BÁO cáo THỰC HÀNH VI SINH đại CƯƠNG autosaved

NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG GIỚI THIỆU CHUNG 1. Giáo trình phục vụ môn học: SV có thể sử dụng bất kì giáo trình nào về thực hành Vi sinh đại cương. 2. Nội dung học: Các thiết bị trong phòng thí nghiệm Vi sinh, chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, phương pháp khử trùng. Phân lập, cấy chuyền VSV. Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV. Đếm tế bào men bằng Buồng đếm hồng cầu. Khảo sát 1 số phản ứng sinh hóa của vi khuẩn. 3. Yêu cầu của GV với SV: Yêu cầu kiến thức: chuẩn bị bài trước khi đến phòng thí nghiệm. GV sẽ kiểm tra bài, nếu bất kì SV nào trong nhóm không chuẩn bị bài, cả nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và không được dạy và học lại. Sau khi kết thúc môn học, SV có 510 ngày để viết báo cáo. Nộp bài cho 1 bạn (có chỉ định) trong nhóm. Bài báo cáo có ghi rõ họ, tên, nhóm, tổ. Bài báo cáo SV có thể đánh máy hoặc viết tay. Yêu cầu kĩ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu cầu khi thực hiện thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV). Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định trong PTN và các yêu cầu của GV. Tham gia tích cực trả lời câu hỏi của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học. BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG. PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị trong phòng thí nghiệm: Thiết bị Mục đích Cân Cân hóa chất, cân môi trường Bếp khuấy từ Khuấy trộn, hòa tan, gia nhiệt các loại môi trường Máy đồng nhất mẫu Phân tán vi sinh vật vào mẫu đồng nhất Nồi hấp tiệt trùng Tiệt trùng môi trường, dụng cụ bằng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ cao, áp suất cao Tủ sấy Sấy khô các dụng cụ bằng thủy tinh Kính hiển vi Quan sát tế bào VSV Tủ lạnh Bảo quản mẫu, vi sinh vật, môi trường Tủ ủ Ủ, nuôi cấy VSV ở nhiệt độ mong muốn 1.2 Môi trường nuôi cấy VSV: 1.2.1 Khái niệm: Môi trường nuôi cấy VSV là môi trường chứa các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của VSV. 1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV: “đủ chất và đủ lượng”  Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết.  Có độ pH thích hợp.  Có độ nhớt nhất định.  Không chứa các yếu tố độc hại.  Tuyệt đối vô trùng. 1.2.3 Phân loại: 1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng: Môi trường tăng sinh Môi trường chọn lọc Môi trường phân biệt Môi trương chọn lọc – phân biệt 1.2.3.2 Phân loại môi trường theo thành phần hóa học: Môi trường tự nhiên Gồm các hợp chất tự nhiên, chưa xác định rõ thành phần Môi trường tổng hợp Môi trường đã biết thành phần hóa học Môi trường bán tổng hợp Trong môi trường này đã có chứa một số hợp chất từ nguồn gốc tự nhiên và một số chất hóa học đã biết roc thành phần hóa học 1.2.3.3 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lí: Trạng thái vật lý Hàm lượng Agarlit Công dụng của môi trường Môi trường lỏng 0glit Nhân giống Môi trường rắn 1520glit Phân lập, cấy truyền Môi trường bán lỏng (thạch mềm) 45glit Kiểm tra khả năng di động 1.2.4 Công thức môi trường: Các thông tin có trong công thức môi trường:  Tên môi trường: Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD Agar)  Mục đích: nuôi cấy Salmonella  Thành phần và số lượng: + Yeast extract: 3gm + LLysine: 5gm + Lactose: 7.5gm + Sucrose: 7.5gm + Xylose: 3.5gm + Sodium chloride: 5gm + Sodium deoxycholate: 