Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương (Chương trình POHE)

Phương pháp làm tiêu bản soi tươi - Tiêubản soi tươi: Lấy trực tiếp mẫu đặt lên phiến kính để quan sát, không cần nhuộm màu.. Sauđó, ghi tên mẫu lên tiêu bản Bước 2: Sử dụng que cấy đầu

THỰC HÀNH

NỘI DUNG BÀI 1 PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ

NHUỘM MÀU GRAM

BÀI 2 QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT

BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG

BÀI 4 NUÔI CẤY VI SINH VẬT

BÀI 5 ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CỦA VSV TRÊN CÁC

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

BÀI 6 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG TB VSV

NỘI DUNG:

1 Phương pháp làm tiêu bản soi tươi

2 Quan sát tiêu bản nấm mốc MỤC ĐÍCH:

 Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang học Nắm được cách

sử dụng

 Học cách làm tiêu bản soi tươi (không nhuộm)

 Quan sát tiêu bản nấm mốc

II Phương pháp làm tiêu bản soi tươi

- Tiêubản soi tươi: Lấy trực tiếp mẫu đặt lên phiến kính để quan sát, không cần nhuộm màu

- Tiêubản này không thể bảo quản lâu dài

- Thực hành:

+ Phương pháp làm tiêu bản giọt ép (quan sát nấm men) + Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc

2.1 Các bước chuẩn bị:

-Mẫu vi sinh vật cần quan sát:

+ Mẫu lỏng: Dung dịch nuôi cấy nấm men Saccharomyces sp

+ Mẫu rắn: Đĩa nuôi cấy nấm mốc: Aspergillus sp., Rhizopus/Niger, Penicillium

- Các dụng cụ khác: Lam kính, que cấy, ống hút Pasteur, đèn cồn, bút viết kính, panh

kẹp, lamen, dao cắt mẫu …

- Dung dịch soi tươi: Dung dịch phenol

2.2 Phương pháp làm tiêu bản giọt ép

Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần

Sauđó, ghi tên mẫu lên tiêu bản

Bước 2: Sử dụng ống hút Pasteur lấy một giọt mẫu, đặt lên lam kính  nhỏ 1 giọt

phenol trộn đều

Bước 3: Đặt lamen nghiêng 1 góc 45o, từ từ đậy lamen xuống sao cho lamen phủ kín

giọt dung dịch mẫu và không có bọt khí

Bước 4: Quan sátdưới kính hiển vi với vật kính 40x

2.3 Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc (soi tươi)

Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần

Sauđó, ghi tên mẫu lên tiêu bản

Bước 2: Sử dụng que cấy đầu nhọn hoặc dao cắt mẫu cắt một phần thạch có chứa

mẫu  đặt lên lam kính

Bước 3: Quan sátdưới kính hiển vi với vật kính 4x và 10x

1 Quan sát tiêu bản làm sẵn

+ Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x)

2 Quan sát tiêu bản tự làm

+ Tiêu bản nấm men với vật kính 40x

+ Tiêu bản nấm mốc với vật kính 4 và 10x

3 Mô tả hình thái (yêu cầu vẽ hình)

Hình thái: Cho biết hình thái của nấm men và nấm mốc

Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?, hình thành bào tử gì?

Yêu cầu báo cáo thực hành

NHUỘM MÀU GRAM NỘI DUNG:

1 Phương pháp làm tiêu bản cố định

2 Phương pháp nhuộm màu Gram

MỤC ĐÍCH:

 Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương

pháp nhuộm Gram

- Tiêubản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống…

- Tiêubản này có thể bảo quản lâu dài

- VSV quan sátđược giết chết trong quá trình xử lý  an toàn cho người quan sát

1.1 Các bước chuẩn bị:

-Chuẩn bị mẫu vật gồm:

+ Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic + Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men

- Chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vô trùng, bút viết kính, lam kínhsạch

-Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn lửa đèn cồn để làmsạch

+ Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm

I Phương pháp làm tiêu bản cố định

1.2 Các bước làm tiêu bản cố định Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết kính vẽ lên một vòng tròn định vị vùng làm vết bôi

Bước 2: Làmvết bôi + Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt lên vòng tròn

trên lam kính và dànmỏng ra

+ Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất đặt lên vòng tròn;

Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống; hòa tan cùng với giọt nước cất  dànmỏng ra

Bước 3:Làm khô: để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng

Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn vài lần Mục đích của bước cố định tiêu bản:

-Giết chết vsv an toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu tốt hơn

