Giáo trình Vi sinh đại cương cung cấp cho người học những kiến thức như: Các yêu cầu cơ bản và cách sử dụng các thiết bị trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật; Môi trường nuôi cấy và các nguồn vi sinh vật; Quan sát vi sinh vật; Kỹ thuật gieo cấy và phân lập vi khuẩn thuần khiết; các phương pháp nhuộm vi khuẩn;... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 1 giáo trình.
Trang 1UỶ BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP
(Ban hành kèm theo Quyết định Số:…./QĐ-CĐCĐ-ĐT ngày… tháng… năm
2017 của Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp)
Đồng Tháp, năm 2017
Trang 2ii
TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN
Tài liệu này thuộc loại sách giáo trình nên các nguồn thông tin có thể được phép dùng nguyên bản hoặc trích dùng cho các mục đích về đào tạo và tham khảo Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc hoặc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh sẽ bị nghiêm cấm
Trang 3ii
LỜI GIỚI THIỆU
Xuất phát từ nhu cầu thực tế của môn học vi sinh đại cương, chúng tôi biên soạn bài giảng này, với mong muốn giúp cho các đối tượng sinh viên cao đẳng năm thứ hai Khoa nông nghiệp thủy sản thực hành được một số kỹ thuật
cơ bản về vi sinh học để hiểu sâu những nội dung đã được học trong phần lý thuyết
Lần đầu tiên biên soạn bài giảng thực hành phù hợp với điều kiện cơ
sở vật chất của nhà trường, phù hợp với yêu cầu thực tế và phù hợp với trình độ của sinh viên, chúng tôi không sao tránh khỏi những thiếu sót, do đó nhóm tác giả rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành của các chuyên gia
và của sinh viên, để lần tái bản sau sẽ sửa chữa bổ sung nội dung theo hướng cập nhật hóa, hiện đại hóa và thực tiễn tại Việt Nam
Đây là cuốn giáo trình được biên soạn công phu, nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của đồng nghiệp và các độc giả
Xin chân thành cảm ơn
Đồng Tháp, ngày 26 tháng 5 năm 2017
Chủ biên
Tăng Thị Thanh Hương
Trang 4ii
MỤC LỤC
Trang
Bài 1 Các yêu cầu cơ bản và cách sử dụng các thiết bị trong phòng kiểm nghiệm vi
sinh vật 1
Bài 2 Môi trường nuôi cấy và các nguồn vi sinh vật 9
Bài 3 Quan sát vi sinh vật 16
Bài 4 Kỹ thuật gieo cấy và phân lập vi khuẩn thuần khiết 20
Bài 5 các phương pháp nhuộm vi khuẩn 28
Bài 6 Phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
Trang 5i
GIÁO TRÌNH MÔN HỌC
Tên môn học: VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Mã môn học: CNN221
Vị trí, tính chất, ý nghĩa và vai trò của mô đun:
- Vị trí: Vi sinh đại cương là môn học kỹ năng chuyên ngành bắt buộc, được bố trí sau khi người học đã học xong chương trình các môn học chung và các môn học cơ sở
- Tính chất: đây là một trong những môn học kỹ năng quan trọng, giúp sinh viên hiểu về các hoạt động Vi sinh đại cươngvà các kỹ năng cần thiết trong hoạt động khuyến nông
Ý nghĩa và vai trò: Giáo trình này cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản
nhất về nông Khuyến nông, kỹ thuật tổ chức và quản lý các chương trình Vi sinh đại cương nhằm giúp sinh viên sau khi ra trường có thể nắm được các kỹ năng cần thiết để xây dựng và quản lý chương trình Vi sinh đại cươngmột cách hiệu
có cảm tình và đạt hiệu quả cao trong công việc
+ Biết các nguyên tắc thuyết phục nông dân hành động và biết cách tổ chức những buổi tập huấn, hội họp
+ Nắm bắt được các cách thiết kế bài giảng, áp phích, bảng lật, tờ bướm
- Về kỹ năng:
+ Thực hiện các nguyên tắc để lấy thiện cảm với nông dân
+ Xây dựng được bài thuyế trình và thực hiện thuyết trình trước nông dân đạt hiệu quả tốt
