.3.1. Khử trùng môi trường

Bảng 2 Khử trùng môi trường bằng phương pháp………

Phương pháp Nhiệt độ/ thời gian Nguyên lý tiêu diệt VSV

Dựa vào nhiệt độ để bất hoạt các vi sinh vật

Nhiệt khô Nhiệt độ: 180

Thời gian: 30 phút Dựa vào nhiệt độ để bất hoạt các vi sinh vật

1.3.2 Khử trùng dụng cụ

Dụng cụ thuỷ tinh: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ), nhiệt khô ( tủ sấy )

Dụng cụ nhựa: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng )

1.3.3. Khử trùng PTN: phun hơi độc, đèn UV

2.1 Kết quả thực hành

(hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng)

Môi trường……… Môi trường……… Môi trường………

* Hình ảnh em xin để ở cuối *

BÀI 2:

PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VI SINH VẬT

2.1 Phân lập

2.1.1 Khái niệm

- Là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết

………

2.1.2 Mục đích phân lập - Tạo dòng thuần ………

………

2.1.3 Phương pháp phân lập (GV hướng dẫn thao tác) VSV Dụng cụ Môi trường Phương pháp Vi khuẩn Đĩa peptri, nồi hấp tiệt trùng, lọ tam giác, cân điện tử, lò vi sóng, que cấy vòng PCA + agar + Nấm men ………

………

………

………

………

………

VSV Dụng cụ Môi trường Phương pháp

Nấm mốc mẫu được

chuẩn bị sẵn,đèn cồn ,dao hoặc lưỡi lam ,nhíp gắp,lọ nước

cồn,đĩa petri, lọ tam giác, que cấy móc

Czapek – pectin (g/L)

………

………

………

………

………

………

2.2 Cấy chuyền

2.2.1 Khái niệm

- Truyền vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác

2.2.2 Mục đích

- Giúp bảo quản, nhân giống và khảo sát sinh hóa

2.2.3 Phương pháp cấy chuyền (GV hướng dẫn thao tác)

hơ lại miệng ống nghiệm rồi đóng nắp

- Lưu ý: luôn giữ que cấy và miệng ống nghiệm trong môi trường vô trùng (cách ngọn lửa tầm 5cm)

Thạch đứng: dùng que cấy thẳng, đưa que cấy vuông góc cách đáy 1cm

Thạch nghiêng sâu: dùng que cấy thẳng, đưa que cấy xuống cách đáy 1cm, cấy ziczac trên phần nghiêng

Thạch nghiêng: dùng que cấy vòng, cấy ziczac trên phần nghiêng

Đĩa: dùng que cấy vòng, chia đáy thành 4 phầnB1: Hơ que cấy, cấy ziczac ở phần 1

B2: Hơ que cấy, gióng từ phần 1 cấy các đường song song qua phần 2

B3: Hơ que cấy, gióng và cấy các đường song song từ phần 2qua phần 3

B4: Hơ que cấy, gióng từ phần 3 cấy các đường ziczac

- Lưu ý: Làm đến đâu mở nắp đến đó và đường cấy các phầnkhông chạm nhau

Nấm mốc Que cấy móc

Vi khuẩn Que cấy vòng, que

cấy thẳng

2.3 Kết quả thực hành

(hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng)

Cấy phân lập……… Cấy chuyền……… Cấy chuyền………

……… ……… ………

* Hình ảnh em xin để ở cuối *

BÀI 3:

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HOÁ CỦA VSV

3.1 Mục đích

- Định danh, xác định vi khuẩn

3.2 Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hoá

Yêu cầu về VSV: Dòng thuần, không lẫn tạp nhiễm,

Yêu cầu thời gian đọc kết quả: 24g sau nuôi cấy

3.3 Một số phản ứng sinh hóa cơ bản

Mục đích Thành phần môi trường Kết quả - giải thích – hình minh chứng

Môi trường PCA

Agar: 9-18 gms/l

pH cuối cùng là 7.0 ± 0.2 ở 25°C

Soloble Starch: 10 gms/lCasein (Vitamin free): 0.3 gms/l

KNO3: 2 gms/lMgSO4.7H2O: 0.05 gms/l

K2HPO4: 2gms/lNaCl: 2gms/lCaCO3: 0.02 gms/lFeSO4.7H2O: 0.01 gms/lAgar: 18 gms/l

Nước biển/Nước cất = 1000 ml

pH (ở 25°C) 7.0 ± 0.1

- Vi sinh vật phát triển nhưng có sự khác nhau ở từng phần (phần 1 thường dày đặc hơn, phần 4 ít nhất)