- Giúp cho vsvgắn chặt vào lam kính  khi rửa không bị trôi đi

-Giữ nguyên hình dạng và kích thước khi nhuộm Lưu ý: + tránhđun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn + Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng

Tiêu bản sau khi cố định

Cố định tiêu bản

2.1 Lịch sử:

- Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram âm và

Gram dương

- Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch phát minh

2.2 Chuẩn bị thuốc nhuộm

- Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet

- Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/ Safranin

2.3 Các bước nhuộm Gram

Gồm 4 bước

Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bôi  để 1-2 phút Sau đó rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, chonước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi nước chảy ra không còn màu tím

Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi, để 1 phút  Rửa với nước sạch  vẩy khô

Bước 3: Tẩy màu với cồn axeton: Nghiêng phiến kính 45o, để cồn chảy từ đầu đến cuối phiến kính chođến khi không còn màu tím Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô

Bước 4: Nhuộm màu với đỏ Fuchsin: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút  Rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch làm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn

E coli (gram -) Salmonella (gram -) Pseudomonas (gram -)

Bacillus cereus (gram +)

Nấm men Saccharomyces

Nấm men nảy chồi (mũi tên)

Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên)

nảy chồi (mũi tên)

1 Môtả và thực hành được phương pháp làm tiêu bản cố định

+ Tiêubản vi khuẩn lactic

+ Tiêubản nấm men

2 Thực hành phương pháp nhuộm Gram với 2 tiêu bản tự làm

+ Trình bày trìnhtự các bước nhuộm Gram

+ Cho biết tại sao khi nhuộm màu vi khuẩn lại có tính chất bắt màu Gram khác

nhau?

+ Trongtrường hợp nào, khi nhuộm Gram chỉ cần sử dụng 1 loại thuốc nhuộm?

Yêu cầu báo cáo thực hành

NỘI DUNG:

1 Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi quang học

2 Quan sát tiêu bản nhuộm MỤC ĐÍCH:

 Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương pháp nhuộm Gram

 Quan sát một số hình thái cơ bản của nấm mốc, vi khuẩn và nấm men

I Sử dụng kính hiển vi quang học (light microscope)

1.1 Cấu tạo kính hiển vi quang học

a Phần cơ học

Thân kính:dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để đưa ảnh

của vật quan sát vào đúng tiêu điểm

- Bàn xoay (mâm kính):gắn ở phía trên thân kính, nơi gắn các vật kính

- Ống kính:Gắn ở phía trên thân kính, có thể xoay quanh một trục thẳng

đứng tùy theo vị trí quan sát Phía trên ống kính có gắn thị kính

- Bàn kính/khay kính:nơi để tiêu bản quan sát Trên bàn kính có các kẹp

giữ tiêu bản Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang kính

- Đế kính (chân kính):cấu tạo vững chắc đỡ toàn bộ KHV

- Ốc điều chỉnh:gồm

+Ốc điều chỉnh tiêu bản;

+Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn);

+Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ)

b Phần quang học

Bộ phận chiếu sáng:

Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại với

nhauhội tụ các tia sáng xuất phát từ nguồn sáng

vào tiêubản

Có 2 loại tụ quang kính: Tụ quang kính nền sáng và

tụ quang kính nền đen

Vật kính

gồm một hệ thống thấu kính hội tụ

có tiêucự ngắn khoảng vài mm, đặt trongmột vỏ bọc kim loại

Chức năng: Tạo ảnh thực ngược chiều với vật quan sát

Độ phóng đại của vật nghiên cứu phụ thuộc vào tiêu cự và độ cong của thấu kính ngoài cùng Độ cong càng lớn, thì tiêu cự càng ngắn độ phóngđại của vật kính càng lớn

Cácvật kính: 8x, 10x, 40x, 60x (vật kính khô), 90x, 100x (vật kính dầu)

d Thị kính

- Gồm 2 thấu kính: thấu kính mắt phía trên,thấu kính tụ phía dưới Giữa hai thấu kính có màn chắn giữ lại các tia sáng xung quanh, chỉ để các tia sáng gần với trục quang đi qua  hình rõ néthơn

- Vai trò: Phóngđại ảnh của vật kính thuđược-vai trò giống kính lúp

- Cácloại thị kính: 7x, 10x, 15x, 20x

 Độ phóng đại của mẫu quan sát bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính

Giới thiệu một số loại kính hiển vi khác

Kính hiển vi điện tử

- KHV điện tử truyền qua(Transmission electron microscope – TEM):sử

dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn

mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn

(1x106 lần) Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film

quanghọc, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số

- KHV điện tử quét(Scanning electron microscope – SEM): là một loại

kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng khác với TEM: chùm điện tử

khôngtruyền qua mẫu mà hội tụ thành một chùm hẹp và quét trên mẫu,

dođó cho phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao

Nghiêncứu vi cấu trúc của vật rắn, nguyên tử, virus…

Scanning transmission electron microscope (STEM)

SIGMA Advanced Analytical Scanning

Electron Microscope SEM

Kính HV điện tử truyền qua (TEM)

KHV huỳnh quang (fluorescence microscope) Kính hiển soi nổi

(stereoscopic microscope)

Kính hiển vi phản pha (Phase

contrast microscopy-Nobel prize

1953): Ánh sáng xuyên qua cácvật

thể trong suốt, không màutiêu

bản không cần nhuộm

D

B

A Nấm men quan sát vơi KHV quang học B Nấm men quan sát dưới KHV nền đen

C Nấm men quan sát dưới KHV phản pha D Nấm men quan sát dưới KHV huỳnh quang

1.2 Cách sử dụng kính hiển vi quang học

a.Chuẩn bị:

- Kínhhiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút…

-Chuẩn bị tiêu bản quan sát

-Tư thế ngồi quan sát kính HV: ngồi ngay ngắn, đặt sổ ghi chép bên tay phải

(nếu thuận tay phải)

b Quan sát với vật kính khô:

-Cắm điện và bật công tắc đèn

-Điều khiển kính tụ quang bằng bàn tay trái: Nâng lên ở mức hợp lý;

+ Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh khi có tiêu bản để được ảnh của

mẩu vật đẹp nhất theo ý muốn

-Đặt tiêu bản quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát trên tiêu bản

-Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x

-Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu bản lên sát với vật kính; Mắt nhìn

vàothị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến khi nhìn thấy chớp ảnh thì sử dụng ốc

điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét của ảnh

c Quan sát với vật kính dầu (100x)

-Nếu dùng vật kính dầu chú ý:

+ Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vị trí vùngđịnh quan sát trên tiêu bản (Hình A)

+ Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm nhẹ vào giọt dầu (Hình B)

+ Nhìn vàothị kính, nhẹ nhàng điều chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật kính lên chođến khi thấy chớp ảnh trên

vi trường

 Khi nângvật kính lên vẫn phải đảm bảo đầu vật kính vẫn ngập trong dầu soi (Hình C)

+ Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp cho

rõ nét

d Bảo quản sau khi sử dụng kính

- Nâng vật kính lên lấy tiêu bản ra.

- Nếu là vật kính dầu thì dùng khăn vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính xylene lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật sạch

- Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu bản

- Tắt công tắc đèn, rút phích cắm khỏi ổ điện

- Cho kính vào hộp hay đậy kính bằng bao nilon

- Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn

2 Quan sát tiêu bản

2.1 Quan sát tiêu bản nấm mốc

- Sử dụng vật kính 4x và 10x

- Quan sátở vật kính 4x: cho biết đặc điểm hình thái của nấm mốc, vẽ hình

- Quan sátở vật kính 10x: Cho biết đặc điểm bào tử của nấm mốc, vẽ hình

2.2 Quan sát tiêu bản nấm men

-Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái và hình thức sinh sản

của nấm men Vẽ hình

2.3 Quan sát tiêu bản vi khuẩn lactic

-Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái và tính chất sắp xếp

của vi khuẩn lactic Vẽ hình

1 Quan sát tiêubản tự làm

+ Tiêubản nấm men với vật kính 100x (vật kính dầu)

+ Tiêubản vi khuẩn lactic với vật kính 100x (vật kính dầu)

2 Báo cáo:

- Cho biết tính chất bắt màu của vi sinh vật ở mẫu nhuộm

-Môtả đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic và nấm men Vẽ hình minh họa

-Môtả tính chất sắp xếp của vi khuẩn lactic: đứng riêng rẽ, nối đôi, nối

chuỗi?