+ Thực hiện tổ chức những buổi hội thảo, tập huấn cho nông dân
+ Thiết kế được các bảng lật, bài báo cáo sinh động, dễ hiểu
- Về năng lực tự chủ và trách nhiệm:
+ Rèn luyện tính cẩn thận, ham học hỏi
Trang 6ii
+ Làm việc độc lập hoặc làm việc theo nhóm, giải quyết công việc, vấn đề phức tạp trong điều kiện làm việc thay đổi, chịu trách nhiệm cá nhân và trách nhiệm đối với nhóm
Nội dung của mô đun:
Thực hành, thí nghiệm, thảo luận, bài tập
Chương 2: Môi Trường Nuôi
Cấy và Các Nguồn Vi Sinh
Vật
3 Chương 3: Quan Sát Vinh Vật 2 2
4
Chương 4: Kỹ Thuật Gieo Và
Phân Lập Vị Khuẩn Thuần
7 Chương 6: Phương pháp Điếm
Trang 71
Chương 1
CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN VÀ CÁCH SỬ DỤNG CÁC THIẾT BỊ
TRONG PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
Vi sinh vật được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, vì vậy khi nuôi cấy một loại vi sinh vật nào đó để phục vụ cho nghiên cứu thì rất dễ bị tạp nhiễm, do đó khi xây dựng phòng thí nghiệm cần chú ý địa điểm, vị trí, hướng gió và cách phân bổ từng khu vực trong phòng làm việc để bố trí các dụng cụ, thiết bị nhằm tránh tạp nhiễm khi nuôi cấy Thiết bị cơ bản nhất để quan sát vi sinh vật là kính hiển vi, bởi vì kích thứơc tế bào vi sinh vật rất nhỏ, mắt thường không thể thấy được Muốn quan sát hình thái, cấu tạo… của vi sinh vật ta phải sử dụng nó Kính hiển vi là dụng cụ quang học giúp phóng đại mẫu vật lên gấp nhiều lần và chúng ta có thể quan sát ảnh của chúng được rõ
1.1 Mục đích-yêu cầu
- Giúp sinh viên biết những quy tắc an toàn vi sinh vật trong phòng thí nghiệm
- Biết sát trùng dụng cụ thực hành và phòng thí nghiệm vi sinh
- Biết cấu tạo và cách sử dụng các thiết bị trong phòng thí nghiệm, đặc biệt là cách bảo quản kính hiển vi
1.2 Dụng cụ và thiết bị
- Tủ cấy vi sinh vật
- Tủ ủ ấm
- Tủ khử trùng nhiệt khô
- Nồi khử trùng nhiệt ướt (Autoclave)
- Các dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, ống đong, đủa thủy tinh, đĩa đồng hồ, que trang…
- Kính hiển vi quang học (Olympus)
- Nhiệt kế, pH kế
- Máy lắc (Vortex)
- Dầu cèdre
1.3 Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm
1 Các yêu cầu về phòng kiểm nghiệm
Trang 82
- Phòng kiểm nghiệm phải được xây dựng nơi cao ráo, tháng mát, tránh nơi cộng cộng Trong phòng phải phân biệt thành từng khu vực riêng biệt như: thu và lưu mẫu, rửa dụng cụ, khử trùng dụng cụ, bảo quản hóa chất, nuôi cấy mẫu…
- Cửa luôn đóng để làm giảm thiểu sự dịch chuyển không khí, ngăn ngừa bụi làm giảm ngoại nhiễm
- Máy điều hòa không khí để kiểm soát độ ẩm, nhiệt độ
- Khử trùng phòng bằng formol 37%
2 Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm vi sinh
Cần tuân thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm:
- Không ăn uống, hút thuốc trong phòng
- Mặc áo blouse, mang găng tay và mang khẩu trang trong thời gian làm việc với
vi sinh vật
- Khử trùng mặt bàn bằng cồn 70oC lau bằng giấy thấm và khử trùng tay bằng cồn
70oC hoặc dung dịch diệt khuẩn khác
- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người cấy lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm, bình nuôi cấy
- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng, (không hút bằng miệng)
- Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng nhiễm vi sinh vật và hấp khử trùng trước khi bỏ vào các bãi rác
- Gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp đĩa petri
- Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt đầu que cấy châm vào ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí
