CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC BẰNG VSV TÁI TỔ HỢP BẰNG VSV TÁI TỔ HỢP ((recombinant microorganisms

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC BẰNG VSV TÁI TỔ HỢP... Tính chất quan trọng : protein tái tổ hợp là sản phẩm sơ cấp của tế bào được tạo ra trong giai đọan tăng trưởng của tế bào

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC

BẰNG VSV TÁI TỔ HỢP

Production by recombinant microorganisms

 Sản phẩm

(components of diagnostic test)

protein làm tan huyết khối , hormones tăng trưỏng , antigen tumors- kháng nguyên từ tế bào ung thư, kháng thể đơn dòng )

 Products from animal cell culture

with permission of Prof Enfors, KTH, Stockholm

Tính chất quan trọng : protein tái tổ hợp là sản phẩm sơ cấp của tế bào được tạo ra trong giai đọan tăng trưởng của tế bào Phase tăng trưởng và phase tạo sản phẩm của tế bào có thể được phân biệt bằng cách sử dựng các inducable promoters

with permission of Prof Enfors, KTH, Stockholm

 Những ưu điểm của proteins tái tổ hợp

2 Ít tốn công sức (ChỈ cần một phần tử của virus

3 Năng suất sản xuất cao ( Nuôi ở qui mô lớn với năng suất cao

4 Không cần phải thử nghiệm trên cơ thể người hay động vật

5 Sản xuất được các Protein dùng trong nghiên cưu cấu trúc và chức năng tế bào

Những kiểu nuội cấy

* Nuôi cấy từng mẻ (batch culture): dùng trong trường hợp sản phẩm được thu hoạch trước khi phase cân bằng xảy ra

*Nuôi cấy mẻ có bổ sung dưỡng chất (Fed

batch): Nuôi cấy có bổ sung dưỡng chất trong phase tăng trưởng cấp số

* Nuôi cấy liên tục (Continuous): Kiểu này ít

được sử dụng vì tính chất sinh lý của tế bào

trong phase cực đại

Nuôi cấy từng mẻ (batch culture)

Nuôi cấy mẻ có bổ sung dưỡng chất (Fed batch)

Các kiểu reactor

Pha trộn và thông khí tốt nhưng thường làm tế bào bị phá

vở ( tế bào bị ly giải, giãm khả năng sinh tổng hợp, làm gia tăng nhiều polisaccarid là tăng độ nhớt của môi trường gây khó khăn trong việc vận hành qui trình lên men

• Kiểu cột có thổi bọt khí (Air lift & bubble

columns):

Tuy ít làm tế bào bị tổn thương nhưng lại tạo nhiều bọt dễ gây nhiễm và khó làm các thành phần dinh dưỡng được hoà trộn đều

Kiểu khuấy đảo (Stirred tank reactor)

Kiểu cột có thổi bọt khí (Air lift & bubble columns)

Kiểu khuấy đảo

Kiểu thổi bọt khí

Những sinh vật được tái tổ hợp gen

E.coli, dễ nuôi cấy nhưng thường tạo nội độc tố lipopolisaacarid, có enzime

protease hoạt lực cao

B subtilis, tạo những sản phẩm ngoại bào –là vi khuẩn chiụ nhiệt

(Thermotolerant bacterie), proteins bền nhiệt , Tốc độ tăng trưởng cao , nguy cơ

tạp nhiễm thấp

Pseudomonas, toxic substrate -nguy cơ tạp nhiễm thấp

.

eucaryotic, easier to culture then mammalian

Tính không ổn định của plasmid :

multimerisation)

plasmid

So sánh giữa tế bào mang plasmid và tế bào không có plasmid thì

tế bào có plasmid có sự gia tăng hoạt động biến dưỡng hơn tế bào

không có plasmid

organism (e.g epithelia, connective tissues, muscle, nerve cells, lung, liver, kidney)

primer cell culture

marker enzyme, resistance )

 The type of animal cells

 The nature of animal cells

Tế bào bị kết với chât mang Microcarriers(anchorage dependent - contact inhibition, monolayer)

Tế bào tự do dạng huyền phù suspension (anchorage

independent )

Những vi chất mang dùng cho cố định tế bào (Microcarriers for anchorage dependent cells)

 small spherical particles 100-200 mm diameter, 1.04 g/ml

 electrostatic or van der Waals forces with cell membrane

 Dextran coated with DEAE (diethylaminoethyl) - positively charged

 2-3 g/lit carrier concentration => 2-3 x 10 6 cell/ml

• agitation • aeration blended air and CO2,

bubbling can damage (silicon tubing, surface aeration)

• pH control

bicarbonate buffer - (bicarbonate: pH increase, CO2 : pH drops)

HEPES buffer

• cell maintenance

controlled gradual decrease in temperature, down to -190 o C

warming up as quickly as possible to 37 o C at right pH!