2.5gm + Sodium thiosulfate: 6.8gm + Phenol red: 0.08gm + Agar: 15gm  pH: 7,4 ± 0,2  Chế độ khử trùng: 121ᵒC 15’ 0,1 Mpa 1.2.5 Các bước để nấu môi trường: B1: Cân đong hóa chất theo công thức B2: Đun nếu cần B3: Kiểm tra pH B4: Phân phối môi trường vào dụng cụ thủy tinh B4: Khử trùng 1.3 Phương pháp khử trùng: 1.3.1 Khử trùng môi trường: Phương pháp Nhiệt độthời gian Nguyên lý khả năng diệt VSV Tiệt trùng bằng nồi hấp 121ᵒC 15’ 0,1 Mpa Dùng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ cao, áp suất 0,1 Mpa để tiêu diệt bào tử và tế bào sinh dưỡng của VSV Thanh trùng Pastuer 80100ᵒC 1530’ Đun cách thủy để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng của VSV Tiệt trùng Tyldan 80100ᵒC 15’ trong 3 ngày liên tiếp Tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và bào tử 1.3.2 Khử trùng dụng cụ:  Dụng cụ thủy tinh: + Nồi hấp tiệt trùng (phương pháp nhiệt ẩm) + Tủ sấy (phương pháp nhiệt khô): 180ᵒC 30’ hoặc 160ᵒC 2h  Dụng cụ nhựa: nồi hấp tiệt trùng  Khử trùng PTN: tia tử ngoại, đèn UV BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV 2.1 Phân lập: 2.1.1 Khái niệm: Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể ban đầu và đưa về dạng khuẩn lạc. 2.1.2 Mục đích phân lập Để nghiên cứu các đặc điểm về hình thái, tính chất sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật Tạo ra được dòng thuần 2.1.3 Phương pháp phân lập: VSV Que cấy Phương Pháp Men,VK Que cấy vòng 2.2 Phương pháp cấy chuyền 2.2.1 Khái niệm: Cấy chuyền là truyền vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác 2.2.2 Mục đích: Giúp bảo quản, nhân giống và sinh hóa Bảo tồn vi sinh vật thuần khiết 2.2.3 Phương pháp cấy chuyền: VSV Môi trường Que cấy Phương pháp Men, vi khuẩn Lỏng Que cấy vòng B1: Viết tên VSV B2:Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. B2: Lấy mẫu VSV. B3: Mở ống đã được chuẩn bị để cấy VSV đưa que cấy vào phần dịch lỏng rồi rút ra. Thạch nghiêng Thao tác giống môi trường lỏng chỉ khác ở chỗ que cấy chứa VSV được đưa vào cuối phần thạch nghiêng và cấy zíc zắc lên Thạch nghiêng sâu Que cấy thẳng Thao tác giống môi trường lỏng chỉ khác ở chỗ dùng que cấy thẳng đút sâu vào và kéo dần lên theo đường zíc zắc Thạch đứng Giống thạch nghiêng sâu 2.3 Kết quả thực hành: Hình ảnh kết quả phương pháp cấy chuyền Mặt trước Mặt sau Hình ảnh nấm men được phân lập trên đĩa petri trong môi trường Sab BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 3.1 Quan sát đại thể: Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi… Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên môi trường phân lập chọn lọc giúp dự đoán được đó là VSV nào. Sinh viên mô tả khuẩn lạc cuả VSV mình đã phân lập ở Bài 2: Khuẩn lạc của S.C(nấm men) trên môi trường PDA Hình dạng: tròn Đường kính: 1mm Bờ, mép khuẩn lạc: nhẵn, tròn Màu sắc: trắng đục 3.2 Quan sát vi thể Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi để thấy được:  Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc: + Đặc điểm của sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn + Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản. + Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử.  Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men: + Hình thái, kích thước tế bào nấm men. + Sự nảy chồi của nấm men. + Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử.  