- Rửa dụng cụ bằng xà bông nước để khử trùng
- Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm
1.4 Một số thiết bị thường dùng
1 Tủ cấy vi sinh vật
a Công dụng: tủ cấy là thiết bị bảo đảm ở buồng cấy không có vi sinh vật, ta
có thể dùng môi trường vô trùng và mẫu vật định cấy đưa vào để nhân giống hoặc cấy chuyền (trong điều kiện vô trùng)
Trang 93
b Cấu tạo: tủ cấy 1 người hoặc tủ cấy 2 người được che kín bên trên nóc,
phía trong có cấu tạo gồm:
- Quạt gió và lưới lọc bên trên, khi mở điện quạt gió luôn thổi ra làm cho không khí bên ngoài không tràn vào được, hệ thống lưới lọc ngăn cản bụi bẩn
- Hệ thống đèn cực tím để khử trùng mặt bàn và buồng cấy
- Đèn chiếu sáng để tạo đủ ánh sáng cho buồng cấy
- Công tắc ở bên phải tủ cấy
tự động tắt, sau 30 phút khử trùng, mới có thể đưa mẫu vật vào cấy
Khi mở cửa tủ, đèn cực tím tự động tắt và đèn chiếu sáng sẽ bật lên, lúc đó buồng cấy đã sẵn sàng cấy
Sau khi sử dụng xong, ta tắt tất cả các đèn và tủ rồi đóng kín cửa để hạn chế vi sinh vật lạ
2 Tủ ủ (incubator)
a Công dụng
Tủ ủ là thiết bị tạo nhiệt độ cần thiết để nuôi cấy vi sinh vật, nhiệt độ có thể thay đổi từ 25 – 60oC
b Cấu tạo: tủ ủ có cấu tạo đơn giản, gồm có vỏ và điện trở
- Vỏ tủ ủ cấu tạo gồm 2 lớp, ở giữa có đệm một lớp cách nhiệt
- Điện trở để cung cấp nhiệt làm nóng bầu không khí trong tủ và có một bộ phận điều chỉnh nhiệt độ tự động (rờ le) để giữ nhiệt độ cố định theo yêu cầu thí nghiệm
Trang 10để nuôi cấy vi sinh vật
b Cấu tạo
Nồi khử trùng nhiệt ướt được cấu tạo bằng kim loại, chắc chắn, dầy, có 2 lớp
vỏ và có khả năng chịu được áp suất cao Khí trong nồi là buồng khử trùng (nơi chứa các vật dụng cần khử trùng), buồng khử trùng có lắp van thoát không khí, áp kế, nhiệt
kế để đo áp suất, nhiệt độ hơi nước và van bảo hiểm để xì hơi khi áp suất vượt quá mức
an toàn và đảm bảo nồi không bị nổ Nước cất hoặc được đổ vào bên dưới nồi, hơi nước từ khoang chứa được cung cấp cho buồng khử trùng Phía trên nồi khử trùng có 1 nắp nặng được khóa chắc chắn bằng các nút vặn khít với buồng khử trùng bằng vòng đệm cao su
c Cách sử dụng
Cho vật dụng cần khử trùng vào buồng khử trùng, đổ nước sạch hoặc (nước cất 1 lần) vào khoang chứa nước, đậy nắp khoang chứa nước rồi cho các vật dụng cần khử trùng vào và đậy nắp nồi, khóa kín để không cho không khí hay hơi nước thoát ra ngoài Mở điện, điện trở bên dưới nồi sẽ cung cấp nhiệt làm sôi nước trong khoang chứa tạo ra hơi nước làm cho áp suất trong khoang tăng lên
Trang 115
Điều chỉnh Autoclave bằng cách chỉnh nhiệt độ đến 1210
C, khi nhiệt độ tăng
100oC, nước bốc hơi, hơi nước bị giữ trong điều kiện kín sẽ tăng áp suất và nhiệt độ tiếp tục tăng đến khi đạt nhiệt độ 121oC thì lúc đó cũng đạt áp suất tương ứng 1kgf/cm2, sau cùng điều chỉnh đồng hồ chỉ thời gian khử trùng
Khi áp suất tăng lên 1kgf/cm2 trong buồng khử trùng, thời gian khử trùng sẽ được tính Thời gian khử trùng lâu hay mau tùy loại vật dụng khử trùng Nồi khử trùng
tự động tắt và xả hơi tùy theo thời gian điều chỉnh
Sau khi khử trùng xong, phải đợi cho áp suất trong buồng khử trùng xuống đến 0 mới mở nắp nồi lấy vật dụng ra
4 Kính hiển vi quang học
a Cấu tạo: kính hiển vi quang học gồm 2 bộ thấu kính: vật kính và thị kính, sử
dụng ánh sáng thấy được như một nguồn sáng Một dãy thấu kính tập trung rõ ràng vào một hình ảnh sẽ được phóng đại lên nhiều lần Sự phóng đại này sẽ đạt được khi các tia
sáng từ một nguồn sáng đi qua một kính hội tụ để hướng ánh sáng đi qua mẫu vật Sau đó, các tia sáng sẽ đi qua vật kính, là một thấu kính gần mẫu vật nhất Hình ảnh của mẫu vật sẽ được phóng đại thêm một lần nữa bởi thị kính