major problem: infection by virus, bacteria, fungi, mycoplasma

 Những sự khác nhau giữa tế bào động vật và tê bào vi sinh vật

 Cell culture on laboratory scale

with permission of Prof Enfors, KTH, Stockholm

(From: http://www.apbiotech.com)

(Roux- bootles)

A Batch

• limiting factors: lack of nutrients, depletion/inactivation of growth factors, surface on carrier, toxic metabolites (ammonia, lactate)

B Fed-batch

• more nutrients, but no removal of toxic metabolites

 Nuôi cấy tế bào trong các reactor

C Contunuous

Duration Volume MAb Yield Run (Days) Produced Recovered Purified Mab

Công nghệ sản xuất insulin

Giới thiệu về bệnh tiểu đường

Tiểu đường hay đái tháo đường (diabetes) là bệnh rối loạn về chuyển hóa cacbonhydrat, trong đó đường

trong máu không bị oxy hóa để sinh năng lượng mà tích tụ trong máu ở mức cao (>1,2 g/l), gọi là tăng đường huyết.

Ở những bệnh nhân tiểu đường, hàm lượng

glucose trong máu cao, làm tăng áp lực thẩm thấu, tuy

nhiên quá trình hấp thụ glucose vào tế bào lại kém Khi

hàm lượng glucose trong máu cao vượt quá ngưỡng hấp thụ của thận thì cơ quan này sẽ đào thải glucose theo

nước tiểu, dẫn đến việc nước, các ion cần thiết cho sự

trao đổi chất qua màng tế bào bị theo ra ngoài.

• Cấu trúc phân tử Insulin

Insulin là một hormon protein do các tế bào beta của tiểu đảo

angerhans trong tuyến tụy sinh ra Phân tử protein insulin tương đối nhỏ, có khối lượng khoảng 6000 Dalton (Da), được cấu tạo bởi 2 chuỗi polypeptoid A

và B Các chuỗi A và Bliên kết với nhau bằng các cầu disulfua, ngoài ra còn

có một cầu disulfua nửa nằm trong chuỗi A.

• Tổng hợp insulin trong cơ

thể

Insulin được tổng hợp bởi các

tế bào tụy beta

Đầu tiên là sự tổng hợp một

protein gọi là proinsulin

Ngay khi hình thành proinsulin được một số peptidase sẽ phân cắt

proinsulin thành insulin hoàn

• Vai trò sinh học của Insulin

Insulin là một trong những hormon điều hòa nồng độ glucose trong máu Chức năng cân bằng nội môi và năng lượng sinh học này cực kỳ quan trọng bởi vì glucose là nguồn nhiên liệu chính của hô hấp tế bào và nguồn khung cacbon quyết định cần cho tổng hợp các hợp chất hữu cơ Cân bằng trao đổi chất phụ thuộc vào việc duy trì glucose máu ở gần một điểm ổn định, khoảng 90mg/ml ở người (theo Campbell)

Vai trò sinh học của Insulin

Insulin là một trong những

hormon điều hòa nồng độ

glucose trong máu- duy trì

glucose máu ở gần một điểm

ổn định, khoảng 90mg/ml ở

người (theo Campbell)

Công nghệ sản xuất Insulin bằng kỷ thuật tái tổ hợp gen

Năm 1977 một nhóm nghiên cứu đã ghép thành công gen insulin của chuột vào vi khuẩn E coli để vi

khuẩn này sau đó đã tổng hợp insulin

Năm 1982 Tập đoàn Eli Lilly đã sản xuất được insulin người và đó là dược phẩm sản xuất bằng kỹ

thụât di truyền đầu tiên được phê chuẩn

Không cần nhờ đến các động vật, các nhà nghiên cứu đã có thể sản xuất insulin bằng kỹ di truyền với số

lượng không giới hạn Sản phẩm này cũng không chứa bất

kỳ tạp chất nào từ động vật

Sử dụng insulin người cũng phá bỏ đi mối lo ngại về các bệnh lây nhiễm tiềm tàng từ động vật.

• Ngoài vật chủ là E.coli thì hiện nay nấm men

cũng có thể được sử dụng trong sản xuất

insulin

• Phương pháp này có nhiều ưu điểm: tế bào

nấm men tạo các phân tử insulin người gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các giai đoạn tinh sạch.