Quan sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn: + Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn. + Xác định vi khuẩn thuộc nhóm Gram+ hoặc Gram. 3.2.1 Làm tiêu bản nấm mốc (phương pháp giọt ép) 3.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn: B1: Ghi tên VSV. Làm vết bôi. B2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đền cồn đến khi vết bôi khô. B3: Nhuộm màu (sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant Violet, Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton…). Nhỏ thuốc vào vết bôi đã cố định, để 1 phút, rửa nước. B4: Quan sát tiêu bản dưới KHV. Khi thực hiện thao tác, sử dụng thuốc nhuộm màu gì thì tế bào sẽ bắt màu đó. Phương pháp nhuộm đơn thường áp dụng cho nấm men. Khi sử dụng phương pháp này để nhuộm màu vi khuẩn thì lúc quan sát KHV sẽ chỉ thấy được: Hình dạng, kích thước, màu sắc và cách sắp xếp của tế bào VSV. 3.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép: B1: Ghi tên VSV. Làm vết bôi B2: Cố định vết bôi: Hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bôi khô. Mục đích: + Giết chết VSV + Gắn chặt VSV trên lame + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Giúp VSV không bị trôi khi rửa nước B3: Nhuộm màu:  Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet. Để 1 phút. Rửa nước.  Nhỏ Lugol. Để 1 phút. Rửa nước. Tẩy cồn. Rửa nước.  Nhỏ thuốc nhuộm Safranin. Để 30 giây. Rửa nước. B4: Quan sát KHV vật kính 100. Vẽ hình quan sát được: Bài tập ở nhà: 1. So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép. SV trả lời theo gợi ý trong bảng 1. Bảng 1. So sánh pp nhuộm đơn, nhuộm kép Nhuộm đơn Nhuộm kép Giống Cố định vết bôi rồi nhuộm và để quan sát dưới kính hiển vi Khác nhau Quy trình sản xuất Nhuộm màu 1 lần ( sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm: Fuschin, xanh metylen, xanh coton, Gentiant violet) Nhuộm màu 2 lần, đầu tiên nhỏ thuốc nhuộm Gentiant violet (Crystal violet), sau đó nhỏ Lugol, nhuộm thêm 1 lần nữa bằng thuốc nhuộm Fuschin ( hoặc Safranin). Mục đích Giúp phân biệt 2 nhóm VK (gram – và gram +) Giúp quan sát và phân biệt cấu trúc tế bào dễ dàng hơn so với việc nhuộm đơn. 2. Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát kính hiển vi ở vật kính 100? Phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát KHV ở vật kính 100 vì:  Dầu soi là một trong những phụ kiện KHV không thể thiếu khi sử dụng với chức năng dùng để quan sát các vật mẫu có kích thước siêu hiển vi mà độ phóng đại của kính không thể làm rõ vật mẫu. Đặc điểm của Dầu soi KHV là dầu trong suốt, có chỉ số khúc xạ cao.  Ở vật kính 100, vật kính cần phải sử dụng kết hợp với dầu soi kính hiển vi, loại vật kính này được gọi là vật kính ngâm dầu. Dầu soi hỗ trợ làm tăng độ phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh khi quan sát rõ nét hơn. Sử dụng dầu soi vào trực tiếp mẫu vật cần quan sát sau đó dùng vật kính ngâm dầu để quan sát có độ phóng đại và chất lượng hình ảnh tốt nhất. 3. Giải thích cơ chế bắt màu tím của VK gram (+) và bắt màu hồng của VK gram() Vi khuẩn Gram + có lớp Peptidoglycan dày, nhiều Acid teichoic, chúng không bị ảnh hưởng bới sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được màu tím ban đầu. Vi khuẩn Gram có lớp Peptidoglycan mỏng gắn với màng Phospholipid kép, xen kẽ với protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể GentiantIod không bền, bị tẩy màu và màu bị thay bởi thuốc nhuộm bổ sung.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC HÀNH