- Vì trong quá trình nuôi cấy, lượng vi sinh vật trên que cấy ở phần 1 thường nhiều hơn

và giảm dần qua phần 2 và 3 Cuối cùng phần 4 là phần ít nhất

-Vi khuẩn đường ruột Lactobacillus:

Thường không dẫn đến bất kỳ thay đổi màu sắc nào trên môi trường SCA

Mục đích Thành phần môi trường Kết quả - giải thích – hình minh chứng

Môi trường KIA

pH 7.4 +/- 0.2 ở 25ºC

Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat), đỏ phenol (chỉ thị pH), pepton (nguồn

carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với thiosulfate natri Có 3 hình thái lên men carbohydrat có thể xảy ra là:

- Acid (màu vàng) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng của môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật lên men đường glucosenhưng không lên men đường lactose

- Acid (màu vàng) phần gốc và acid (màu vàng) phần nghiêng của môi trường, khi đócho thấy vi sinh vật lên men cả đường glucose và đường lactose

- Kiềm (màu đỏ) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật không thể lên men đường glucose và đường lactose Các sản phẩm sinh ra không phải là sản phẩm acid

Khuẩn lạc của nấm men

Trên môi trường PCA

4.2.1 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm

đơn Mục đích:

- Thường áp dụng với nấm men

- Quan sát và đo kích thước tế bào

- Cho phép quan sát rõ hình dạng, cấu tạo của tế bào cũng như đếm số lượng tế bào

Cách tiến hành:

B1: Ghi tên VSV Tạo vết bôi

- Hơ kỹ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, mở nắp ống nghiệm và hơ qua ngọn lửa đèn cồn

- Chạm nhẹ que cấy vào thành ống nghiệm để làm nguội que cấy Nhúng que cấy vào môi trường lỏng khuấy nhẹ để lấy mẫu

- Khi lấy que cấy ra, tránh chạm vào miệng ống nghiệm Hơ lại miệng ống nghiệm rồi đậy nắp lại

Lưu ý: Giữ que cấy và miệng ống nghiệm trong môi trường vô trùng (cách ngọn lửa đèn cồn 5cm)

B2: Cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi vết bôi khô

B3: Nhuộm màu (Sử dụng Gentian Violet, Fuchsin kiềm, Xanh metylen)

- Đặt tiêu bản cố định trên giá rồi nhỏ vài giot thuốc nhuộm phủ kín vết bôi

- Sau 1-2 phút, đổ thuốc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng nước sạch đến khi nước chảy qua vết bôi không còn màu

- Thấm khô tiêu bản bằng giấy thấm

B4: Quan sát tiêu bản dưới Kính hiển vi

4.2.2. Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép (GV hướng dẫn thao tác)

Mục đích:

- Quan sát được hình dạng, kích thước và cách sắp xếp tế bào

- Phân biệt vi khuẩn gram âm và gram dương

Cách tiến hành:

B1: Ghi tên VSV Tạo vết bôi

B2: Cố định vết bôi

B3: Nhuộm màu ( VIAS)

- Nhỏ thuốc nhuộm Crystal Violet vào tiêu bản để 1 phút Rửa sạch bằng nước sạch và thấm khô bằng giấy sao cho vẫn giữ được vết bôi

- Nhỏ Lugol để 1 phút Rửa nước => Tẩy cồn => Rửa nước

- Nhỏ thuốc nhuộm Saffranin, để 30s Rửa nước

B4: Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X (nhỏ giọt dầu)

4.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp giọt ép

Mục đích:

- Đặc điểm của sợi nấm

- Đặc điểm của cơ quan sinh sản

- Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử

Cách tiến hành:

B1: Dùng 1 phiến kính khô, nhỏ lên đó 1 giọt nước cất

B2: Dùng que cấy hay pipet lấy lên phiến kính một giọt huyền phù VSVB3: Đặt lá kính mỏng lên giọt huyền phù VSV sao cho không tạo ra bọt khíB4: Thấm nhẹ lớp dịch trào ra ngoài lá kính

B5: Tiến hành quan sát trên kính hiển vi

4.3 Kết quả thực hành

Mỗi tiêu bản quan sát được phải có đầy đủ các thông tin sau:

+ Tên VSV

+ Vật kính quan sát

+ Hình dạng tế bào

+ Cách sắp xếp tế bào

+ Màu sắc tế bào (nếu là vi khuẩn phải ghi rõ đó là vi khuẩn Gram (+) hay Gram (-)

(hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng)

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

* Hình ảnh em xin để ở cuối *

4.4 Bài tập về nhà

4.4.1. Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát kính hiển vi ở vật kính 100? Dầu soi rất cần thiết khi soi với vật kính 100 Nó làm tăng độ chiết quang cảu môi trường Nếu không có dầu soi bạn không thể soi được Bởi vì khả năng phân giải của vật kính phụ thuộc vào khẩu độ của nó, điều này phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ của môi trường giữa mẫu thử và vật kính

4.4.2. Giải thích cơ chế bắt của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

- Vì cấu tạo vách tế bào khác nhau nên nên khi tiến hành nhuộm vi khuẩn gram âm và gram dương sẽ có cơ chế bắt màu khác nhau

+ Vi khuẩn Gram (+): màu tím Chúng có lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng lưới có khả năng bắt màu tím của thuốc nhuộm tím gentian tinh thể Cũng vì lớp vách dày nên việc tẩy cồn sẽ khó khăn hơn do đó vi khuẩn giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím Gentian+ Vi khuẩn Gram (-): màu xanh Lớp vách peptidoglycan mỏng hơn và nó có thêm lớp màng lipopolysaccharide phía ngoài, khi tẩy cồn cồn hòa tan lớp màng và do lớp vách mỏng bị cồn tẩy dễ dàng nên nó không giữ được màu tím của thuốc nhuộm mà sẽ bắt màu thuốc nhuộm sau là dung dịch Fushin kiềm

4.4.3. So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép

Giống nhau

Nhuộm đơn Nhuộm kép

- Đều cố định vết bôi và nhuộm trước khi thực hiện quan sát dưới kính hiển

- Thực hiện nhuộm màu 2 lần Chọn 2 loại thuốc nhuộm để thực hiện Có thể căn cứ theo phương pháp V.I.A.S

Với thứ tự như sau + Crystal Violet: 1 phút+ Lugol: 1 phút

+ Alcohol (cồn): nhúng nhanh qua+ Saffarnin: 30 giây

Khác nhau

về mục đích

Quan sát hình dạng, kích thước, cách sắp xếp của tế bào Phân biệt 2 loại vi khuẩn Gram ( + ) và Gram ( - )

BÀI 5:

ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

5.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu

Mục đích:

- Xác định nồng độ tế bào trong mẫu chất lỏng

BĐHC là phiến kính thuỷ tinh hình chữ nhật, trên đó có khắc lưới đếm

Hình 5.1 Buồng đếm hồng cầu

Hình 5.2 Lưới đếm

Lưới đếm là 1 hình vuông, có độ dài cạnh là 1mm gồm 25 ô vuông lớn.

1 ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ

Các ô vuông lớn chia cắt nhau bởi 3 đường kẻ song song

Chiều cao/độ sâu đường khắc trên lưới đếm là 0,1mm

S ô vuông lớn = 0,04 mm2 V ô vuông nhỏ = 2,5x10-4mm2

Khi đếm, ta thực hiện trên 5 ô đếm lớn tại các vị trí 4 góc và ô chính giữa

Và tại mỗi ô đếm lớn, ta cần chọn đồng bộ 2 cạnh kề của ô đếm để lấy tế bào nằm trêncạnh đó

Công thức tính số lượng nấm men trên mẫu bằng BĐHC:

5.2 Quy trình đếm nấm men (GV hướng dẫn quy trình)

B1: Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5- 10 tếbào (không lớn hơn 10 tế bào và nhỏ hơn 2,5 tế bào) Ô lớn từ 10-50 tế bào

B2: Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu Dùng Pipet nhỏ một giọt dung dịch mẫu vào giữa buồng đếm, tráng đều sao cho đầy khoang đếm

B3: Dùng phiến kính đậy lại, tránh tạo bọt khí

B4: Thực hiện soi dưới kính hiển vi và điều chỉnh sao cho phù hợp để đếm số lượng tế bào Tùy vào số lượng tế bào mà người dùng có thể đếm tất cả tế bào có trong ô hay chỉ đếm tế các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diện

B5: Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dung dịch từ 3 - 5 phút

5.4.1 Ưu điểm của phương pháp đếm trực tiếp tế bào bằng buồng đếm hồng cầu

- Đếm dễ dàng, nhanh, tiết kiệm thời gian

- Quan sát nhanh chóng mật độ vi sinh vật có trong mẫu

5.4.2 Nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp tế bào bằng buồng đếm hồng cầu