thực hành hóa sinh đại cương

Mục tiêu: Sau khi làm thực hành xong, sinh viên: - Nhớ được những kiến thức lý thuyết về tính chất protein và enzyme - Thực hiện được những phản ứng định tính protein - Giải thích được c

PHÂN HIỆU ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA KHOA HỌC CƠ BẢN

THỰC HÀNH HÓA SINH ĐẠI CƯƠNG

(Thú y)

Lưu hành nội bộ - 2019

-Yêu cầu SV:

+ Trước khi đến phòng thực hành: ôn lại kiến thức liên quan (cả về hóa học), đọc trước bài thực hành.

+ Phải mang theo tài liệu thực hành (bản cứng: giấy), nếu không mang thì coi như vắng (do nhìn điện thoại mà làm thì sẽ làm giảm chất lượng bài thực hành, dễ bị sai do đọc không rõ…)

+ Đến đúng giờ (trễ 10’: trừ 1 điểm), cấm thi: 10% số tiết trở lên (tương đương 1 tiết trở lên) + Trong quá trình thí nghiệm: chăm chỉ, cẩn thận Làm xong, giải thích kết quả theo nhóm (80%/bài) (Vỡ dụng cụ: đền lại nhà trường, trừ 3 điểm), dọn dẹp phòng…trước khi ra về, để lại dụng cụ như cũ.

+ Làm báo cáo (20%/bài) (làm ở nhà, nộp lại vào đầu buổi học tiếp theo, tới giờ học mà chưa nộp thì trừ điểm, buổi cuối cùng sẽ nộp sau 5 ngày, không nộp rải rác (cô rất khó quản lý)

Bài 1: Định tính protein

I Mục tiêu: Sau khi làm thực hành xong, sinh viên:

- Nhớ được những kiến thức lý thuyết về tính chất protein và enzyme

- Thực hiện được những phản ứng định tính protein

- Giải thích được các hiện tượng xảy ra

- Phân tích được ứng dụng thực tế của các thí nghiệm

II Hóa chất, thiết bị, dụng cụ, nguyên liệu

1 Thiết bị, dụng cụ:

- Ống nghiệm: 50 cái

- Pipet: 5

2 Hóa chất:

-Ninhydrin 0,1%

-Cồn etylic 96%

-Aceton

-NaOH 10%,

-Tinh thể ure

-CuSO4

3 Nguyên liệu:

- Trứng gà: 2 quả

- Gan heo: 1 lạng

III Nội dung:

Người ta thường dùng các phản ứng màu để nhận biết bản chất của protein, nghiên cứu thành phần các acid amin trong phân tử protein

1 Phản ứng ninhydrin

a) Nguyên tắc:Dung dịch protein, peptide hoặc axit amin khi đun nóng sẽ tạo phức chất có màu xanh tím Các axit amin và các peptit khi phản ứng với ninhydrin sẽ bị dezamin hóa, oxy hóa và decacboxy hóa tạo NH3, CO2,

và aldehyt tương ứng ngắn đi 1 C so với axit amin ban đầu, ninhydrin dạng khử kết hợp trở lại với NH3 và 1 phân tử ninhydrin tạo sản phẩm ngưng kết có màu tím xanh

Phản ứng ninhydrin là phản ứng đặc trưng để phát hiện nhóm α-amin

b) Tiến hành

Lấy 2 ống nghiệm

Ống 1 (ống thí nghiệm):

- Cho vào ống nghiệm 1ml dd protein trứng,

- Thêm vào 1ml dd ninhydrin 0,1%,

- Đun sôi 1-2 phút

- Để nguội

- Quan sát sự thay đổi màu sắc, giải thích

Ống 2 (ống đối chứng):

Cho vào 1 ml nước cất (không cho protein trứng), làm tương tự như ống 1

2 Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ:

a) Nguyên tắc: Protein là chất keo ưa nước do trên bề mặt phân tử protein có các nhóm phân cực tích điện, có khả năng hấp thu các phân tử nước lưỡng cực tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein (vỏ hydrat) Dưới tác dụng của các yếu tố vật lý, hóa học làm trung hòa điện tích của các phân tử protein, phá vỡ màng nước dẫn đến protein bị kết tủa

b) Tiến hành: Lấy 2 ống nghiệm:

Ống 1: 5 giọt protein trứng + 20 giọt cồn etylic

Ống 2: 5 giọt protein trứng + 20 giọt aceton

Quan sát và so sánh mức độ kết tủa ở 2 ống

3 Định tính protein bằng Phản ứng Biure :

a) Nguyên tắc: Các protein có các acid amin hoặc các gốc R có khả năng phản ứng tạo màu đặc trưng

Phức của Cu với biure

Phức của Cu với chuỗi polypeptide b) Tiến hành:

Lấy 2 ống nghiệm:

- Ống 1: Đun nhẹ một ít tinh thể ure cho đến khi nóng chảy rồi bắt đầu đông cứng lại thì ngừng đun, để nguội rồi thêm vào 1ml NaOH 10%, lắc cho tan rồi thêm vào 2 giọt CuSO4 Quan sát màu và giải thích kết kết quả

Chú ý: Không cho nhiều CuSO4 vì màu xanh của CuSO4 sẽ lấn át màu của phản ứng

- Ống 2: 2 ml protein trứng + 1 ml NaOH 10% + 2 giọt CuSO4 Quan sát màu và giải thích, so sánh với ống 1

4 Định tính enzyme catalase:

a) Nguyên tắc: Dựa trên hiện tượng của phản ứng dưới sự xúc tác của enzyme catalase: có sủi bọt khí b) Tiến hành:

- Cân 1g gan heo, sau đó cho vào 5 giọt H2O2 10%

- Cân 1 g gan heo, luộc chín, để nguội, sau đó cho vào 5 giọt H2O2 10%

- Quan sát và giải thích hiện tượng ở 2 ống nghiệm Catalase có vai trò gì đối với cơ thể sống?

IV Nội dung bài báo cáo/vấn đáp

1 Giải thích các thí nghiệm về protein

- Protein là gì?

Protein là một đại phân tử sinh học (polyme) được cấu tạo bởi axit amin (amino axit), liên kết với

nhau bằng liên kết peptid

- Có những loại protein nào: có 2 loại protein

 Protein đơn giản: chỉ chứa axit amin: anbumin (máu, lòng trắng trứng, tế bào), globulin (máu – vận chuyển các chất, cấu tạo kháng thể  vai trò miễn dịch), histon (nhân – cấu tạo kháng thể)

 Protein phức tạp: ngoài axit amin còn có các nhóm ngoại

 Ví dụ: glycoprotein (màng sinh chất) có sacarit  nhận biết tế bào quen – lạ, vi khuẩn

 Ví dụ: casein có trong sữa

 Chromoprotein: chứa kim loại sắt, Hemoglobin

 Nucleoprotein: axit nucleic như nhiễm sắc thể chứa: protein histon và ADN

 Lipoprotein: LDL: tỉ trọng thấp (Low density), HDL: tỉ trọng cao (High Density), VLDL

- Protein có những vai trò gì đối với cơ thể sống?

+ Xúc tác phản ứng

+ Vận tải: Hemoglobin, anbmin (thuốc, ion, hocmon, axit béo)

+ Chuyển động, ví dụ: actin và myorin giúp co cơ

+ Bảo vệ: protein cấu tạo nên kháng thể, nhận biết, interferon  chất hoạt hóa tế bào bảo vệ khỏi vi sinh vật, vi khuẩn

+ Truyền xung thần kinh: Rhodopsin nhận ánh sáng chuyển hình ảnh nhận được thành xung thần kinh đến não, Rhodopsin = vitamin A và protein

+ Điều hòa các hoạt động của cơ thể (hocmon: protein cấu tạo nên hocmon: insullin, glucagon)

+ Chống đỡ cơ học: đàn hồi nhờ có collagen, elastin

+ Dự trữ, ví dụ: gan dự trữ protein, glicogen

+ Cấu tạo màng tế bào: màng bào quan: ti thể, Lizoxom, lạp thể, lưới nội chất, golgi

Viết sơ đồ quá trình chuyển hóa protein trong hệ tiêu hóa

- Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải protein trong tế bào là chất gì?

tạo acid amin đi vào tế bào thì tạo ra các cetoacid tham gia vào chu trình krebs tạo ra các

coenzyme khử (NADH2 và FADH2) rồi các chất đó tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử tạo ra ATP cung cấp cho quá trình sống của cơ thể

- Tại sao không được cho heo ăn quá nhiều protein?

Việc sử dụng sai protein trong khẩu phần ăn không chỉ làm giảm các amino acid có sẵn ở heo trong quá trình phát triển và trao đổi chất của heo mà còn dẫn đến rối loạn tiêu hoá ở đường ruột, sự gia tăng vi khuẩn gây bệnh và gây tổn thương biểu mô góp phần gây nên các bệnh đường ruột

2 Giải thích thí nghiệm enzyme

- Enzyme là gì?

