Bài 2 sinh trưởng của vsv

Các phương pháp xác định gián tiếp sinh khối TB •Trong nhiều quá trình nuôi cấy ko thể dùng pp trực tiếp đặc biệt với nấm mốc •PP gián tiếp dựa trên xác định sự tiêu thu cơ chất hay sự

Bài 2

Sinh trưởng của VSV

Định nghĩa sinh trưởng

• Sinh trưởng- đáp ứng của VSV đến điều kiện hóa lí của môi trường

• Là kết quả của sự sinh sản và thay đổi kích thước

Các phương pháp xác định mật

độ tế bào

1 Hemocytometer –Buồng đếm hồng cầu

• Phương pháp trực tiếp dùng kính hiển vi

• Giả thiết: từ 1 TB sống tạo 1 khuẩn lạc

• Kết quả thể hiện CFU /mL (colony forming unit)

3 Particle counters – Đếm hạt

• Đếm tất cả TB (sống và chết)

• Phù hợp cho phân biệt TB ko sống trong MT

• Có thể phân biệt TB có kích thước khác nhau

Buồng đếm hồng cầu

Sâu 0.02 mm

Một ô lớncó 25 ô nhỏ diện tích 0.04mm 2

Cách tính: Số TB/ml=Số TB trong 1 ô lớn /0.0008*10 3

Phương pháp đĩa thạch

Coulter particle counter

Các phương pháp xác định trực

tiếp sinh khối TB

1 Sinh khối khô -Dry cell weight (DCW)

trong 24h

• Là pp off-line; pp cân sinh khối ướt wet

cell weights (WCW) có thể thực hiện

on-line

2 Thể tích sinh khối - Packed cell volume

• Giống sinh khối ướt nhưng đo thể tích

sinh khối ướt

3 Đo quang độ đục – Optical density OD

• Đo độ đục do sự hấp phụ ánh sáng của

TB trong MT

Các phương pháp xác định gián

tiếp sinh khối TB

•Trong nhiều quá trình nuôi cấy ko thể dùng

pp trực tiếp đặc biệt với nấm mốc

•PP gián tiếp dựa trên xác định sự tiêu thu

cơ chất hay sự tạo thành sản phẩm

• Các thành phần nội bào như RNA, DNA và

Cơ chất + tế bào → Sản phẩm ngoại bào +

Tế bào tăng

∑ S + X→ ∑ P + nX

•Các thông số quan trọng trong sinh trưởng

 Sinh khối: nồng độ sinh khối, tốc độ sinh

trưởng, tốc độ sinh trưởng riêng

 Cơ chất: nồng độ cơ chất, tốc độ tiêu thụ cơ chất, tốc độ tiêu thụ cơ chất riêng

 Hiệu suất sinh trưởng: sinh khối thu được trên

cơ chất tiêu thụ

 Sản phẩm: nồng độ sản phẩm, tốc độ tạo

thành sản phẩm

TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG RIÊNG

Tốc độ sinh trưởng quan hệ trực tiếp với nồng độ

tế bào (sinh khối)

• Được đặc trưng bởi tốc độ sinh trưởng riêng

(specific growth rate)

Định nghĩa : Tốc độ sinh trưởng riêng (specific

growth rate): tốc độ tạo thành sinh khối trên một đơn vị sinh khối trong một đơn vị thời gian 

t- thời gian, h

X - nồng độ sinh khối g L-1

net - tốc độ sinh trưởng riêng xác định được h-1

TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG

i net

t µ i

net i

t net X

X net

t t

X

X µ

e X X

t

µ X

X dt

µ X

dX dt

µ X

ln

0

X- nồng độ sinh khối tại thời điểm t, g.L-1

X i- nồng độ sinh khối ban đầu, g.L -1

µ net- tốc độ sinh trưởng riêng, h -1

t – thời gian, h

TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG RIÊNG

t X

X

e X X

net i

t

µ i

Đồ thị phụ thuộc logarit tự nhiên của nồng độ sinh khối với thời gian là đường thẳng

TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG RIÊNG

Thời gian nhân đôi (generation time): Là thời gian cần thiết để tăng đôi sinh khối hay số lượng tế bào

tg (h)

Trong đó

Xtg- sinh khối tại thời điểm tg

Xo-sinh khối tại thời điểm ban đầu

net

g g

net g

net o

t t

µ t

µ X

X



693

0 2

• Sinh trưởng của VSV cũng có thể xác định thông qua số lượng tế bào N

(h-1)

dt

dN N

R

1





CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG SINH TRƯỞNG

Ảnh hưởng của nhiệt độ

A RT

Theo mô hình: khi nhiệt độ tăng thì max tăng

Tuy nhiên chỉ đúng trong khoảng nhiệt độ có giới hạn

Năng lượng hoạt hóa của phản ứng bất hoạt 60-80 kcal/mol lớn hơn năng lượng hoạt hóa của phản ứng sinh trưởng 10-20 kcal/mol

A RT

E k

A- các phản ứng phục vụ sinh

trưởng g

B- phản ứng gây chết kd

C- sinh trưởng của TB net

Tốc độ sinh trưởng của

E coli ở nhiệt độ khác nhau

 - MT giàu dinh dưỡng

 - MT muối

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ảnh hưởng của pH

Các phương thức nuôi cấy

• Trong nuôi cấy gián đoạn (Batch): khép kín

• Trong nuôi cấy liên tục (Chemostat): mở

• Trong nuôi cấy có cấp dinh dưỡng batch): nửa khép kín

(Fed-A Động học sinh trưởng của

VSV trong nuôi cấy gián đoạn

• Nuôi cấy gián đoạn: hệ thống khép kín Dinh dưỡng cấp 1 lần

• Sinh trưởng VSV trong nuôi cấy gián đoạn: 6 pha

Các pha sinh trưởng

1 Tiềm phát

2 Pha tăng trưởng

3 Pha log

4 Pha chậm dần

5 Pha cân bằng

6 Pha diệt vong

Pha tiềm phát

Lag- pha tiềm phát : ngay sau khi cấy giống,

tế bào thích nghi với môi trường xung quanh , chuẩn bị cho sinh sản

– TB có thể tăng về kích thước hay thể tích

nhưng không tăng về số lượng

– Có thể bị kéo dài nếu cấy ít giống, giống chất lượng kém, hay MT nghèo dinh dưỡng

Giai đoạn này tốc độ sinh trưởng riêng

net = g = k d =0

Ảnh hưởng của nồng độ Mg đến thời gian

pha lag

Chủng E aerogenes

Pha tăng trưởng

Bắt đầu sinh sản đầu tiên cho đến khi bắt đầu sinh trưởng với tốc độ sinh trưởng lớn nhất

net = g – kd

g tăng

kd << g  net tăng

Pha logarith

TB sinh trưởng với tốc độ không đổi, lớn

dinh dưỡng (thừa) Giai đoạn này chỉ kéo dài đến khi thiếu cơ chất, oxi, tác dụng kìm hãm của sản phẩm TĐC

net = g – kd = max

Trong giai đoạn log dinh dưỡng thừa và

nhất và không đổi µ max

Pha sinh trưởng giảm dần

• Tốc độ sinh trưởng giảm dần và dừng hẳn

– Do thiếu dinh dưỡng

– Sự lích lũy các sản phẩm có độc tính

– Do cả 2

• net = g – k d giảm

• Sự giảm tốc độ sinh trưởng do giảm dinh dưỡng được mô tả bằng động học Mono

s s

dX K

S

S µ

• K s nhỏ - VSV có ái lực đến cơ chất rất

cao, tốc độ sinh trưởng không bị ảnh

hưởng cho tới khi S rất nhỏ→giai đoạn

chậm dần ngắn

thấp, tốc độ sinh trưởng bị ảnh hưởng

ngay khi S còn tương đối cao→ giai đoạn chậm dần khá dài

VSV Nhiệt độ

sinh trưởng

Cơ chất bị giới hạn

µ max và Ks phụ thuộc vào:

Đặc tính của VSV; cơ chất bị giới hạn và nhiệt độ sinh trưởng

Pha cân bằng

Khi tốc độ sinh trưởng =0,cân bằng số CFU hay sinh khối không đổi

– không có sự tăng trưởng về mặt số lượng VSV

– Trao đổi chất vẫn tiếp tục, có thể sản xuất SP trao đổi chất bậc 2→KQ giảm TDC

– Tế bào trong pha cân bằng thường nhỏ và tròn

hơn trong pha log

– Trao đổi chất nội sinh (endogenous metabolism): hiện tượng sinh trưởng trên tế bào chết

• Số TB sống giảm nhưng sinh khối có thể

ko thay đổi

• Có thể có pha sinh trưởng 2 do sinh

trưởng trên TB chết (hiện tượng lysis)

• Mô hình mô tả sự chuyển sinh khối thành năng lượng hay sự giảm TB trong pha cân bằng do sự phá vỡ TB

• dX/dt = -k D X

• Giai đoạn cân bằng: tốc độ sinh trưởng

net =0 hay g = k d

• Giai đoạn diệt vong: tế bào bị phá vỡ và trở

thành dd cho các TB khác

• Pha diệt vong: suy giảm số CFU

dX/dt = -k D X kD: tốc độ diệt vong Chú ý: nếu đo đường cong sinh trưởng bằng OD,

ta sẽ không nhận ra pha diệt vong

Pha diệt vong

1 Tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất ở pha

sinh trưởng nào trong sinh trưởng gián đoạn?

2 Tốc độ sinh trưởng riêng bằng 0 ở pha

sinh trưởng nào trong sinh trưởng gián đoạn?

3 Mô hình Mono đúng cho giai đoạn sinh

4 Mô hình Mono cho sinh trưởng đúng cho

trường hợp nào?

a Thiếu dinh dưỡng

b Ức chế bởi sản phẩm tạo thành?

c Cả 2

Các dạng sinh trưởng

thường gặp

logX

Time

1

1 Dạng thường gặp có pha giảm tốc sau pha sinh trưởng log

2 Không có pha giảm tốc độ sinh trưởng

3 Tốc độ sinh trưởng giảm dần

4 Phát triển trên canh trường nhiều cơ chất

• Quá trình thích nghi và tăng tốc ko phải lúc nào cũng thấy

• Quá trình thích nghi sẽ rút ngắn nếu TB đang phát triển log chuyển ngay sang MT

có thành phần tương tự và điều kiện nuôi cấy tương tự

1 Loại kèm theo giảm tốc, nguyên nhân

2 Đôi khi giai đoạn log bị dừng đột ngột và

chuyển ngay sang pha cân bằng bỏ qua pha giảm tốc

– Do VSV sinh trưởng trên MT tối thiểu

bé (ái lực với cơ chất rất lớn) nên TB

sinh trưởng với tốc độ lớn nhất đến khi

cơ nhất còn lại ít và quá trình giảm tốc xảy ra rất ngắn, ko quan sát được

3 Tốc độ sinh trưởng giảm liên tục, ko có

pha log ổn định thường trong MT tổng

hợp do TB xử dụng nguồn cơ chất theo

thứ tự từ dễ đến khó

phần cơ chất này bị hết và enzym cảm

ứng sẽ sản xuất và sự sinh trưởng sẽ tiếp tục trên cơ chất khác

Bài tập 1

CFU/mL Thời gian nhân đôi 2h Hãy tính

số tế bào trong canh trường sau 4h, 24h

và 48h nuôi cấy (Giả thiết TB sinh trưởng

ở pha log)