VI SINH ĐẠI CƯƠNG

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Hiền SVTH: Nguyễn Thị Nga

MSSV: 19125195 Lớp: DH19DD Nhóm: 12

NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

GIỚI THIỆU CHUNG

- Phân lập, cấy chuyền VSV

- Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV

- Đếm tế bào men bằng Buồng đếm hồng cầu

- Khảo sát 1 số phản ứng sinh hóa của vi khuẩn

3 Yêu cầu của GV với SV:

- Yêu cầu kiến thức: chuẩn bị bài trước khi đến phòng thí nghiệm GV

sẽ kiểm tra bài, nếu bất kì SV nào trong nhóm không chuẩn bị bài, cả nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và không được dạy và học lại

- Sau khi kết thúc môn học, SV có 5-10 ngày để viết báo cáo Nộp bài cho 1 bạn (có chỉ định) trong nhóm Bài báo cáo có ghi rõ họ, tên, nhóm, tổ Bài báo cáo SV có thể đánh máy hoặc viết tay

- Yêu cầu kĩ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu cầu khi thực hiện thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV)

- Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định trong PTN và các yêu cầu của GV Tham gia tích cực trả lời câu hỏi của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học

BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị trong phòng thí nghiệm:

Thiết bị Mục đích

Bếp khuấy từ Khuấy trộn, hòa tan, gia nhiệt các loại môi trường

Máy đồng nhất mẫu Phân tán vi sinh vật vào mẫu đồng nhất

Nồi hấp tiệt trùng Tiệt trùng môi trường, dụng cụ bằng hơi nước bão hòa

ở nhiệt độ cao, áp suất cao

Tủ sấy Sấy khô các dụng cụ bằng thủy tinh

Kính hiển vi Quan sát tế bào VSV

Tủ lạnh Bảo quản mẫu, vi sinh vật, môi trường

1.2 Môi trường nuôi cấy VSV:

 Không chứa các yếu tố độc hại

 Tuyệt đối vô trùng

1.2.3 Phân loại:

1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng:

- Môi trường tăng sinh

- Môi trường chọn lọc

- Môi trường phân biệt

- Môi trương chọn lọc – phân biệt

1.2.3.2 Phân loại môi trường theo thành phần hóa học:

Môi trường tự nhiên Gồm các hợp chất tự nhiên, chưa xác định rõ thành

phầnMôi trường tổng hợp Môi trường đã biết thành phần hóa học

Môi trường bán tổng

hợp

Trong môi trường này đã có chứa một số hợp chất từ nguồn gốc tự nhiên và một số chất hóa học đã biết roc thành phần hóa học

1.2.3.3 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lí:

Trạng thái vật lý Hàm lượng Agar/lit Công dụng của môi trường

Môi trường rắn 15-20g/lit Phân lập, cấy truyền

Môi trường bán lỏng

(thạch mềm)

4-5g/lit Kiểm tra khả năng di động

1.2.4 Công thức môi trường:

Các thông tin có trong công thức môi trường:

 Tên môi trường: Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD Agar)

 Mục đích: nuôi cấy Salmonella

1.2.5 Các bước để nấu môi trường:

B1: Cân đong hóa chất theo công thức

121ᵒC / 15’ / 0,1 Mpa Dùng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ

cao, áp suất 0,1 Mpa để tiêu diệt bào

tử và tế bào sinh dưỡng của VSVThanh trùng

Pastuer

80-100ᵒC / 15-30’ Đun cách thủy để tiêu diệt tế bào sinh

dưỡng của VSVTiệt trùng

Tyldan

80-100ᵒC / 15’ trong

3 ngày liên tiếp

Tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và bào tử

1.3.2 Khử trùng dụng cụ:

 Dụng cụ thủy tinh:

+ Nồi hấp tiệt trùng (phương pháp nhiệt ẩm)

+ Tủ sấy (phương pháp nhiệt khô): 180ᵒC / 30’ hoặc 160ᵒC / 2h

 Dụng cụ nhựa: nồi hấp tiệt trùng

 Khử trùng PTN: tia tử ngoại, đèn UV

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV

- Giúp bảo quản, nhân giống và sinh hóa

- Bảo tồn vi sinh vật thuần khiết

2.2.3 Phương pháp cấy chuyền:

VSV Môi trường Que cấy Phương pháp

B1: Viết tên VSVB2:Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèncồn

B2: Lấy mẫu VSV

B3: Mở ống đã được chuẩn bị để cấy VSV đưa que cấy vào phần dịch lỏng rồi rút ra

Thạch nghiêng

Thao tác giống môi trường lỏng chỉ khác ở chỗ que cấy chứa VSV được đưavào cuối phần thạch nghiêng và cấy zíc zắc lên

Thạch nghiêng sâu Que cấy

thẳng

Thao tác giống môi trường lỏng chỉ khác ở chỗ dùng que cấy thẳng đút sâu vào và kéo dần lên theo đường zíc zắc

2.3 Kết quả thực hành:

Hình nh k t qu ph ảnh kết quả phương pháp cấy chuyền ết quả phương pháp cấy chuyền ảnh kết quả phương pháp cấy chuyền ương pháp cấy chuyền ng pháp c y chuy n ấy chuyền ền

Mặt trước

Mặt sau

Hình ảnh nấm men được phân lập trên đĩa petri trong môi trường Sab

BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 3.1 Quan sát đại thể:

Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi…

Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên môi trường phân lập chọn lọc giúp dự đoán được đó là VSV nào

Sinh viên mô tả khuẩn lạc cuả VSV mình đã phân lập ở Bài 2:

Khuẩn lạc của S.C(nấm men) trên môi trường PDA

Hình dạng: tròn

Đường kính: 1mm

Bờ, mép khuẩn lạc: nhẵn, trònMàu sắc: trắng đục

3.2 Quan sát vi thể

Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi để thấy được:

 Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc:

+ Đặc điểm của sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn+ Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của

cơ quan sinh sản

+ Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử

 Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men:

+ Hình thái, kích thước tế bào nấm men

+ Sự nảy chồi của nấm men

+ Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử

 Quan sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn:

+ Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn

+ Xác định vi khuẩn thuộc nhóm Gram+ hoặc Gram-

3.2.1 Làm tiêu bản nấm mốc (phương pháp giọt ép)

3.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn:

B1: Ghi tên VSV Làm vết bôi.

