Giáo trình Vi sinh đại cương (Nghề: Bảo vệ thực vật - Cao đẳng): Phần 2 - Trường Cao đẳng cộng đồng Đồng Tháp

Giáo trình Vi sinh đại cương cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản nhất về nông Khuyến nông, kỹ thuật tổ chức và quản lý các chương trình Vi sinh đại cương nhằm giúp sinh viên sau khi ra trường có thể nắm được các kỹ năng cần thiết để xây dựng và quản lý chương trình Vi sinh đại cương một cách hiệu quả nhất. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 2 giáo trình.

- Dựa vào hình dạng, khuẩn lạc có 5 loại: dạng điểm, dạng tròn, dạng không đều, dạng rễ cây và dạng hình thoi.

●

Điểm Tròn không đều rễ cây Thoi

- Bìa của khuẩn lạc, có 5 loại bìa: nguyên, gợn sóng, chia thùy, răng cưa và sợi

Bìa nguyên Gợn sóng chia thùy răng cưa Dạng sợi

- Độ nổi của khuẩn lạc có 4 loại: phẳng, lài, mô và cầu chồng

Phẳng lài mô cầu chồng

- Màu sắc của khuẩn lạc: màu trắng đục, trắng trong, mà vàng, màu cam, màu xám, màu đen, xanh rêu, nâu đen…

- Kích thước của khuẩn lạc: tùy thuộc vào độ tuổi của khuẩn lạc, kích thứơc biến động từ bằng đầu kim cho đến đường kính của đĩa petri

Quan sát bằng mắt ta có thể phân biệt được 2 loại khuẩn lạc rất khác biệt nhau:

- Khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men: khuẩn lạc của vi khuẩn là do nhiều tế bào cấu tạo đơn bào nên chúng tạo ra các khuẩn lạc trên môi trường đặc có những đặc trưng như: hình dạng khuẩn lạc thường tròn, không đều, hình thoi; bìa của khuẩn lạc là bìa nguyên, gợn sóng, hoặc chia thùy hay răng cưa

- Khuẩn lạc nấm mốc: do cấu tạo bởi nhiều sợi nấm nên khuẩn lạc trên môi trường đặc có hình dạng rễ cây, bìa của khuẩn lạc là các sợi, nhìn kỹ ta thấy như là các sợi gòn thật mịn, màu trắng hoặc xám và khi sinh bào tử (có màu sắc khác nhau) phát xuất từ giữa khuẩn lạc

2 Môi trường lỏng

Vi sinh vật khi sinh trưởng trên môi trường lỏng tùy thuộc nhóm hiếu khí hay kỵ khí mà chúng có thể làm đục môi trường, tạo váng (màng), tạo cặn (tích tụ) hay tạo kết tủa

- Nếu làm đục môi trường thì xem làm đục đều hay tạo dạng bông hay sóng lụa

- Nếu tạo màng thì cần nêu rõ đặc điểm của màng (mỏng hay dầy, phẳng hay gấp nếp)

- Nếu tạo cặn hay kết tủa phải nêu đặc tính ít hay nhiều, xốp hay đặc dạng bông, dạng hạt hay dạng nhầy

3.4 Thực hành quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi

Quan sát trên kính hiển vi bằng 2 phương pháp sau đây:

1 Phương pháp giọt ép: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật trong không gian 2

chiều để thấy chuyển động của chúng bằng cách:

Nhỏ 1 giọt nước cất tiệt trùng lên kính mang vật (phẳng)

Khử trùng kim cấy trên ngọn đèn cồn và để nguội

Châm đầu kim cấy vòng lên môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn hoặc nấm men, lấy 1 ít vi khuẩn hoặc vi nấm rồi chấm vào giọt nước trên kính mang vật và trải mỏng

ra

Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước (sao cho không có bọt khí)

Quan sát dưới kính hiển vi x10, x40 để thấy sự chuyển động thật và chuyển động brown (nếu không có roi thì không có chuyển động thật)

2 Phương pháp giọt treo: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật trong không gian 3

chiều, vi sinh vật chuyển động theo nhiều hướng bằng cách:

Nhỏ 1 giọt nước hoặc môi trường lỏng tiệt trùng lên kính đậy vật

Dùng kim cấy đã khử trùng bằng nhiệt để chuyển vi khuẩn từ đĩa petri vào giọt nước trên kính đậy vật

