Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương

Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương cung cấp cho người học những kiến thức như: Quan sát hình thái vi sinh vật; Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật. Mời các bạn cùng tham khảo!

Thực hành

Vi sinh vật đại cương

Bài 1: Quan sát hình thái vi sinh vật

1 Giới thiệu kính hiển vi quang học

2 Phương pháp làm tiêu bản nhuộm

3 Phương pháp nhuộm màu Gram

4 Quan sát tiêu bản nhuộm

Mục đích

• Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang

học Nắm được cách sử dụng

• Học cách làm tiêu bản cố định và phương

pháp nhuộm Gram

• Quan sát một số hình thái cơ bản của vi

khuẩn, nấm men, nấm mốc

I Sử dụng kính hiển vi quang học

(light microscope )

1.1 Cấu tạo kính hiển vi quang học

a Phần cơ học

• Thân kính: dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để

đưa ảnh của vật quan sát vào đúng tiêu điểm

- Bàn xoay (mâm kính): gắn ở phía trên thân kính, nơi gắn các vật

kính

- Ống kính: Gắn ở phía trên thân kính, có thể xoay quanh một trục

thẳng đứng tùy theo vị trí quan sát Phía trên ống kính có gắn thị

kính

- Bàn kính/khay kính: nơi để tiêu bản quan sát Trên bàn kính có

các kẹp giữ tiêu bản Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang kính

- Đế kính (chân kính): cấu tạo vững chắc đỡ toàn bộ KHV

- Ốc điều chỉnh: gồm

+ Ốc điều chỉnh tiêu bản;

+ Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn);

+ Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ)

b Phần quang học

 Bộ phận chiếu sáng:

Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại với nhau hội tụ các tia sáng xuất phát

từ nguồn svà tụ quang kính nền đen áng và được phản xạ lại qua gương

Có 2 loại tụ quang kính: Tụ quang kính nền sáng và tụ quang kính nền đen

Tụ quang kính nền sáng Tụ quang kính nền đen

c Vật kính

- gồm một hệ thống thấu kính hội

tụcó tiêu cự ngắn khoảng vài

mm, đặt trong một vỏ bọc kim

loại

- Chức năng: Tạo ảnh thực, phóng

đại, ngược chiều với vật quan

sát

- Độ phóng đại của vật nghiên cứu

phụ thuộc vào tiêu cự và độ

cong của thấu kính ngoài cùng

Độ cong càng lớn, thì tiêu cự

càng ngắn độ phóng đại của

vật kính càng lớn

- Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x

(vật kính khô), 100x (vật kính

dầu)

c Thị kính

- Gồm 2 thấu kính: thấu kính mắt phía trên, thấu kính tụ phía dưới Giữa hai thấu kính có màn chắn giữ lại các tia sáng xung quanh, chỉ

để các tia sáng gần với trục quang đi qua  hình rõ nét hơn (phóng đại thêm ảnh của vật kính-vai trò giống kính lúp)

- Các loại thị kính: 7x, 10x, 15x, 20x

Độ phóng đại của mẫu quan sát bằng tích số giữa

độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính

1.2 Giới thiệu một số loại kính hiển vi khác

a Kính hiển vi điện tử

- KHV điện tử truyền qua (Transmission electron

microscope – TEM): sử dụng chùm điện tử có năng

lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng

các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (1.106

lần) Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên

film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ

thuật số

- KHV điện tử quét (Scanning electron microscope –

SEM): là một loại kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng

khác với TEM: chùm điện tử không truyền qua mẫu mà

hội tụ thành một chùm hẹp và quét trên mẫu, do đó cho

phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao

Nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, nguyên tử, virus…

Scanning transmission electron microscope (STEM)

Phạm vi quan sát của KHV quang học và điện tử

SIGMA Advanced Analytical Scanning

Electron Microscope SEM

Kính HV điện tử truyền qua (TEM)

KHV huỳnh quang

(fluorescence microscope) (stereoscopic microscope) Kính hiển soi nổi

• Kính hiển vi phản pha (Phase contrast microscopy -Nobel prize 1953): Ánh sáng xuyên qua các vật thể trong suốt, không màutiêu bản không cần nhuộm