B2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đền cồn đến khi vết bôi khô.

B3: Nhuộm màu (sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant Violet,

Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton…) Nhỏ thuốc vào vết bôi đã cố định,

để 1 phút, rửa nước

B4: Quan sát tiêu bản dưới KHV Khi thực hiện thao tác, sử dụng thuốc

nhuộm màu gì thì tế bào sẽ bắt màu đó

Phương pháp nhuộm đơn thường áp dụng cho nấm men Khi sử dụng phương pháp này để nhuộm màu vi khuẩn thì lúc quan sát KHV sẽ chỉ thấy được: Hình dạng, kích thước, màu sắc và cách sắp xếp của tế bào VSV

3.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép:

B1: Ghi tên VSV Làm vết bôi

B2: Cố định vết bôi: Hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bôi khô.

B3: Nhuộm màu:

 Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet Để 1 phút Rửa nước

 Nhỏ Lugol Để 1 phút Rửa nước Tẩy cồn Rửa nước

 Nhỏ thuốc nhuộm Safranin Để 30 giây Rửa nước

B4: Quan sát KHV vật kính 100 Vẽ hình quan sát được:

Bài tập ở nhà:

1 So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép SV trả lời theo gợi ý trong bảng 1

Bảng 1 So sánh pp nhuộm đơn, nhuộm kép

Nhuộm đơn Nhuộm kép Giống Cố định vết bôi rồi nhuộm và để quan sát dưới

kính hiển vi

Khác

nhau

Quy trình sản xuất

Nhuộm màu 1 lần ( sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm: Fuschin, xanh metylen, xanh coton, Gentiant violet)

Nhuộm màu 2 lần, đầu tiên nhỏ thuốc nhuộm Gentiant violet (Crystal violet), sau đó nhỏ Lugol, nhuộm thêm 1 lần nữa bằng thuốc nhuộm Fuschin ( hoặc Safranin)

Mục đích Giúp phân biệt 2 nhóm

VK (gram – và gram +)

Giúp quan sát và phân biệt cấu trúc tế bào dễ dàng hơn so với việc nhuộm đơn

2 Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát kính hiển vi ở vật kính 100?

Phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát KHV ở vật kính 100 vì:

 Dầu soi là một trong những phụ kiện KHV không thể thiếu khi sử dụng với chức năng dùng để quan sát các vật mẫu có kích thước siêu hiển vi mà độ phóng đại của kính không thể làm rõ vật mẫu Đặc điểm của Dầu soi KHV

là dầu trong suốt, có chỉ số khúc xạ cao

 Ở vật kính 100, vật kính cần phải sử dụng kết hợp với dầu soi kính hiển vi, loại vật kính này được gọi là vật kính ngâm dầu Dầu soi hỗ trợ làm tăng độphân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh khi quan sát rõ nét hơn Sử dụng dầu soi vào trực tiếp mẫu vật cần quan sát sau đó dùng vật kính ngâm dầu để quan sát có độ phóng đại và chất lượng hình ảnh tốt nhất

3 Giải thích cơ chế bắt màu tím của VK gram (+) và bắt màu hồng của

VK gram(-)

- Vi khuẩn Gram + có lớp Peptidoglycan dày, nhiều Acid teichoic, chúng không bị ảnh hưởng bới sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được màu tím ban đầu

- Vi khuẩn Gram- có lớp Peptidoglycan mỏng gắn với màng Phospholipid kép, xen kẽ với protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể Gentiant-Iod không bền, bị tẩy màu và màu bịthay bởi thuốc nhuộm bổ sung

BÀI 4: ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu (BĐHC):

BĐHC là phiến kính thủy tinh hình chữ nhật, trên đó có khắc lưới đếm

Lưới đếm là một hình vuông, có cạnh 1mm, gồm 25 ô vuông lớn, 1 ô vuông lớn có

16 ô vuông nhỏ; các ô vuông lớn chia cắt nhau bởi 3 đường kẻ song song, chiều cao đường khắc trên lưới đếm là 0,1mm