Thoa vaseline theo cạnh của kính đậy vật

Lật ngược và úp kính đậy vật lên lame lõm sao cho giọt nước ở giữa lõm Quan sát sự chuyển động của vi khuẩn nơi lame lõm

CÂU HỎI

1 Tại sao khi quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi phải nhỏ giọt nước cất lên lam kính?

2 Tại sao có màu sắc của các khuẩn lạc khác nhau trên cùng môi trường?

3 Sinh viên quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri chứa môi trường đặc, mô tả và vẽ hình khuẩn lạc nấm men, nấm mốc và vi khuẩn

4 Quan sát và vẽ hình vi khuẩn trong giọt ép

5 Quan sát trên kính hiển vi, hãy cho biết sự di chuyển của các vi khuẩn, nấm men trong các mẫu?

Chương 4

KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN THUẦN KHIẾT

Cấy vi khuẩn là công việc đưa vi khuẩn vào các môi trường nuôi cấy đã được khử trùng

Yêu cầu của việc nuôi cấy vi khuẩn là đảm bảo tính thuần khiết của một dòng vi khuẩn cần nuôi cấy Muốn vậy, chúng ta phải thực hiện quá trình nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện vô trùng, không để cho bất kỳ một vi khuẩn nào từ môi trường xung quanh nhiễm bẩn vào Chúng ta đã biết thế giới xung quanh ta từ không khí đến bề mặt các đồ vật, ngay cả quần áo, chân tay…đều luôn có một số lượng lớn vi sinh vật, và các vi sinh vật này luôn sẵn sàng gây nhiễm các môi trường nuôi cấy khi ta thực hiện việc nuôi cấy vi khuẩn

Các vi khuẩn thường được cấy trên các môi trường dinh dưỡng lỏng hoặc đặc đựng trong các ống nghiệm hoặc các hộp đĩa petri Tất cả các dụng cụ thủy tinh và môi trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng trước khi thực hành

4.1 Mục đích yêu cầu

- Trang bị cho sinh viên biết một số phương pháp gieo cấy, phân lập và cấy truyền

vi khuẩn từ các loại mẫu khác nhau phục vụ cho công tác chẩn đoán, xét nghiệm

- Yêu cầu sinh viên biết cách lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu dùng cho việc cấy và phân lập vi khuẩn

- Sinh viên biết cách nhận biết một số dạng khuẩn lạc

- Sinh viên phải nắm vững nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy và mục đích của việc cấy phân lập và cấy truyền

4.2 Vật liệu thực hành:

- Kim cấy loại cứng và loại mềm (kim nhọn và kim tròn)

- Dĩa petri và ống nghiệm chứa môi trường có vi sinh vật phát triển

- Dĩa petri và ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng

- Pipette, đèn cồn, bông gòn thấm, cồn khử trùng, dao mổ

-Kim cấy vòng đầu cứng

Kim cấy vòng đầu mềm

Dao mổ trong y tế

Kim cấy vi khuẩn

Kim cấy có móc

Kim cấy dẹp

Hình 2 Các dụng cụ chuyên dùng để cấy, chuyển vi sinh vật từ môi trường

này sang môi trường khác

Kim cấy nhọn hoặc kim cấy vòng bằng sợi dây kim khí (platin hay nickel chrome) chóng nóng, chóng nguội và sẽ tránh bị rỉ sét khi đốt đỏ ở nhiệt độ cao lúc khử trùng Kim cấy vòng dùng để cấy lướt trên mặt thạch

Kim cấy thẳng dùng để cấy đâm sâu vào thạch (cấy vi khuẩn kỵ khí) hay vào thạch mềm (xem di động) hay dùng để ly trích vi khuẩn trên các khuẩn lạc mọc gần nhau

Kim cấy dẹp và kim cấy có móc hình thước thợ để cấy nấm

4.3 Phương pháp gieo cấy vi khuẩn

Gieo cấy vi khuẩn từ nốt rễ cây họ đậu

Phòng cấy hoặc tủ cấy phải vô trùng có trang bị hệ thống lọc không khí và đèn cực tím để bảo đảm vô trùng