• Kính hiển vi nền đen

(dark field microscope):

loại những chùm tia sáng không phân tán từ ảnh vật vùng xung quanh vật quan sát thường tối

Trái: quan sát với KHV quang học

Phải: với KHV phản pha (40x)

A Nấm men quan sát vơi KHV quang học

B Nấm men quan sát dưới KHV nền đen

C Nấm men quan sát dưới KHV phản pha

D Nấm men quan sát dưới KHV huỳnh quang

A

B

C

D

1.3 Cách sử dụng kính hiển vi quang học

a Chuẩn bị:

- Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút…

- Chuẩn bị tiêu bản quan sát

- Tư thế ngồi quan sát kính HV: ngồi ngay ngắn, đặt sổ ghi chép bên tay phải (nếu thuận tay phải)

b Quan sát với vật kính khô:

- Cắm điện và bật công tắc đèn

- Điều khiển kính tụ quang bằng bàn tay trái: Nâng lên ở mức hợp lý;

+ Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh khi có tiêu bản để được ảnh của mẩu vật đẹp nhất theo ý muốn

- Đặt tiêu bản quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát trên tiêu bản

- Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x

- Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu bản lên sát với vật kính;

Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến khi nhìn thấy chớp ảnh thì sử dụng ốc điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét của ảnh

c Quan sát với vật kính dầu

(100x)

- Nếu dùng vật kính dầu chú ý:

+ Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vị trí

vùng định quan sát trên tiêu bản

(Hình A)

+ Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm

nhẹ vào giọt dầu (Hình B)

+ Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều

chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật

kính lên cho đến khi thấy chớp ảnh

trên vi trường

 Khi nâng vật kính lên vẫn phải đảm

bảo đầu vật kính vẫn ngập trong dầu

soi (Hình C)

+ Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp

cho rõ nét

d Bảo quản sau khi sử dụng kính

- Nâng vật kính lên lấy tiêu bản ra

- Nếu là vật kính dầu thì dùng khăn vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính xylene lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật sạch

- Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu bản

- Tắt công tắc đèn, rút phích cắm khỏi

ổ điện

- Cho kính vào hộp hay đậy kính bằng bao nilon

- Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn

II Phương pháp làm tiêu bản nhuộm

(tiêu bản cố định)

- Tiêu bản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc

điểm hình thái học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống…

- Tiêu bản này có thể bảo quản lâu dài

- VSV quan sát được giết chết trong quá trình xử lý  an toàn

cho người quan sát

2.1 Các bước chuẩn bị:

- Chuẩn bị mẫu vật gồm:

+ Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic

+ Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men

- chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vô trùng, bút

viết kính, lam kính sạch

- Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn

lửa đèn cồn để làm sạch

+ Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm

2.2 Các bước làm tiêu bản cố định

Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết kính vẽ lên một vòng tròn  định vị vùng làm vết bôi

Bước 2: Làm vết bôi

+ Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt

lên vòng tròn trên lam kính và dàn mỏng ra

+ Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất

đặt lên vòng tròn; Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống;

hòa tan cùng với giọt nước cất  dàn mỏng ra

Bước 3:Làm khô: để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng

Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn vài lần Mục đích của bước cố định tiêu bản:

- Giết chết vsv an toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu tốt hơn

- Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính  khi rửa không bị trôi đi

- Giữ nguyên hình dạng và kích thước khi nhuộm

Lưu ý: + tránh đun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn + Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng

Tiêu bản sau khi cố định

Cố định tiêu bản

III Phương pháp nhuộm Gram 3.1 Lịch sử:

- Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram

âm và Gram dương

- Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch phát minh

3.2 Chuẩn bị thuốc nhuộm

- Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet

- Dung dịch cố định màu: Dung dịch lugol

- Dung dịch tẩy màu: Cồn axeton

- Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/

Safranin

3.3 Các bước nhuộm Gram

Gồm 4 bước

Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bôi  để 1-2 phút Sau đó

rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45 o , cho

nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi không còn màu tím

Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi,

để 1 phút  Rửa với nước sạch  vẩy khô

Bước 3: Tẩy màu với cồn 95%: Nghiêng phiến kính 45 o , tẩy cồn cho đến

khi không còn màu tím Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô.