Có hai phương pháp cơ bản.

tiền chất chuỗi đơn proinsulin

người, sau đó phân cắt để tao

riêng rẽ hai chuỗi A và B Hai chuỗi

A và B sau đó được trộn với nhau

và nối bằng các cầu disulfua qua

phản ứng tái oxy hóa khử nhờ một

chất oxy hóa

Sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất insulin

I.PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP PROINSULIN SAU ĐÓ PHÂN CẮT THÀNH INSULIN

insulin) của người Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 11

plasmid của E.coli bằng enzim restrictase Phải cắt gen

proinsulin và plasmid với cùng một enzym restrictase để có đầu dính phù hợp, rồi nối chúng lại bằng AND ligase.

thực hiện nhờ phương pháp như trộn với dung dịch chứa Ca2+ hoặc tạo lỗ bằng xung điện Sau quá trình biến nạp, cần chọn

• Bước 4. Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa lên men Nuối chúng trong các nồi lên men với điều kiện tối ưu Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, theo đó các chất dinh dưỡng liên tục được bổ sung để bảo đảm sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi

khuẩn được nhân lên qua nguyên phân Như vậy chỉ sau một thời gian

ngắn, sinh khối sẽ tăng lên rất nhanh và gen insulin sẽ được tổng hợp

• Bước 5. Tiền tinh sạch Sau lên men, tiến hành tách tế bào và khử trùng nhiệt Dùng lizozyme để phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipid Proinsulin được tách ra khỏi các mảnh vở tế bào bằng ly tâm và lọc

• Bước 6. Hoạt hóa bằng cách xử lý với các dung dịch đệm, giúp proinsulin đạt được cấu trúc bậc bốn, sau đó dùng enzym đặc hiệu, trypsin để phân cắt proinsulin thành insulin

• Bước 7 Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin Các nhà sản xuất tinh sạch hỗn hợp bằng các phương pháp sắc ký, tách, các kỹ thuật bộc lộ sự khác nhau về điện tích, kích thước và ái lực đối với nước của phân tử như sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lọc gel

• Phương pháp thứ hai là tổng hợp riêng rẽ hai

chuỗi A và B.

Phương pháp này sẽ tránh được việc phải

sản xuất các enzyme đặc hiệu cần thiết để

biến proinsulin thành insulin

Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ: một gen cần

cho sản xuất chuỗi A và một gen cần cho sản xuất chuỗi B Do biết được chính xác trình tự AND của mỗi chuỗi nên họ có thể tổng hợp

được hai gen nhỏ này Mỗi phân tử ADN sau

đó được chèn vào các plasmid

Các bước tiếp theo tương tự như sản xuất

proinsulin, tuy nhiên ở giai đoạn cuối, hai chuỗi

A và B sau đó được trộn với nhau và nối bằng các cầu nối disulfua qua phản ứng tái oxy

Bước đầu nghiên cứu sản xuất insulin trên hệ

thống nấm men pichia (13-03-2007)

Insulin là một trong những protein tái tổ hợp và cũng là loại dược phẩm thương mại được sản xuất sớm nhất Sản xuất insulin dựa trên công nghệ gene và công nghệ sinh học mang lại rất nhiều lợi ích và tính năng vượt trội hơn so với việc thu nhận từ động vật

Insulin được sản xuất trên nhiều hệ thống khác nhau như

tế bào E coli, tế bào Saccharomyces và ngay cả tế bào thực

vật, đều có những thành công đáng kể.

Tuy nhiên khi tạo ra insulin trên các hệ thống trên gặp một số hạn chế Novo Nordisk là một trong những công ty

hàng đầu thế giới bán insulin với chất lượng đáng tin cậy,

công ty này sản xuất insulin thương mại trên hệ thống tế bào

Saccharomyces

Nhóm nghiên cứu của Novo Nordisk tạo insulin trong hệ

thống tế bào nấm men nhưng là Pichia cho thấy hệ thống này

có nhiều ưu điểm hơn so với hệ thống Saccharomyces

•

• Hiện nay Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh đang nghiên cứu tạo ra insulin theo phương

pháp này

men Pichia Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, nhóm thực

hiện tổng hợp gene mã hóa cho insulin Hiện tại nhóm

đang tiến hành nhân dòng gene mã hóa cho insulin trên plasmid mang pBluescript

được chuyển nạp vào E coli Khi thành công quá trình

nhân dòng gene mã hóa cho insulin, gene mã hóa cho

insulin sẽ được biểu hiện trong tế bào Pichia.

chuyên biệt Tiến hành thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp Bước đầu kiểm tra hoạt tính insulin trên chuột thí

Công nghệ sản xuất interferon

(IFT)

Interferon (IFN) là các glycoprotein do các tế bào của nhiều loại động vật tiết ra để chống lại một cách không đặc hiệu sự tấn

công của các virus khác vào các tế bào cùng loại

Năm 1957 Alick Isaacs, người Scotlen và Jean Lindermann, người Thụy Điển, tại Viện Y học Quốc gia Luân Đôn, đã tiến hành tiêm virus cúm đã làm chết bằng nhiệt vào màng đệm tách rời của phôi gà, sau đó tiêm tiếp virus cúm sống vào cùng chỗ , kết quả virus cúm sống không nhân lên được, kể cả nếu tiêm các virus khác loại cũng cho kết quả như vậy

