Trên cơ sở khoa học và các thực nghiệm đã được tiến hành, phân tích khả năng chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen (đv, TV và VSV) sang hệ vi sinh vật ở người và vật nuôi

Cơ sở khoa học của việc chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen sang hệ vi sinh vật ở người và vật nuôi 1.. Khả năng chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen vào hệ vi s

Nội dung

I Mở đầu

II Cơ sở khoa học của việc chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen sang hệ vi sinh vật ở người và vật nuôi

1 Hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT)

1.1: Khái niệm

1.2: Lịch sử phát hiện chuyển gen ngang

2 Cơ chế của HGT

2.1: Biến nạp

2.2: Tải nạp

2.3: Tiếp hợp

3 Bằng chứng chứng minh HGT xảy ra trong tự nhiên

III Khả năng chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen vào hệ

vi sinh của người và đông vật

1 DNA tái tổ hợp

2 Nguy cơ của việc chuyển thành công đoạn DNA tái tổ hợp từ GMO sang hệ vi sinh ở người và động vật

3 Các rào cản của quá trình chuyển đoạn DNA tái tổ hợp vào hệ vi sinh vật ở người và động vật

4 Phương pháp để phát hiện đọan DNA tái tổ hợp đã được chuyển nạp thành công vào vi sinh vật

5 Ví dụ kiểm tra về khả năng chuyển gene ngang

IV Kết luận

I Mở đầu

Như chúng ta đã biết, dân số thế giới đang ngày một tăng, diện tích đất lại ngày một giảm, bệnh tật thì ngày một nhiều và phong phú hơn…

Bởi vậy, con người đang phải ngày ngày đối mặt với rất nhiều vấn đề cấp bách hiện nay như : an ninh lương thực-thực phẩm, bệnh tật, nguyên-nhiên liệu…

Để giải quyết vấn đề này, khoa học-kỹ thuật đang ngày càng phát triển, đặc biệt, thế kỷ XXI, thế kỷ của công nghệ sinh học hiên đại Ngày nay, công nghệ sinh học đang được ứng dụng vào trong rất nhiều các lĩnh vực của cuộc sống: công nghiệp, nông nghiệp, y học Bằng những kiến thức sinh học về thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn, và sử dụng

"công nghệ DNA tái tổ hợp" những nhà khoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất, chất lượng cao, những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho con người

Công nghệ DNA tái tổ hợp đáp ứng được rất nhiều nhu cầu của nhân loại, nhưng đến nay vẫn còn nhiều điều chưa chắn chắn về nguy cơ

mà nó đem lại, đặc biệt là hiện tượng chuyển gen ngang Nhưng mặt khác, tuy chưa có thí nghiệm cụ thể nào về việc chuyển gen ngang từ sinh vật biến đổi gen (GMO) sang hệ vi sinh của người và động vật, nhưng GMO vẫn được đánh giá là an toàn Trong báo cáo tổng kết 10 năm nghiên cứu về an toàn sinh học cây trồng CNSH của EU kết luận: Các loại cây trồng và các sản phẩm công nghệ sinh học thậm chí còn an toàn hơn so với các cây trồng và các sản phẩm được tạo ra bằng các phương pháp truyền thống thông thường GMO luôn được các tổ chức như Hội đồng khoa học quốc tế (ICSU) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thường xuyên giám sát và kiểm chứng

Khoa học luôn gắn liền với thực tiễn, nguy cơ của nó cũng luôn bắt đầu bởi tự nhiên, hiện tượng chuyển gen ngang cũng vậy Người ta suy nghĩ đến vấn đề này là do trong thực tế, hiện tượng chuyển gen ngang xảy ra rất nhiều Vậy, lý do từ đâu mà các nhà khoa học có thể cho rằng, công nghệ DNA tái tổ hợp là an toàn đối với chuyển gen ngang từ GMO sang hệ vi sinh của người và động vât, phần dưới đây, nhóm 8 xin phép được đi tìm hiểu vấn đề này

II Cơ sở khoa học của việc chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen sang hệ vi sinh vật ở người và vật nuôi

Đây chính là nguyên nhân bắt nguồn cho việc nghi ngờ DNA tái tổ hợp có khả năng được chuyển từ GMO sang hệ vi sinh vật ở người và động vật