Bước 4: Nhuộm màu với đỏ phenol: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút 

Rửa thuốc nhuộm thừa với nước làm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ

qua ngọn lửa đèn cồn

Lactobacillus sp (gram +)

E coli (gram -) Salmonella (gram -) Pseudomonas (gram -)

Staphylococcus aureus (gram +) Bacillus cereus (gram +)

Nấm men Saccharomyces

Nấm men nảy chồi (mũi tên)

Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên)

nảy chồi (mũi tên)

1 Quan sát tiêu bản làm sẵn + Tiêu bản vi khuẩn (E coli, Staphylococcus…) + Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x)

2 Quan sát tiêu bản cố định + Tiêu bản vk lactic (vật kính 100x) + Tiêu bản nấm men (vật kính 100x)

3 Mô tả hình thái (yêu cầu vẽ hình)

• Hình thái: Hình que, cầu…

• Cách thức sắp xếp: đứng riêng rẽ, nối đôi, nối chuỗi …

• Tính chất bắt màu: Gram âm/dương

• Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?, hình thành bào tử gì?

Yêu cầu báo cáo thực hành

Bài 2: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật

Nội dung :

• Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv

• Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa và thạch ống

• Quan sát hình thái khuẩn lạc

Mục đích

• Nắm được các kỹ năng, thao tác cơ bản về nuôi

cấy vi sinh vật trên các môi trường khác nhau

• Quan sát sự hình thành khuẩn lạc ở các môi

trường nuôi cấy khác nhau

2.1 Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv

a.Môi trường đặc (rắn)

Môi trường có sử dụng các chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2%

thạch (agar) Một số loại môi trường chủ yếu:

Môi trường dinh dưỡng:

• Môi trường đơn giản/MT cơ sở  peptone + agar; môi trường nước thịt peptone

• Môi trường phức tạp: có bổ sung các chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men, casein… + các chất khoáng hoặc các chất đặc hiệu

Môi trường chọn lọc: MT có chứa những thành phần ưu tiên sự

sinh trưởng của một số VSV và ức chế các VSV khác (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)

Môi trường chẩn đoán/ phân biệt: Có các thành phần hoặc hóa

chất giúp phân biệt các vsv bằng mắt thường (Ví dụ: môi trường MacConkey phân biệt E coli và Salmonella)

Một số loại môi trường chọn lọc

Casein media: chọn lọc Protease

Môitrường thạch nghiêng

MacConkey agar Mannitol salt agar

Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm

MT dinh dưỡng

33

b Môi trường dịch thể (lỏng)

• Là môi trường không bổ sung thêm chất đông đặc (thạch)

2.2 Phương pháp làm môi trường dịch thể

a Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth)

Sử dụng để nuôi cấy các vsv dị dưỡng

Thành phần:

Thịt bò (lợn): 500g

Nước cất: 1000ml pH: 7.5±0.2 (25 °C)

Sau khi hấp tiệt trùng, chia vào các ông nghiệm hoặc bình tam giác để sử dụng

b Môi trường peptone dịch thể (Peptone Water)

• Hòa tan Peptone 1% và NaCl 0.5% với 1 lít nước

• Môi trường này được sử cho các MT lên men đường (bổ sung thêm 1% đường) và MT kiểm tra phản ứng indole

Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ, gân, xay nhỏ Thêm 1000ml nước cất, để

ở nhiệt độ phòng 12h Sau đó đem đun sôi

30 phút Đợi nguội lọc bỏ cặn, bã.

- Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit,

thêm 0,5% NaCl và 1% pepton Điều chỉnh pH.

2.3 Phương pháp làm môi trường rắn

Môi trường Hansen: Sử dụng để nuôi cấy nấm men

Thành phần:

K 2 HPO 4 : 3g

MgSO 4 7H 2 O: 2-5g

Nước cất: 1000ml

Môi trường Sabouraud: Sử dụng để nuôi cấy nấm mốc, nấm men

Thành phần:

Glucose: 40g/l

Peptone: 10g/l

Chuẩn bị:

- Cân chính xác thành phần của môi

trường, hòa tan với nước cất bằng cách đun sôi

- Chỉnh pH từ 5-6; Hấp tiệt trùng ở

121 o /1atm/20 phút

- MT có màu vàng nhạt

- Khi sử dụng, nuôi cấy ở 30-35 o C/24-48h

Chuẩn bị:

- Cân chính xác thành phần của môi trường,

đun cho tan các thành phần Chỉnh pH từ 5,6±0,2 ở 25 o C; Hấp tiệt trùng ở 121 o /1atm/15 phút

- MT có màu kem hoặc vàng nhạt

2.4 Kỹ thuật ria cấy

2.4.1 Kỹ thuật ria cấy trên thạch ống

Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong cấy truyền

giống, nhân giống, giữ giống, phân lập/chọn lọc giống

a Chuẩn bị

- Dụng cụ: môi trường thạch nghiêng, que cấy, đèn cồn,

bút viết kính

- Môi trường sử dụng: Hansen agar

- Ống giống: Nấm men Saccharomyces sp.

- Tiệt trùng buồng cấy, tay, dụng cụ trước khi tiến hành

- Ghi tên giống, thời gian nuôi cấy lên môi trường mới

b Các bước tiến hành:

Bước 1: Lấy giống cần cấy + Đốt đèn cồn  tiệt trùng que cấy bằng cách hơ que cấy thẳng đứng trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ  để nguội + Lấy ống giống cần cấy: sử dụng ngón tay út + má lòng bàn tay lấy nút bông, tiệt trùng miệng ống  Lấy một lượng giống cần cấy  tiệt trùng miệng ống, đậy nút bông

Bước 2: Cấy truyền sang môi trường mới:

+ Đưa que cấy đã lấy giống xuống đáy ống môi trường mới Ria que cấy từ trái sang phải theo đường zich zắc chữ chi về phía miệng ống + Tiệt trùng miệng ống  đậy nút bông đem nuôi cấy

Lưu ý: + Tiến hành ria cấy giống trong buồng cấy/phòng vô trùng

+ Mọi thao tác kỹ thuật cần được tiến hành xung quanh ngọn lửa đèn cồn

Các bước ria cấy trên thạch ống 2.4.2 Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa

Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu phân lập, chọn lọc giống nhằm tách khuẩn lạc thuần

Các bước chuẩn bị như phương pháp ria trên ống Chỉ khác phần kỹ thuật ria

Kỹ thuật ria 2-3 lần đốt que cấy:

Bước 1: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy 1 ít giống cần cấy

- Vô trùng miệng đĩa, hé mở nắp hộp lồng, đưa que cấy đã lấy giống vào, ria ở 1/3 đĩa  dừng lại, đốt que cấy lần 1

Bước 2: Đợi que cấy nguội; Xoay đĩa sang trái1 góc 45o; Đặt que cấy vào đường ria cuối cùng của lần ria thứ nhất ria ngang tiếp 1/3 đĩa  đốt que cấy lần 2

Bước 3: Làm tiếp tục như bước 2, ria nốt 1/3 đĩa còn lại  vô trùng miệng đĩa, nuôi cấy trong tủ ấm ở trạng thái úp ngược

khuẩn lạc nấm mốc khuẩn lạc vi khuẩn khuẩn lạc vk lactic khuẩn lạc nấm men

2.5 Đánh giá sinh trưởng của vsv trên môi trường thạch

 VSV sinh trưởng trên môi trường đặc (rắn) sẽ hình thành khuẩn lạc

 Khuẩn lạc là sự tập trung một số lượng lớn tế bào ở cùng một nơi, được hình thành từ một tế bào ban đầu.

 Sự sinh trưởng được đánh giá thông qua các tiêu chí:

- Số lượng khuẩn lạc (đếm bằng phương pháp pha loãng nồng độ)

- Hình thái, kích thước của khuẩn lạc

- Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc

- Màu sắc của khuẩn lạc;

- Mùi của môi trường

 Hai dạng khuẩn lạc thường gặp:

- Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn,

mặt láng bóng, nhẵn.

- Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh.

Yêu cầu báo cáo

• Quan sát hình thái khuẩn lạc ở các đĩa nuôi

cấy:

- Hình thái khuẩn lạc

- Màu sắc

- Trạng thái

- Rìa

- Bề mặt

- Kích thước: sử dụng thước đo