Bài tập 2

Time(h) OD600

0 0,09 0,5 0,15

1 0,25 1,5 0,35

2 0,55

Tính tốc độ sinh trưởng lớn nhất và thời gian nhân đôi tế bào

\Baigiangcaohoc2009\Growthrate.xlsx

Bài tập 3

Số liệu thu được khi

Pseudomonas nuôi cấy

trên môi trường tối thiểu

chứa salicylate như

nguồn C và năng lượng

duy nhất như sau Hãy

suất sinh trưởng)

3 Hãy tính nồng độ sinh khối lớn nhất thu được nếu

nồng độ đường ban đầu là 150g/L với cùng lượng

giống ban đầu

Nồng độ glucoza (g/L)

Bài tập 5

• Tế bào nấm men sinh trưởng từ 19 kg SK

– Giả thiết trong suốt giai đoạn này tế bào sinh

trưởng log Hãy tính tốc độ sinh trưởng riêng

– Hãy tính thời gian nhân đôi sinh khối trong pha

sinh trưởng log

– Trong khi đó 81 g glycerol được tiêu thụ cho 1L dịch lên men Hãy xác định hệ số sản lượng

sinh khối (hiệu suất sinh trưởng) thu được từ glycerol

• 1 cơ chất: Glucose 30g/L

• 2 cơ chất 15g/L glucose và 15 g/L lactose

• Tìm thời gian thích nghi.Tính tốc độ sinh

• Tính sản lượng sinh khối thu được trên cơ chất glucose (hiệu suất sinh trưởng) biết 0.175OD=0.1mg CDW

• \Baigiang2009\Book1.xlsx

Bài tập 6

Thời

gian

(h)

OD Sinh trưởng trên 1 cơ chất

OD Sinh trưởng trên 2 cơ chất

OD Sinh trưởng trên 1

cơ chất

OD Sinh trưởng trên 2

cơ chất

5 1.05 0.49 5.5 1.05 0.51

6 1.06 0.53 6.5 1.06 0.61

7 1.08 0.85 7.5 1.08 1.04

8 1.08 1.04

Quá trình tỏa nhiệt khi sinh

trưởng

40-50% năng lượng từ quá trình TDC chuyển sang ATP, còn lại thoát ra dưới dạng nhiệt Lượng nhiệt thoát ra liên quan trực tiếp đến sinh trưởng

Cân bằng nhiệt khi sử dụng cơ

Giá trị H thường là: glucose 0,4 g/kcal; acetate 0,21 g/kcal; ethanol 0,18 g/kcal; methanol, 0.12 g/kcal; methane, 0.061 g/kcal

ΔHC cho TB VK 20-25 kJ/g cells

• Nhiệt tỏa ra trong qt lên men có thể được lấy đi bởi nước lạnh bằng cách tuần hoàn qua các ruột gà trong TB lên men hay vỏ

áo

HIỆU SUẤT SINH TRƯỞNGYX/S

Trong đó

Y X/S- yield coefficient - hiệu suất sinh trưởng (hệ

số thu hoạch sinh khối trên cơ chất tiêu thụ [kg kg

-1] thường 0.4-0.6 g/g đ/v E coli và nấm men)

X, X o - lương sinh khối tạo thành tại thời điểm t và

ban đầu [kg m -3 ]

S, S o - nồng độ cơ chất tại thời điểm t và ban đầu

[kg m -3 ]

• Cuối lên men gián đoạn thu được hiệu

suất sinh trưởng quan sát được- không

phải là giá trị thực

• VD: glucose vừa là nguồn C vừa là nguồn năng lượng

∆S= ∆Schuyển thành sinh khối+ ∆Schuyển thành sản phẩm

ngoại bào+ ∆Snăng lượng sinh trưởng+ ∆Snăng lượng

duy trì

• Hệ số duy trì: tốc độ tiêu thu cơ chất để duy trì tế bào

• Trong pha cân bằng do ít cơ chất nên hô hấp nội sinh trên TB để duy trì sự sống cho TB