+ Enzyme là chất xúc tác sinh học, phần lớn có bản chất protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học

+ Chất xúc tác sinh học là: Có nguồn gốc từ sinh vật, cấu tạo từ protein

Hoạt động ở nhiệt độ cơ thể (người 37 độ, gà 42 độ) Không bị biến đổi sau phản ứng

- Có những loại enzyme nào?

+ Lipase chịu trách nhiệm phân hủy chất béo thành axit béo và glycerol Lipase là một enzyme tiêu hóa

ở dạ dày và miệng với lượng nhỏ và lượng lớn hơn bởi tuyến tụy

+ Protease còn được gọi là peptidase, enzyme phân giải protein, các enzyme tiêu hóa này phân hủy protein thành các axit amin Ngoài ra, chúng đóng một vai trò trong nhiều quá trình của cơ thể, bao gồm phân chia tế bào, đông máu và chức năng miễn dịch Protease là một enzyme tiêu hóa ở dạ dày và tuyến tụy, gồm các dạng sau:

o Pepsin: Pepsin được tiết ra bởi dạ dày để phân hủy protein thành các peptit, hoặc các nhóm axit amin nhỏ hơn, rồi bị phân hủy sâu hơn trong ruột non

o Trypsin: Trypsin hình thành khi enzym do tuyến tụy tiết ra kết hợp với enzym trong ruột non Sau đó, trypsin kích hoạt các enzym tuyến tụy bổ sung như carboxypeptidase và chymotrypsin, để hỗ trợ việc phá vỡ các peptide

o Chymotrypsin: Enzyme chymotrypsin phá vỡ các peptide thành các axit amin tự do để chúng được hấp thụ bởi thành ruột

o Carboxypeptidase A: Carboxypeptidase được tuyến tụy tiết ra, nó phân tách các peptit thành các axit amin riêng lẻ

o Carboxypeptidase B: Được tuyến tụy tiết ra, nó phân hủy các axit amin cơ bản

+ Amylase có trong tuyến nước bọt và tuyến tụy cần thiết cho quá trình tiêu hóa carbohydrate, giúp phân hủy tinh bột thành glucose

+ Maltase được tiết ra bởi ruột non và có nhiệm vụ phân hủy maltose thành glucose để giải phóng năng lượng

+ Lactase là một loại enzyme phân hủy lactose, một loại đường có trong các sản phẩm từ sữa, thành đường đơn glucose và galactose Lactase được sản xuất bởi các tế bào ruột nằm trong đường ruột + Sucrase được tiết ra bởi ruột non, nơi phân hủy sucrose thành fructose và glucose, những loại đường đơn giản hơn mà cơ thể có thể hấp thụ Sucrase được tìm thấy dọc theo nhung mao ruột giúp lót ruột

và đưa các chất dinh dưỡng vào máu

Bài 2 Khảo sát lipid

I. Khảo sát tính hòa tan và nhũ hóa mỡ

1 Nguyên tắc: Lipid có tính chất không tan trong nước do có sức căng bề mặt cao, chỉ tan trong dung

môi hữu cơ như alcohol, acetone, benzene…Để làm giảm sức căng bề mặt lipid trong hỗn hợp lipid -nước, có thể dùng muối kiềm, xà phòng, mật, khi đó hỗn hợp sẽ có màu trắng đục như sữa, lipid ở dưới dạng những hạt nhỏ li ti (hạt micelle), hiện tượng này gọi là nhũ tương hóa

-Lipid không thể thiếu trong bữa ăn, 2 nguyên tố chính C,H,O ngoài ra còn có N,P,S là este của ancol và axit béo 1g lipid=9,3g calo Triglicerit là chủ yếu lớp mỡ dưới da dự trữ sử dụng được 1 tháng

1 Hóa chất, vật tư:

- Mỡ động vật

- Dung dịch xà phòng

- Mật heo (hoặc vịt hoặc gà hoặc cá) pha loãng

- Dung môi hữu cơ: alcohol, aceton

2 Nội dung

a) Quan sát sự hòa tan

Cho vào 2 ống nghiệm

- ống 1: 2ml alcohol Dầu ăn nằm dưới, cồn nằm trên Lúc lắc thi đục để hồi tách ra 2 lớp vì KLR < rượu