Độ phóng đại toàn phần của một mẫu vật được tính bằng cách nhân độ phóng
đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính Đa số kính hiển vi quang học dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh đều có nhiều vật kính, đó là các vật kính 10x, 40x, 100x Phần lớn các thị kính đều có độ phóng đại 10x Nhân độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính, ta sẽ có độ phóng đại toàn phần là 100x, 400x, 1000x Một vài loại kính có thể đạt được độ phóng đại 2000x với vật kính dầu
Độ phân giải là khả năng của các thấu kính có thể phân biệt được các chi tiết
hay cấu trúc rất nhỏ của mẫu vật Đây chính là khả năng của các thấu kính có thể phân biệt được hai điểm cách nhau một khoảng cách nhất định
b Công dụng: quan sát được những mẫu vật rất nhỏ cũng như một vài chi tiết
cấu trúc của chúng
c Cách sử dụng kính
Cách tìm vi trường: nghĩa là sau khi điều chỉnh ta có thể tìm thấy hình ảnh của
mẫu vật cần quan sát dưới kính hiển vi Cần thực hiện các bước sau:
Đặt miếng lame có mang mẫu vật lên giá để kính
Trang 12Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp Để quan sát vi khuẩn trên một mẫu vật đã nhuộm, chúng ta cần điều chỉnh ánh sáng tăng dần theo độ phóng đại của vật kính 10x<40x< 100x để tìm được ảnh của vật Muốn vậy ta cần:
- nâng kính tụ quang lên hết mức
- Mở chắn sáng
- Bỏ lọc sáng (nếu có)
- Dùng gương lõm và điều chỉnh ánh sáng sao cho tập trung vào tụ quang
Nhìn vào thị kính, dùng tay xoay ốc sơ cấp (ốc lớn) chỉnh cho tới khi thấy được vi trường thì dừng ngay
Chuyển sang điều chỉnh bằng ốc thứ cấp (ốc nhỏ) cho tới khi hình ảnh hoàn toàn
rõ nét
Cách quan sát một mẫu vật trên tiêu bản:
- Mắt nhìn vào thị kính
- Một tay điều chỉnh ốc thứ cấp để cho hình ảnh luôn rõ nét
- Một tay điều chỉnh hai ốc chỉnh biên độ để di chuyển vị trí quan sát
- Cần quan sát tuần tự một mẫu vật trên tiêu bản theo đướng zigzag
- Ghi lại các đặc điểm, chi tiết mà ta quan sát được từ tiêu bản: đối với tiêu bản nhuộm từ vi khuẩn đã được nuôi cấy phân lập
+ Chọn nơi vi khuẩn không quá dầy
+ Xác định hình thể của vi khuẩn
+ Cách bắt màu phẩm nhuộm
+ Cách sắp xếp
d Bảo quản kính hiển vi: cuối buổi thực tập phải lau ngay vật kính dầu
Nâng vật kính lên để tách vật kính ra khỏi tiêu bản
Lấy tiêu bản ra khỏi giá để kính
Xoay vật kính dầu tới vị trí dễ lau nhất
Trang 137
Dùng giấy lau kính đặc biệt lau sạch dầu ở vật kính dầu
Chú ý: xoay vật kính 10x vào nấc và điều chỉnh cho tới khi vật kính này xuống mức
thấp nhất (vị trí nghỉ)
- Điều chỉnh các ốc chỉnh biên độ về vị trí giữa
- Lau sạch bụi phấn, giá để kính và đế kính
- Cầm kính hiển vi bằng 2 tay: một tay cầm thân kính, một tay đỡ bệ kính, và đem cất vào đúng vị trí trong phòng kính Đậy bao dậy kính lại
5 Các dụng cụ bằng thủy tinh
- Ống nghiệm có nắp đậy bằng bông không thấm nước hoặc bằng nút nhựa, nhôm hay Inox
- Đĩa Petri bằng thủy tinh
- Các dụng cụ khác: cốc thủy tinh, bình cầu đáy bằng và tròn, bình tam giác, các loại ống đong, ống hút
* Tất cả dụng cụ cần phải được rửa sạch, tráng qua nước cất và khử trùng ở nhiệt khô hoặc nhiệt ướt (tùy loại)
6 Nhiệt kế:
Các nhiệt kế chuẩn nên dùng loại chia độ đến 0,1oC, đo được từ 0oC-100oC
7 pH kế: Sử dụng máy đo pH để xác định pH của môi trường nuôi cấy hoặc các
Trang 148
CÂU HỎI
1 Hãy sắp xếp những dụng cụ sau đây, loại nào khử trùng nhiệt ướt, loại nào khử trùng nhiệt khô: bình tam giác, đủa thủy tinh, môi trường nuôi cấy, quả bóp cao su, nước cất, đầu col của micropipette ?