- Thu nốt rễ từ cây đậu nành hoặc đậu nành hoang, rửa sạch đất, chọn nốt rễ ở gần

cổ rễ (rễ chính) nốt to, chắc, mang về phòng thí nghiệm, nếu chưa sử dụng thì cho nốt

rễ vào bọc nilon cột chặt trữ trong tủ lạnh (ngăn đá)

- Xử lý nốt rễ: Cho nốt rễ (đã rửa sạch đất) vào cốc sứ, thêm cồn 70oC cho ngập nốt rễ ngâm 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất

+ Cho oxy già 3% vào cốc (ngập nốt rễ) để yên 3 phút, rồi rửa lại bằng nước cất (3 lần)

+ Dùng kẹp đã khử trùng gấp nốt rễ để lên giấy thấm sạch

- Các thao tác cấy lên đĩa petri:

+ Đĩa petri chứa môi trường KIA hoặc TSA, dùng bút lông dầu đánh dấu (dưới đáy đĩa petri) những điểm định cấy vi khuẩn

+ Sử dụng kim cấy đầu nhọn đã khử trùng qua ngọn lửa đèn cồn, đâm thẳng vào giữa nốt rễ (nơi có vi khuẩn phát triển mạnh)

+ Mở hé nắp đĩa petri, đưa kim cấy vào mặt agar rồi đâm thủng mặt thạch theo những điểm đã đánh dấu, đậy nắp đĩa petri lại, hơ kim cấy lên ngọn lửa đèn cồn trước khi để kim cấy lên giá

+ Lật ngược đĩa petri đã cấy, ghi tên vi khuẩn đã cấy, ngày cấy, tên người cấy rồi cho vào tủ ủ ở 30-34o

C/24 giờ Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn

4.4 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn

Cấy phân lập (tách ròng) là phương pháp tách rời vi khuẩn từ một hổn hợp dựa trên nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy Trong thủ thuật này, ta cần làm cho vi khuẩn tách rời từng tế bào và chúng sẽ phát triển lên thành khuẩn lạc độc lập (thuần khiết) phục vụ cho việc nghiên cứu chúng, xác định vi khuẩn cộng sinh, vi khuẩn tạp nhiễm… Tùy theo nhóm vi sinh vật ta có nhiều phương pháp phân lập, có thể phân lập bằng que cấy vòng hoặc bằng que trang…

4.4.1 Nguyên tắc

Phương pháp phân lập dựa trên nguyên tắc là mỗi một tế bào vi sinh vật sau một thời gian nuôi cấy (24 giờ) trên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp sẽ phát triển thành một quần thể vi sinh vật đồng nhất, thuần khiết Khi phát triển riêng biệt trên môi trường thạch các tế bào vi sinh vật sẽ tạo thành một nhóm vi sinh vật và được gọi là

khuẩn lạc Như vậy mỗi khuẩn lạc có thể được tính như là một tế bào vi sinh vật Khuẩn lạc thường có kích thước từ 0,5x 4-5mm và có thể nhìn thấy được bằng mắt thường Trong khi đó muốn thấy được các tế bào vi sinh vật chúng ta phải dùng kính hiển vi Các tế bào vi sinh vật càng được tách rời nhau, những khuẩn lạc tạo nên sẽ càng riêng biệt, rõ nét, càng giúp cho việc chọn lựa các dòng thuần được dễ dàng hơn

4.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn hoặc nấm men

Hai phương pháp phân lập vi khuẩn hoặc nấm men bằng que cấy vòng thường dùng:

Cách 1: Dùng kim cấy mềm lấy 1 ít vi sinh vật từ các khuẩn lạc

- Trải vi sinh vật (đường 1)

- Hơ lửa kim cấy cho các vi sinh vật trên kim cấy chết bớt

- Vẽ đường 2 cắt ngang đường 1

- Hơ lửa kim cấy và tiếp tục vẽ đường 3

- Vi sinh vật được kéo rời rạc qua các đường cấy, và cuối đường 3 sẽ còn vài tế bào rời phát triển thành khuẩn lạc độc lập