- ống 2: 2 ml acetone (dng môi không phân cực): tan tốt, cấu trúc aceton là mạch thẳng và vòng, gồm các hydrocabon

Sau đó cho vào mỗi ống 1 giọt mỡ, lắc nhẹ, quan sát sự hòa tan của lipid trong 2 loại dung môi

b) Quan sát sự nhũ hóa

Cho vào 4 ống nghiệm:

- ống 1: 1 ml nước cất KLR > dầu  dầu nổi trên, hạt lipid to Không tan vì lipit là chất không phân cực

- ống 2: 1 ml xà phòng

- ống 3: 1 ml sodium benzoate

- ống 4: 1 ml mật pha loãng Dầu ở trên, hạt lipid nhỏ, nhờ muối mật giảm sức căng bề mặt

Sau đó cho vào mỗi ống 1 giọt mỡ, lắc đều, quan sát hiện tượng, giải thích

II Khảo sát sắc tố mật

1 Nguyên tắc: Bilirubin và biliverdin là các sắc tố mật, tạo ra màu vàng xanh của mật Dưới tác dụng của

HNO3 đậm đặc hoặc iod, sắc tố mật bị oxy hóa tạo sản phẩm có màu đặc trưng

2 Hóa chất

- Mật pha loãng

- HNO3 đậm đặc

- Dung dịch iod 0,5 % trong alcohol

3 Nội dung

a)Phản ứng Gmelin

- Hút 2 ml mật pha loãng cho vào ống nghiệm lớn

- Đặt nghiêng ống nghiệm, lấy cẩn thận 1 ml HNO3 cho chảy từ từ dọc theo thành ống

- Quan sát sự thay đổi màu ở phần dưới ống nghiệm Ghi nhận kết quả.

b) Phản ứng Smith

- Hút 2 ml mật pha loãng cho vào ống nghiệm lớn

- Đặt nghiêng ống nghiệm, lấy cẩn thận 1 ml dung dịch iod cho chảy từ từ dọc theo thành ống

- Quan sát sự thay đổi màu ở trên bề mặt dung dịch Ghi nhận kết quả.

III Nhận biết lipase

Tụy là cơ quan chính sản sinh lipase Khi tụy bị tổn thương sẽ gây rối loạn tiêu hóa lipid Tuy nhiên nguyên nhân gây rối loạn tiêu hóa lipid thường gặp nhiều nhất là do các bệnh gan mật liên quan đến sự hoạt hóa lipase và nhũ tương hóa lipid Trong lâm sàng người ta làm xét nghiệm xác định hoạt động lipase trong mẫu dịch ruột để chẩn đoán các bệnh đường tiêu hóa

1.Nguyên tắc

- Trong điều kiện tối thích (môi trường kiềm, lipid được nhũ tương hóa), lipase xúc tác thủy phân tryacyl glycerol trong sữa tạo glycerol và acid béo Sự có mặt của acid béo giải phóng làm thay đổi pH của môi trường, có thể nhận biết được nhờ chỉ thị phenolphtalein

2.Dụng cụ và hóa chất

- Ống nghiệm

- Pipet Pasteur

- Máy điều nhiệt

- Sữa

- Dịch chiết tụy

- Dung dịch Na2CO3 1%

- Phenolphtalein 1%

3.Tiến hành

- Thu dịch chiết tụy: cân 3 g tụy heo, băm nhuyễn, cho thêm 10 ml nước cất, đem ly tâm 5000 vòng/10 phút

- Cho lần lượt vào 2 ống nghiệm (do bản chất mẫu nên có thể cho tăng phenolphthalein)

Hoá chất

Ống nghiệm

Báo cáo:

- Giải thích hiện tượng, viết phương trình phản ứng

- Lipid là gì? Phân loại lipid

 Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống (lipit là một este), được cấu tạo từ alcol và axit béo

ROH + R’COOH  RCOOR’ + H2O

 phân loại

Lipit đơn giản: được cấu tạo từ rượu và axit béo, 3 loại:

+ Triglycerit: glycerol và 3 axit béo (mô mỡ)

+ Sáp (cerid) lông cừu (chống thấm nước) cấu tạo bởi rượu M lớn  axit béo bậc cao

+ steroid: rượu vòng (cholesterol) + aixt béo M lớn (vai trò cấu tạo nên hocmon)

Lipit phức tạp: rượu, axit béo, nhóm ngoại + glycolipid(đường, axit béo, ancol)