1 Hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT) 1.1: Khái niệm

Chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT) hay trao đổi gen theo hàng ngang là sự chuyển các gen giữa các sinh vật không phải

họ hàng hoặc không thông qua giao phối Trao đổi gen hàng ngang khác với trao đổi gen hàng dọc (vertical gene transfer), tức là sự tiếp nhận các gen từ thế hệ cha mẹ (hay gọi là di truyền)

HGT đã được chứng minh là một yếu tố quan trọng trong sự phát triển của nhiều sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn Chúng có khả năng tiếp

Chuyển gen ngang rất phổ biến ở các loài vi sinh vật

nhận gen từ các sinh vật khác để thích nghi với môi trường thay đổi nhanh chóng xung quanh Sự thay đổi nhanh chóng của vi khuẩn tạo cho chúng một khả năng gây ra bệnh mới, hoặc tái phát bệnh cũ

1.2 Lịch sử phát hiện chuyển gene ngang

Chuyển gen ngang đã được mô tả đầu tiên ở Seattle vào năm 1951:

sự chuyển giao một gen của virus vào Corynebacterium diphtheriae đã

tạo ra mối nguy hiểm từ một chủng không độc hại

Chuyển gen giữa vi khuẩn đã được mô tả lần đầu tiên ở Nhật Bản năm 1959 trong một công bố chứng minh việc chuyển gen kháng kháng sinh giữa các loài vi khuẩn vi khuẩn

Vào giữa những năm 1980, Syvanen dự đoán rằng chuyển gen ngang tồn tại, có ý nghĩa sinh học, và đã tham gia vào việc định hình lịch sử tiến hóa từ bắt đầu cuộc sống trên Trái đất

Như Jain, Rivera and Lake (1999) đã nói: "Ngày càng có nhiều nghiên cứu về gen và chúng chỉ ra rằng chuyển gene ngang đã xảy ra đáng kể giữa prokaryote" (Lake và Rivera, 2007)

Có một số bằng chứng cho thấy thực vật và động vật bậc cao đã bị ảnh hưởng và điều này đã dấy lên lo ngại về an toàn (Richardson và Palmer (2007))

Do số lượng ngày càng tăng của bằng chứng đã cho thấy tầm quan trọng của những hiện tượng này đối với tiến hóa Peter Gogarten đã mô

tả sự chuyển gen ngang là "một mô hình mới cho Sinh học"

-> Quá trình này có thể là một mối nguy hiểm tiềm ẩn của kỹ thuật

di truyền vì nó có thể cho phép chuyển gen DNA để lây lan từ loài này sang loài khác

2 Cơ chế của HGT

Trong tự nhiên, HGT xảy ra theo 3 cơ chế chính: Biến nạp, tải nạp

và tiếp hợp

a) Biến nạp

Biến nạp là hiện tượng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn

Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA,

đó là “trạng thái khả nạp”

Khả nạp tự nhiên là khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trường sống Nguồn DNA này có được từ các tế bào chết hay các tế bào

bị phân hủy Kết quả thu được là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có khả năng di truyền

Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dưỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng như đặc tính sinh lý sinh hóa, màng

tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và nhận được sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào

Hệ thống vận chuyển này được hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số protein màng

+ Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng được hoạt hoá Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA

+ ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào

+ ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào

+ ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để đưa sợi DNA mạch đơn vào tế bào

Trong quá trình chuyển nạp, sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl của ComEA và được phân ra thành những đoạn dưới tác động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới được cắt ra này được đưa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào

Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng như các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kích hoạt sự phiên mã ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã

Sự biểu hiện của ComK được quy định bởi một mạng lưới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB ComK được điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, được hoạt hoá dương bởi AbrB, sinR, DegU

b) Tải nạp

Tải nạp là quá trình trong đó DNA của vi khuẩn được chuyển từ một vi khuẩn này sang vi khuẩn khác nhờ virus của vi khuẩn (thực khuẩn thể, bacteriophage, thường gọi là phage) Nó cũng đề cập đến quá trình theo đó DNA ngoại lai được đưa vào tế bào khác thông qua một vector virus Tải nạp không cần tiếp xúc vật lý giữa các tế bào mất DNA và tế bào nhận được DNA

Thực khuẩn thể thường có phổ ký chủ tương đối hẹp, còn virus mà

có thể lây nhiễm cho cả thực vật và vi khuẩn thì chưa được xác định nên khả năng làm trung gian chuyển gen ngang giữa thực vật và vi khuẩn là tương đối thấp