Hai ông cho rằng, sau khi tiêm lần đầu, trong tế bào nhiễm virus đã hình thành một chất ức chế và đặt tên là interferon

Các chất cảm ứng tạo thành IFN được gọi là interferonogen

IFN được tạo thành với số lượng lớn, nếu tế bào bị nhiễm virus

Tác dụng sinh học của interferon

Interferon có tác dụng ngăn cản sự nhân lên của nhiều loại virus

như cúm, sởi, sốt Dengi, xuất huyết, viêm não Nhật Bản, viêm gan, do vậy chúng được coi là chất đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong việc bảo vệ cơ thể chống sự nhiễm virus

Trong những ngày đầu sau khi nhiễm virus, lượng IFN trong máu tăng dần và nhờ đó lượng virus sinh ra giảm dần

IFN được hình thành tại chỗ, nơi virus nhiễm với nồng độ tương đối cao để kích thích tạo thành protein kháng virus IFN cũng được tạo thành sớm hơn so với kháng thể, còn kháng thể được hình thành

sau và có tác dụng lâu dài chống tái nhiễm

Do vậy việc sử dụng chất kháng virus lý tưởng này còn tùy thuộc vào việc đưa IFN vào đúng vị trí cần thiết trong cơ thể

IFN còn được quan tâm vì khả năng chống một số loại tế bào ung thư của người, đặc biệt là ưng thư các tế bào hệ tạo máu, do chúng

có khả năng phá hủy mARN dẫn đến ngăn cản quá trình tổng hợp

protein

Cơ chế tác dụng của IFN

Dưới tác động của virus họăc các chất cảm ứng khác, sau vài giờ, thậm chí vài ngày, tế bào sẽ tổng hợp IFN

IFN thấm qua màng sinh chất tới gắn lên receptor dành cho nó trên bề mặt các tế bào lân cận, cảm ứng để các tế bào này tổng hợp các

protein kháng virus, chủ yếu là enzyme ức chế tổng hợp protein

vỏ capsid của virus, vì thế virus không sinh sản được trong tế bào

Cơ chế hoạt động của interferon

Signal Transduction

Activation of gene

mRNA

Translation

Translation Inhibitory

Sản xuất interferon (IFT)

Canter, nhà khoa học Phần Lan đưa ra Ông

tách bạch cầu từ máu rồi nhiễm virus để các tế bào này cảm ứng tạo IFN Phương pháp này

cho năng suất thấp, giá thành cao và không có khả năng mở rộng quy mô sản xuất do nguồn

nguyên liệu cung cấp hạn chế.

• Năm 1980 hai nhà khoa học Mỹ là Boyer và Coken đã

tách được gen mã cho IFN, tách dòng rồi biến nạp

vào Saccharomyces cerevisiae, sau này dùng E.coli

thay cho nấm men

• Trước đây khi dùng phương pháp cũ, mỗi tế bào

bạch cầu chỉ cho khoảng 100-1000 phân tử IFN

Ngày nay bằng kỹ thụât tái tổ hợp, mỗi tế bào vi khuẩn có thể cho 200.000 phân tử IFN, nghĩa là

tăng hiệu suất lên từ 100-1000 lần

sản xuất IFN

Năm 2000 Viện Vacxin Nha Trang cũng phối hợp với các nhà khoa học

Ucraina để cho ra đời IFN bằng công nghệ mới sử dụng phage gắn gen mã

hóa cho IFN rồi cho phage nhân lên trong E.coli

Tác dụng sinh học của Interferon

Trong lúc chưa tìm thấy được kháng sinh chống virus thì IFN được coi là chất chống virus có triển vọng nhất

Cho đến năm 1980, IFN vẫn còn hiếm và đắt Nhờ

kỹ thụât tái tổ hợp, gen mã cho IFN được tách dòng và biến nạp vào tế bào vi khuẩn, nuôi vi khuẩn trong nồi lên men và tách IFN từ dịch lên men, do đó IFN trở nên rẻ và phổ biến hơn

Ngày nay các loại IFN khác nhau đã được sử dụng để điều trị nhìêu bệnh cho người Liệu pháp IFN thường được dùng phối hợp với hóa trị liệu và xạ trị liệu để chữa nhiều loại ung thư hệ thống

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG

THỂ ĐƠN DÒNG

TỔNG HỢP KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

(MONOCLONIAL ANTIBODIES)

Tế bào lympho B sản xuất kháng thể được lai với

tế bào myeloma ( loại tế bào ung thư có tính bât tử).

Tế bào lai hybridoma

có khả năng sản xuất kháng thể ở mức cao và là tế bào bất tử.

Kháng thể được sản xuất bởi tế bào lai hybridoma gọi là kháng thể đơn dòng