Cách 1 Đường 1

Đường 3

Đường 2

Cách 2

4.5 Cấy truyền

Vi sinh vật khi được phân lập có số lượng rất ít, không đủ cho các nghiên cứu định danh, xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, tính chất gây bệnh của chúng Vì vậy cần phải nuôi cấy để làm gia tăng số lượng của chúng Mặt khác, vi sinh vật sau khi định danh thường sẽ được giữ giống trong môi trường nhân tạo Các môi trường nhân tạo tuy có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhưng khi vi sinh vật được giữ giống trong môi trường thì đây là một

hệ kín (vi sinh vật không được cung cấp dinh dưỡng mới trong suốt thời gian giữ giống), do đó sau một thời gian giữ giống, các chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ nghèo đi Hơn nữa các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi sinh vật tích tụ ngày càng nhiều trong môi trường Tất cả những yếu tố đó đã làm ức chế, kìm hãm, giết chết vi sinh vật hoặc làm thay đổi các đặc tính sinh lý - sinh hóa, cũng như độc lực của những vi sinh vật được nuôi cấy lâu ngày trên môi trường nhân tạo Điều này gây ảnh hưởng rất lớn đến việc nghiên cứu chúng Để khắc phục tình trạng này người ta phải cấy truyền vi sinh vật

4.5.1 Mục đích của việc cấy truyền

- Nhằm gia tăng số lượng vi sinh vật để thực hiện việc nghiên cứu chúng sau khi phân lập được

- Tái sinh các chủng vi sinh vật sau thời gian nuôi cấy bảo quản chúng trên môi trường nhân tạo (phục hồi số lượng, các đặc tính sinh lý - sinh hóa, độc lực… của vi sinh vật)

4.5.2 Cấy truyền vi sinh vật

Có thể cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng hay môi trường thạch nghiêng, tùy theo tình trạng sinh lý của vi sinh vật cũng như mục đích nghiên cứu Ghi

rõ ký hiệu của loại vi sinh vật được cấy truyền, ngày, tháng cấy trên ống nghiệm

Dùng kim cấy mềm lấy một ít vi khuẩn hay nấm men chuyển sang môi trường mới với các thao tác như sau:

1 Cấy truyền từ môi trường đặc sang môi trường đặc

a Trên đĩa petri:

Từ môi trường thạch đĩa, chọn những khuẩn lạc riêng biệt, quan sát kỹ bề mặt, rìa, màu sắc, kích thước…ghi lại trong sổ theo dõi, đánh dấu khuẩn lạc (đánh dấu

ở mặt đáy của đĩa petri) hoặc môi trường thạch nghiêng, dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít vi khuẩn cấy sang ống môi trường đã được chuẩn bị sẵn Đối với vi khuẩn thì cấy theo đường zigzag, với vi nấm cấy dọc thành hàng hoặc cấy điểm Đặt úp đĩa petri thứ 2 (ghi ký hiệu và chủng cấy, ngày cấy) và ủ ở 30-37o

C/24 giờ

b Ống nghiệm:

- Tay phải cầm kim cấy (bằng ngón cái, trỏ và giữa), tay trái cầm 2 ống nghiệm (phần đáy ống nghiệm nằm trong lòng bàn tay được giữ chặt bởi ngón tay cái, 2 đầu ống nghiệm vạt ra theo hình chữ V với 2 thân ống nghiệm nằm giữa 2 ngón tay trỏ + giữa và tay giữa + ngón áp út)

- Mở lỏng 2 nắp ống nghiệm, hơ nóng kim cấy gần đến cán, dùng các kẻ giữa ngón tay giữa + ngón áp út và ngón út + lòng bàn tay phải để kẹp 2 nắp ống nghiệm

- Hơ lửa 2 miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn, đưa kim cấy vào, cấy theo đường zigzag hoặc cấy thẳng (hình 3), cấy xong thì hơ miệng ống nghiệm và đóng nắp lại

2 Gieo cấy từ môi trường đặc sang môi trường lỏng:

Kỹ thuật này thường sử dụng trong trường hợp các vi sinh vật đã được giữ quá lâu trong môi trường nhân tạo, số lượng của chúng không còn nhiều, vi sinh vật

được giữ giống trong môi trường đất, môi trường lỏng có glycerin bảo quản ở 20oC hoặc

ở dạng đông khô…hoặc trong trường hợp cần thực hiện xét nghiệm liên quan đến khả năng di động của vi sinh vật Trong môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển dễ dàng hơn nhất là những cấu trúc dạng chiên mao hoặc tiêm mao (lông di động, lông kết bám…)