+ glicerophospholipid: glicerol + axit béo H3PO4 (+ aminancol)

VD: phospholipid trên màng tế bào

+ gliceroglycolipid: glicerol + aixt béo + sacarit (thường galactose)

+ sphingophospholipid: shigosin + axit béo + H3PO4

VD: Sphingomyelin cấu tạo tế bào thần kinh có bao

+ Sphingoglycolipid: shingosine + axit béo +sacarit (galactose)

VD: cerebroside cấu tạo nên tế bào não (galactose + sphingosine + axit lignoseric)

- Vai trò lipid (cấu tạo mô mỡ, màng sinh chất, bào quan; nguồn năng lượng; ổn định nhiệt độ cơ thể tạo nhiệt; bảo vệ về mặt cơ học; dự trữ năng lượng, nước; hấp thụ vitamin A,D,E,K)

+ Là thành phần cấu tạo quan trọng của các màng sinh học

+ Là nguồn nhiên liệu dự trữ quan trọng cung cấp năng lượng cho cơ thể

+ Tạo nhiệt cho cơ thể đối với động vật máu nóng

+ Bảo vệ các nội quan của động vật khỏi tác dụng của các chấn động mạnh

+ Lớp mỡ dưới da có tác dụng cách nhiệt

+ Bảo đảm sự vận chuyển, hấp thu các chất hòa tan trong chất béo như vitamin A,D,E,K

+ Dự trữ ở hạt của hầu hết thực vật

- Thành phần của dịch mật, vai trò của dịch mật

- Thành phần tác dụng của dịch mật là muối mật (chiếm 50% thành phần) và có thêm cholesterol, lecithin, bilirubin cũng như các chất điện giải, cụ thể:

+ Cholesterol: Là nguyên liệu chính để sản xuất ra muối mật Cholesterol có đặc tính không tan trong nước nhưng được nhũ hóa bởi lecithin và muối mật để ngăn cản sự kết tủa của nó Lượng cholesterol

có trong mật sẽ phụ thuộc vào lượng lipid tiêu thụ vào hàng ngày Do đó, nếu ta ăn nhiều lipid trong một thời gian dài thì có thể dẫn tới sỏi mật

+ Muối mật: Là thành phần quan trọng của mật có tác dụng tiêu hóa thức ăn và hấp thu các sản phẩm tiêu hóa của lipid là acid béo, cholesterol, monoglyceride và các lipid ở ruột non Muối mật đóng vai trò quan trọng cho việc hấp thu và vận chuyển các vitamin tan trong dầu như A, D, E và K Mỗi ngày gan bài tiết khoảng 0,5g muối mật Muối mật không bị mất đi và thường được tái hấp thu sau khi đã

sử dụng 80-90% sẽ theo máu chuyển về gan và kích thích gan sản sinh thêm mật

+ Sắc tố mật: Được gan sản xuất từ protein hemoglobin trong quá trình tiêu hủy hồng cầu ở gan Chất Stercobilin có trong sắc tố mật sẽ nhuộm vàng những chất, dịch chứa nó Điều này lý giải vì sao phân bình thường có màu vàng Khi sắc tố mật bị ứ lại, không xuống được ruột do tắc mật, xơ gan hay bệnh

lý nào khác thì sẽ khiến phân mất màu vàng

- Dịch mật có vai trò chính là hỗ trợ vào quá trình tiêu hóa của cơ thể Cụ thể:

+ Kích thích quá trình sản sinh các men tiêu hóa trong dịch tụy và dịch ruột, đồng thời hoạt hóa các men này

+ Giúp kích thích nhu động ruột từ đó tạo môi trường kiềm trong ruột, ngăn ngừa sự tấn công của các loại vi khuẩn lên phần trên của ruột non

Khi thực hiện hoạt động ăn uống, dịch mật sẽ được đẩy xuống tá tràng để làm nhiệm vụ tiêu hóa thức ăn Nếu không có dịch mật đồng nghĩa với việc chất béo không được tiêu hóa, khiến cơ thể không thể hấp thu chất béo cũng như các vitamin tan trong dầu A, D, E và K

Ngoài chức năng hỗ trợ quá trình tiêu hóa như trên, dịch mật còn hỗ trợ loại bỏ bớt các sản phẩm thoái hóa trong hồng cầu, hình thành nên màu sắc của mật

- Tụy có những vai trò gì đối với động vật

- Viết sơ đồ quá trình phân giải lipid ở hệ tiêu hóa