Khi thực khuẩn thể xâm nhiễm tế bào vi khuẩn, nó lợi dụng bộ máy sao chép DNA của vi khuẩn chủ để tạo ra nhiều bản sao DNA hay RNA của chính nó Những bản sao DNA hay RNA của thực khuẩn thể này sau đó được "đóng gói" vào vỏ virus cũng mới được tổng hợp nhờ tế bào chủ

Tuy nhiên, trong quá trình đóng gói DNA của thực khuẩn thể, ở một tần suất thấp, một số mảnh DNA của vi khuẩn chủ cũng bị đóng gói vào vỏ thực khuẩn thể

Khi ly giải tế bào, những virion bị đóng gói nhầm có thể gắn vào một vi khuẩn khác và bơm phần DNA được đóng gói vào tế bào, và như vậy vô tình đã chuyển DNA vi khuẩn từ tế bào này sang tế bào khác

c) Tiếp hợp

Tiếp hợp chuyển giao DNA qua trung gian plasmid hoặc

transposon , đòi hỏi sự tiếp xúc giữa tế bào với tế bào Tuy nhiên, tiếp hợp cũng có thể xảy ra giữa các vi khuẩn có quan hệ xa hay thậm chí giữa vi khuẩn với các tế bào Eukaryotic, phương pháp này có thể chuyển các đoạn DNA dài

Tuy nhiên, các trình tự di động mà hỗ trợ cho việc chuyển gen từ thực vật bậc cao sang vi khuẩn lại chưa được biết đến và những transposons có chức năng trong cả thực vật và vi sinh vật cũng chưa được xác định nên khả năng chuyển gen ngang từ thực vật sang vi sinh vật được xem là rất thấp

Trong tế bào cho, ADN của plasmid được mở bung ở điểm

mầm oriV, sau đó 1 sợi ADN (sợi dương) được chuyển giao qua cầu tiếp

hợp sang tế bào nhận theo chiều kim đồng hồ (sợi 5’ luồn qua trước)

Cùng đúng với thời điểm chuyển giao sợi dương, ngay trong vi khuẩn cho, sợi ADN còn lại (sợi âm) chịu trách nhiệm làm khuôn để tổng hợp ngay lập tức sợi bổ sung cho nó (tổng hợp sợi dương) để tạo nên vòng plasmid mới Trong tế bào nhận, sợi ADN vừa được chuyển sang (sợi dương), cũng ngay lập tức làm khuôn để tổng hợp sợi bổ sung (tổng hợp sợi âm) để hình thành vòng ADN của plasmid mới cho tế bào nhận

ADN được tổng hợp theo cơ chế bổ sung ở cả 2 tế bào theo chiều trượt 5´ >3´

3 Bằng chứng chứng minh HGT xảy ra trong tự nhiên

Trong thiên nhiên, việc hoán chuyển gen giữa các sinh vật cùng loài hay khác loài, giữa vi khuẩn, động vật và thực vật cũng xảy ra trong tiến trình sinh vật tiến hóa trong hơn 3 tỉ năm qua Chẳng hạn, gen kháng thuốc trụ sinh được hoán chuyển rất nhanh giữa 2 cá thể vi khuẩn

để chúng trở thành vi khuẩn kháng trụ sinh

Gen cũng được chuyển từ giống cây này qua loài cây khác qua trung gian của vi khuẩn, virus để tạo ra nhiều loài, giống mới, chưa kể qua thụ phấn thiên nhiên

Trong kết quả nghiên cứu được đăng tải trên tạp chí Nature, các nhà sinh vật

học Mỹ tại Đại học Texas

đã phát hiện một sự chuyển giao ngang nguyên liệu gen (transporon) từ một loài bọ hút máu ở Nam Mỹ và vật chủ ký sinh là một con ốc sên

III Khả năng chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen vào hệ vi sinh của người và đông vật

Vậy, DNA tái tổ hợp là gì? Nếu nó được chuyển vào hệ vi sinh của người và động vật thì điều gì sẽ xảy ra? Có rào cản nào ngăn cản quá trình này hay không?