- Cách 1: Hơ kim cấy vòng trên ngọn lửa, chấm trên khuẩn lạc chứa trong đĩa

Petri hay ống nghiệm, chuyển kim cấy sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

- Cách 2: cho 1 ít nước cất tiệt trùng vào đĩa Petri hay ống nghiệm chứa vi sinh

vật, dùng kim cấy vòng đã khử trùng như mô tả ở trên, cọ nhẹ cho vi sinh vật tách ra khỏi môi trường agar (dung dịch huyền phù) Dùng micropipette hút dung dịch huyền phù chuyển sang môi trường lỏng

Môi trường vừa cấy được ủ ở 37oC/24 giờ để vi sinh vật phát triển Sau đó có thể thực hiện việc cấy truyền tiếp tục sang môi trường lỏng khác và giữ giống

3 Gieo cấy từ môi trường lỏng sang môi trường đặc:

- Cách 1: Chấm kim cấy vào môi trường lỏng ở ống nghiệm rồi cấy lên mặt

môi trường agar trong đĩa petri hay ống nghiệm theo đường zigzag (không làm rách mặt agar)

- Cách 2: Dùng ống hút đã khử trùng hút dung dịch huyền phù từ ống

nghiệm rồi nhỏ lên mặt môi trường đặc

4 Gieo cấy từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng:

Trường hợp này dùng micropipette hút 1 lượng dung dịch huyền phù từ ống nghiệm chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới

CÂU HỎI

1 So sánh sự giống và khác nhau giữa phương pháp cấy phân lập và cấy truyền?

2 Tại sao phải hơ lửa miệng ống nghiệm trước khi đưa kim cấy vào lòng ống nghiệm?

3 Có thể xác định độ ròng (thuần) của vi khuẩn hoặc nấm men bằng mắt được không?

Chương 5

CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI KHUẨN

Nhuộm vi khuẩn có rất nhiều phương pháp nhuộm như nhuộm đơn, nhuộm Gram, nhuộm Ziehl-Nelsen và nhuộm bào tử… trong đó nhuộm đơn và nhuộm Gram là phương pháp nhuộm đơn giản và cơ bản nhất trong vi khuẩn học Phương pháp nhuộm đơn chỉ

sử dụng một loại phẩm màu duy nhất; nhuộm Gram còn gọi là nhuộm kép vì trong phương pháp này ta sẽ dùng 2 loại phẩm nhuộm tương phản nhau về màu sắc, đó là tím gentian và đỏ Fuchsin hoặc Safranin

5.1 Mục đích - yêu cầu

- Trang bị cho sinh viên kỹ năng thực hành nhuộm tế bào vi khuẩn để phục vụ cho việc phân loại và điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra

- Yêu cầu sinh viên nắm vững nguyên lý của các kỹ thuật nhuộm:

+ Tế bào vi khuẩn chứa acid nhân nên muốn nhuộm vi khuẩn ta phải dùng các phẩm nhuộm có tính base

+ Chất rượu (alcohol) sẽ tẩy được màu của hợp chất “tím gentian-Iod” của vi khuẩn gram âm

+ Sinh viên biết chuẩn bị mẫu vật và tiến hành phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép (nhuộm Gram)

5.2.2 Vật liệu

- Ống nghiệm chứa mẫu vi khuẩn (lactobacillus, Rhizobium, bacillus subtilis)

nuôi cấy 24 giờ ở 37oC

- Bông thấm nước cắt nhỏ, giấy lọc cắt miếng nhỏ

5.2.3 Hóa chất

- Nước cất tiệt trùng trùng

- Dung dịch tẩy màu (Ethanol + acetone)

- Phẩm nhuộm: blue methylen, crystal violet, dung dịch Iod, Ethanol 95oC, Fuchsin hay Safranin

- Hòa tan (a) trong (b) rồi thêm vào hổn hợp 100ml nước cất

- Dung dịch phẩm nhuộm pha chế xong được trử trong chai có nắp thủy tinh

b phẩm nhuộm Gram

 Crystal violet

Dung dịch 1: - Crystal violet (85%) 20g

- Ethanol (95o) 100ml Dung dịch 2: - Ammonium oxalate 1g

- Nước cất 100ml

Cách điều chế:

- Pha dung dịch (1) trong nước cất với tỷ lệ 1:10 ta có hổn hợp (c)

- Pha dung dịch (2)