-Môtả đặc điểm sinh sản của nấm men: tìm tế bào nảy chồi Vẽ hình

Yêu cầu báo cáo thực hành

SINH VẬT

Nội dung:

3.1 Chuẩn bị dụng cụ 3.2 Phương pháp làm môi trường nuôi cấy VSV

Mục đích

 Biết cách bao gói, hấp sấy dụng cụ thí nghiệm

vật

3.1 Chuẩn bị dụng cụ, môi trường nuôi cấy vi sinh vật

3.1.1 Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ thường được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy VSV

- Hộp lồng (đĩa Petri), ống nghiệm, bình tam giác, pipet, cốc đong, đũa thủy tinh, ống hút Pasteur …

Vệ sinh dụng cụ:

Dụng cụ thuỷ tinh mới chưa sử dụng: ngâm nước lã hoặc dung dịch H2SO4loãng/ 24 giờ Rửa lại bằng xà phòng và nước nhiều lần cho tới khi dung dịch rửa có pH trung tính

Các dụng cụ đã qua sử dụng (VSV gây bệnh): trước khi rửa phải được khử trùng bằng hơi nước cao áp giết chết các VSV  đảm bảo an toàn cho người rửa, không cho mầm bệnh cũ nhiễm vào môi trường mới

Sử dụng dung dịch sunfocromat để ngâm tẩy các vết bẩn trên dụng cụ thuỷ tinh

Dụng cụ sau khi rửa, cần được làm khô trước khi bao gói

Bao gói dụng cụ để khử trùng:

Dụng cụ trước khi khử trùng phải được rửa sạch, làm khô và bao gói bảo đảm vô

trùng sau khi sấy

Khử trùng dụng cụ

Dụng cụ thủy tinh sau khi được bao gói thì được khử trùng bằng phương pháp sấy ở

nhiệt độ 160-180oC/2h

Các dụng cụ đã khử trùng được bảo quản trong tủ chuyên dụng đựng dụng cụ hoặc

bảo quản trong túi nilon kín Chỉ bóc giấy bao gói ngay trước khi sử dụng

Sau khi khử trùng, các que gạt, que cấy chỉ nên sử dụng trong vòng 24 giờ, hộp petri

trong vòng 3 ngày, ống nghiệm, bình nón khoảng 7-10 ngày nếu bảo quản tốt Nếu

để lâu, dụng cụ phải được khử trùng lại trước khi sử dụng

Một số dụng cụ như que gạt, que cấy, ống hút Pasteur, chày cối, hộp đựng đầu

pipet… được khử trùng bằng phương pháp hấp hơi nước cao áp ở 121oC/1atm/30

phút

Làm nút bông cho ống nghiệm, bình tam giác Bao gói dụng cụ thí nghiệm để khử trùng

3.2 Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv

3.2.1Môi trường đặc (rắn)

Môitrường có sử dụng các chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2% thạch (agar) Một

số loại môi trường chủ yếu:

Môi trường dinh dưỡng:

• Môitrường đơn giản/MT cơ sở  peptone + agar; môi trường nước thịt peptone

• Môitrường phức tạp: có bổ sung các chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men, casein… + cácchất khoáng hoặc các chất đặc hiệu

Môi trường chọn lọc: MT có chứa những thành phần ưu tiên sự sinh trưởng của

một số VSV và ức chế các VSV khác (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)

Môi trường chẩn đoán/ phân biệt: Có các thành phần hoặc hóa chất giúp phân

biệt các vsv bằng mắt thường (Ví dụ: môi trường MacConkey phân biệt E coli

và Salmonella)

Một số loại môi trường chọn lọc

Casein media: chọn lọc Protease

Môi trường thạch nghiêng

MacConkey agar Mannitol salt agar

Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm

MT dinh dưỡng

Một số môi trường chẩn đoán, phân biệt

Thạch máu: blood agar

biệt Salmonella và Shigella với E coli

43

3.2.2 Môi trường dịch thể (lỏng)

Là môi trường không bổ sung thêm chất đông đặc (thạch)

3.3 Phương pháp làm môi trường dịch thể

a Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth)

Sử dụng để nuôi cấy các vsv dị dưỡng

Thành phần:

Thịt bò (lợn): 500g Peptone: 10g NaCl: 5g Nước cất: 1000ml pH: 7.5±0.2 (25 °C)

Sau khihấp tiệt trùng, chia vào các ông nghiệm hoặc bình tam giác để sử dụng

b Môi trường peptone dịch thể (Peptone Water)

• Hòa tan Peptone 1% và NaCl 0.5% với 1 lít nước

• Môitrường này được sử cho các MT lên men đường (bổ sung thêm 1% đường) và

MT kiểm tra phản ứng indole

Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ, gân,

xaynhỏ Thêm 1000ml nước cất, để ở nhiệt độ phòng 12h Sauđó đem đun sôi 30 phút Đợi nguội lọc qua bông/giấy lọc

- Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit, thêm 0,5% NaCl và 1% pepton.Điều chỉnh pH

- Hấp khử trùng ở 121o/1atm/20 phút