1 DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự DNA của các loài sinh vật khác nhau

Loài cây ký sinh Rafflesia

cantleyi Malaysia đã đánh

cắp gen từ cây

Tetrastigma rafflesiae ký

chủ của nó => cải thiện khả năng ký sinh để trích xuất các chất dinh dưỡng

từ ký chủ, hoặc giúp nó trốn tránh sự đề kháng của

ký chủ

Trong kỹ thuật di truyền, DNA tái tổ hợp thường được tạo thành từ việc gắn những đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng

Về mặt lý thuyết, kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép đưa bất kỳ một gen nào đó từ một sinh vật này vào một sinh vật khác Vấn đề quan trọng là làm sao để gen ngoại lai có thể biểu hiện trong cơ thể vật chủ

Để biểu hiện được gen ngoại lai, DNA tái tổ hợp phải có đầy đủ các cấu trúc cần thiết sau:

+ Gen chỉ thị: để xem gen đã được chuyển vào chưa

+ Promoter: kiểm soát quá trình phiên mã, cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng

+ Polylinker (vị trí cắt của enzyme giới hạn): đưa gen ngoại lai vào trong theo một hướng chính xác với promoter ( nếu đoạn gên ngoại lai không nằm giữa trình tự promoter và trình tự kết thúc thì gen sẽ không được phiên mã)

2 Nguy cơ của việc chuyển thành công đoạn DNA tái tổ hợp từ GMO sang hệ vi sinh ở người và động vật

Về lý thuyết, nếu quá trình này thành công thì sẽ gây ra rất nhiều hậu quả:

Thứ 1: Nếu gen chỉ thị là các gen kháng kháng sinh => tạo ra các loại vi sinh vật kháng kháng sinh

Thứ 2: Tăng khả năng gây bệnh và hoạt hóa sự gây bệnh của các vi sinh vật

Ví dụ: Một cơn bộc phát nhiễm trùng thức ăn mới đây bên Đức (Germany) cho thấy khả năng kết hợp hai loại gen vào trong vi khuẩn E Coli: Một loại gen tạo ra một chất độc và một loại khác giúp cho con vi khuẩn có khả năng bám chặt vào ruột của bệnh nhân, kích thích bệnh nhân tiếp thu chất độc ấy nhanh hơn Kết quả là sự nhiễm độc này nguy hiểm hơn các lần nhiễm độc khác, và có thể dẫn tới suy thận

Thứ 3: Tăng khả năng vượt qua các rào cản loài => mở rộng phạm

vi gây bệnh

Ví dụ virus lợn sẽ nhiễm vào lợn nhưng không nhiễm vào người được, và virus súp-lơ không thể tấn công vào cây cà chua được Tuy nhiên, công nghệ di truyền sản xuất các vector nhân tạo (mang các gen ngoại lai) được thiết kế lại để khắc phục các rào cản, vì thế các vector này sau đó có thể gắn vào các gen người để chuyển vào tế bào của tất cả động vật có vú khác, hoặc tế bào thực vật…

Tuy nhiên, trong thực tế, những nguy cơ này vẫn chưa được một nghiên cứu nào chứng minh là có xảy ra mà nó mới chỉ dừng lại ở mức

độ giả thuyết Nguyên nhân được đặt ra là do có các rào cản trong suốt quá trình từ lúc GMO được đưa vào cơ thế người và động vật qua đường tiêu hóa cho tới khi nó được biểu hiện trong cơ thể vi sinh vật có trong đường tiêu hóa

3 Các rào cản của quá trình chuyển đoạn DNA tái tổ hợp vào hệ vi sinh vật ở người và động vật

* Rào cản thứ 1: Sự phá vỡ cấu trúc DNA trong suốt quá trình

biến đổi thức ăn trước khi được tiêu hóa và trong quá trình vận chuyển chúng trong hệ thống tiêu hóa

Con người thường tiêu thụ tối tiểu là 0,1 đến 1g DNA/ngày trong chế độ ăn uống của mình (Doerfler,2000) Các gene chuyển có trong 1 cây CNSH lại không phải là một loại vật liệu mới đối với hệ thống tiêu hóa cho nên chúng cũng bị tiêu hóa như bình thường

Các test invitro về khả năng tiêu hóa được tiến hành trên protein CP4 EPSPS cho thấy enzyme này bị phân hủy nhanh chóng trong các phản ứng kiểm tra trong hệ tiêu hóa (Harrison và cs.,1996) (30 giây ở dịch ruột và dịch tiêu hóa của người)

Trong điều kiện invitro, DNA plasmid mang gen kháng ampicilin được xử lý với nước bọt của cừu có khả năng chuyển vào E.coli sau 24h