X

dt dS

m   [ / ]m

TỐC ĐỘ TIÊU THỤ CƠ CHẤT

• Định nghĩa: tốc độ tiêu thụ cơ chất riêng

là tốc độ tiêu thụ cơ chất trên một đơn vị sinh khối trong một đơn vị thời gian (kí

hiệu là q S h-1)

X

q dt

dS X

dt dS

Tốc độ tiêu thụ cơ chất riêng qS

X Y

dt

dS dt

dX Y

dt

dX dX

dS

Y dX

dS S

S

X

X Y

g S

X S

X

X/S i

i s

g g

S X

s

Y

q X

Tốc độ tiêu thụ cơ chất phụ thuộc vào:

• Hiệu suất sinh trưởng

• Tốc độ sinh trưởng

• Nồng độ sinh khối

X Y

X

q dt

dS

g S

• Bài tập: Cho biết =0.35h-1, YX/S=0.6, hãy tính qS

• Bài giải: qS= /YX/S =0.35/0.6=0.48 g/gh-1

SẢN PHẨM TẠO THÀNH

• Chia ra 3 loại

– (a) Sản phẩm tạo thành liên quan sinh trưởng (growth dependent) hay SP TDC bậc 1: tạo thành trong quá trình sinh trưởng

– (b) Hỗn hợp: tạo thành trong pha sinh trưởng giảm dần và pha cân bằng SP hỗn hợp

thường tạo thành khi sinh trưởng chậm dần hay pha cân bằng như axit lactic

(c) Sản phẩm tạo thành không liên quan sinh trưởng (non-growth dependent) hay SP TDC bậc 2: tạo thành gần cuối pha sinh trưởng, thường là trong pha cân bằng SP ko gắn với sinh trưởng thường tạo thành trong pha cân bằng khi tốc độ sinh trưởng =0 (thí dụ kháng sinh)

Động học sinh trưởng và SP tạo thành

trong sinh trưởng gián đoạn

Quá trình lên men cồn (SP bậc 1)

Tốc độ tạo thành sản phẩm

X

q dt

dP X

q P h-1)

•Phụ thuộc vào sinh khối

Mô hình Luedeking-Piret

q p =g + ß

, ß-hằng số thể hiện mức độ phụ thuộc vào sinh

trưởng

• Nếu ß=0 thì ta có mô hình sản phẩm phụ thuộc

sinh trưởng (a) Nếu sản phẩm gắn với sự sinh trưởng, tốc độ tạo thành sản phẩm riêng gắn với tốc độ sinh trưởng: TD sinh khối và enzym

không cảm ứng

• =0 thì sản phẩm không phụ thuộc sinh

trưởng khi đó q p = ß (c)

thuộc sinh trưởng

Mô hình toán học qP (growth

dependent)

X Y

dt

dP X

dt

dP Y

dt

dP dP

dX

Y dP

dX P

P

X

X Y

g P

X

g X/P

X/P o

o P

g X

P g

P X

Mô hình toán học qP (growth

P

S S

P o

o S

P

q Y

q

X q

Y dt

dS dS

dP S

S

P

P Y

*

/ /

• Muốn tăng sản phẩm là SPTĐC bậc 1:

giai đoạn logarith

• Đối với sản phẩm là SPTĐC bậc 2, sản phẩm ko gắn liền với tốc độ sinh trưởng

mà gắn liền với nồng độ sinh khối→ kéo dài thời gian sản xuất SP

X Y

dt

dP

g P

Cân bằng vật liệu trong thùng nuôi cấy gián đoạn

Tốc độ tạo thành sinh khối dX/dt

Trong pha lag dX/dt = 0 do g = k D =0