2 Làm thế nào để khử trùng phòng nuôi cấy vi sinh ?
3 Khi phân lập nấm thì sử dụng loại kim cấy nào để đạt hiệu quả cao?
4 Vai trò của dầu cèdre khi sử dụng vật kính nhúng dầu 100x ?
5 Cách lau vật kính nhúng dầu sau khi sử dụng?
6 Nếu là môi trường lỏng, thì phải khử trùng bằng thiết bị nào cho thích hợp? tại sao?
Trang 159
Chương 2
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC NGUỒN VI SINH VẬT
2.1 Mục đích - yêu cầu
- Giúp sinh viên nắm vững phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật
- Phân biệt một số môi trường cơ bản và mục đích sử dụng của các môi trường này
- Sinh viên biết cách nhận biết một số dạng khuẩn lạc
2.2 Vật liệu và thiết bị
1 Dụng cụ thủy tinh: mỗi nhóm sinh viên cần:
- 3 bình tam giác 250 ml, hoặc 3 chai thủy tinh có nắp
- 2 đủa thủy tinh
- Môi trường tryptone soya agar (TSA)
- Hoặc môi trường Nutrient agar (NA)
Trang 1610
2.3 Phương pháp
1 Chuẩn bị dụng cụ thủy tinh
- Dụng cụ bằng thủy tinh mới mua về cần phải ngâm với nước xà bông 24 giờ
và rửa sạch, nếu dụng cụ cũ thì chỉ cần rửa sạch và tráng lại bằng nước cất rồi làm khô, bao gói kín, kỷ càng để tránh nhiễm trùng trở lại sau khi đã khử trùng Chai lọ, ống nghiệm bằng thủy tinh phải sạch, được đậy bằng nút bông không thấm nước ; pipette thủy tinh được đút nút bằng một ít bông không thấm nước, sạch ở phía đầu dùng để hút
và được quấn kín lại bằng giấy Đĩa Petri được gói thành từng chồng 4-5 cái Các dụng
cụ khác bằng kim loại (dao mỗ, kẹp…) bằng gốm sứ (chày cối…) cũng phải được bao gói kín trước khi cho vào sấy tiệt trùng
- ống nghiệm phải có nắp đậy, nếu không có nút phải làm nút bằng bông gòn không thấm nước và có nắp giấy bên ngoài
2 Khử trùng: là một trong những biện pháp cần thiết và quan trọng nhất trong
thực nghiệm vi sinh vật học Nếu khử trùng không được thực hiện một cách triệt để sẽ làm sai lệch kết quả thí nghiệm, kết quả chẩn đoán… do bị lẫn tạp khuẩn có sẵn trong môi trường Các dụng cụ bằng thủy tinh, kim loại thường áp dụng phương pháp khử trùng bằng nhiệt độ khô Đối với môi trường dinh dưỡng người ta sử dụng phương pháp hấp ướt bằng nồi hấp tiệt trùng (autoclave)
a Khử trùng bằng tủ sấy: đây là phương pháp cơ bản được dùng để khử trùng
các dụng cụ thủy tinh, kim loại trong phòng thí nghiệm vi sinh vật
Nhiệt độ và thời gian tương ứng cho việc khử trùng dụng cụ bằng không khí nóng được qui định như sau:
- Khử trùng ở nhiệt độ 150oC thời gian sấy 2 giờ liên tục
- Khử trùng ở nhiệt độ 160oC thời gian sấy 1-1 giờ 30 phút liên tục
- Khử trùng ở nhiệt độ 170oC thời gian sấy 30 phút - 1giờ liên tục
Chú ý: thời gian sấy theo qui định chỉ được tính khi nhiệt kế của tủ sấy đạt đến nhiệt
độ tương ứng
Các dụng cụ đã khử trùng xong phải được bảo quản ở chỗ kín, tránh bụi bẫn
và chỉ được mở bao giấy ngay trước khi sử dụng chúng Thời gian bảo quản các dụng