Hình 2: Lưới đếm

Hình 3: Lưới đếm quan sát ở vật kính 10 dưới KHV

Từ vật kính 10, SV chuyển qua vật kính 40 để thấy được hình ảnh 1 ô vuông lớn

SV quan sát và tìm đúng 4 ô vuông lớn ngoài cùng ở 4 góc

Hình 4: 4 ô vuông l n 4 góc c a lớn ở 4 góc của lưới đếm ở vật kính 40 ở 4 góc của lưới đếm ở vật kính 40 ủa lưới đếm ở vật kính 40 ướn ở 4 góc của lưới đếm ở vật kính 40 ếm ở vật kính 40 ở 4 góc của lưới đếm ở vật kính 40 ật kính 40i đ m v t kính 40

4.2 Quy trình đếm nấm men

Bước 1 Pha loãng dịch mẫu

Hình 5: Quy trình pha loãng mẫu Bước 2 Đưa dịch mẫu vào lưới đếm

Bước 3 Đếm tế bào nấm men

Quan sát lưới đếm ở vật kính 10, chuyển qua vật kính 40 để đếm các tế bào trong

5 ô vuông lớn theo vị trí đường chéo góc Ghi lại kết quả

Cách đếm: Đếm tất cả tế bào trong ô vuông lớn và tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp(hình 6)

Hình 6: Cách đếm tế bào trong ô vuông lớn 4.3Tính kết quả:

A: Tổng số tế bào đếm được ở 5 ô vuông

lớn

10-n: nồng độ pha loãng được đếm

V: thể tích ô vuông nhỏ1000: hệ số chuyển mm3 thành mL

Theo kết quả quan sát: A= 272

+ Không phân biệt được số tế bào sống và tế bào chết

+ Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu

+ Sai số cao

4.5Ứng dụng của đếm trực tiếp nấm men trên Buồng dếm hồng cầu:

Dùng để đếm tế bào hồng cầu trong máu, nấm men và vẽ đường cong sinh trưởng

BÀI 5: KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VSV 5.1 Mục đích

- Góp phần định danh VK (Gram -)

- Khảo sát tính chất sinh lý của vi khuẩn

5.2 Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hóa

Yêu cầu về VSV:

- VSV phải ở pha phát triển, còn non

- VSV phải thuần khiếtYêu cầu thời gian đọc kết quả: sau 24 – 48 giờ nuôi cấy

Cấy VSV vào môi trường SCA

Ủ 24-48h, nhiệt độ 37ᵒCĐọc kết quả

VSV sử dụng Citrate sinh ra CO2 làm kiềm hóa môi trường

VSV sử dụng nguồn đạm duy nhất là Amonium

để tạo ra NH3 làmkiềm hóa môi trường

NH4+ → NH3+

Dương tính: màu xanh da trời

Âm tính: màu xanh

lá hoặc màu vàngnhạt

+ Bromothymol Blue:

0,08g+ Agar: 13gKligler

 Tên môi trường:

Kligler Iron Agar

+ Agar: 13g+ Phenol red: 0,025g

Cấy VSV vào môi trường KIA

Ủ 24-48h, nhiệt độ 37ᵒC

Đọc kết quả

VSV sử dụng Glucose trước và tạo ra Acid (pH<7) môi trường có màu vàng, khi Glucose hết:

Nếu không sử dụng được Lactose thì Acid yếu chuyển thành muối kiềm(pH>7), môi trường có màu

đỏ một phần ở trên, H2S tác dụng với Fe tạo kết tủa đen ở bề mặt

Nếu sử dụng Lactose thì Lactose lên men tạo Acid (pH<7),

Màu đen:

có khí

H2SNứt thạch: sinh khí

H2/CO2

Vàng / vàng: lên men glucose

và lactose

Đỏ / vàng: lên men glucose

môi trường có màu vàng.

Không sử dụng Lactose và Glucose, môi trường có màu đỏ

Ủ 24-48h, nhiệt độ 37ᵒC

Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s

Đọc kết quả

Tryptophan được

vi khuẩn sử dụng nhờ enzyme tryptophan để tạo thành indol

Indol + thuốc thử Kovac’s → màu đỏ

Dương tính: có vòng trong màu đỏ

Âm tính: màu vàng(màu thuốc thử)