MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG I GIỚI THIỆU II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP IV KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN V KẾT LUẬN Tài liệu tham khảo MỞ ĐẦU Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử mà con tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới Công nghệ s.
Trang 1MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
NỘI DUNG
I GIỚI THIỆU
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
III TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP
IV KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
V KẾT LUẬN
Tài liệu tham khảo
Trang 2MỞ ĐẦU
Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung.
Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử mà con tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới.
Công nghệ sinh học Việt Nam đang được coi là một hướng phát triển mũi nhọn của nhiều nước Trong đó có sự chú trọng đầu tư cho lĩnh vực công nghệ enzyme Trong đó công nghệ enzyme tái tổ hợp là một hướng đi mới Có rất nhiều loại enzyme tái tổ hợp đã được nghiên cứu để đưa vào ứng trong thực tiễn Các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân Hydrolase là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm, tiêu biểu như: α-amylase, β-α-amylase, protease, lipase, Các enzyme này đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người Vì vậy nhu cầu cải tiến tạo ra enzyme tái tổ hợp mang những đặc tính ưu việt hơn rất được quan tâm.
Xuất phát từ những thực tế trên, em đã lựa chọn và xin trình bày nội dung tiểu luận về
nghiên cứu “α Amylase from B amyloliquefaciens: purification, characterization, raw starch
degradation and expression in E.coli ” Nghiên cứu trên được công bố, xuất bản vào năm
2004 trên Elsevier Ltd, do Elif Sarikaya Demirkan đến từ khoa Sinh học, Đại học Ankara (Thổ Nhĩ Kỳ) và Bunzo Mikami, Motoyasu Adachi, Takahiko Higasa, Shigeru Utsumi đến từ Học viện Khoa học Thực phẩm, Đại học Kyoto (Nhật Bản) hợp tác thực hiện
2
Vũ Thu Hằng
Trang 3NỘI DUNG
I GIỚI THIỆU 1.1 Mục đích của nghiên cứu
Nghiên cứu báo cáo quy trình tinh sạch, phân loại và khả năng thủy phân trên tinh
bột thô của α-amylase từ B.amyloliquefaciens sp kiểu dại và kiểu đột biến Cùng đó là các bước thực hiện biểu hiện ở E coli của chủng enzyme kiểu dại.
1.2 Khái niệm và vai trò của α-AmylaseAmylase
α-Amylase (E.C 3.2.1.1) là một enzym ngoại bào phổ biến trong các loài thực vật, động vật bậc cao và vi sinh vật Nó xúc tác quá trình thủy phân liên kết α-δ- (1,4) glycosidic trong các thành phần tinh bột và các cacbohydrat khác
Hình 1 Phản ứng thủy phân của tinh bột tạo glucose dưới chất xúc tác là enzyme α Amylase.
Enzyme này được sử dụng trong khử cặn vải, công nghiệp làm bánh, dược phẩm và chất tẩy rửa Các amylase có thể điều nhiệt rất quan trọng đối với công nghiệp sử dụng Đặc biệt, B amyloliquefaciens, B licheniformis, B sterothermophilus và một số chủng
B subtilis amylase và B amylolifuefaciens và B licheniformis tạo ra các enzym này ở dạng lỏng [1] Từ đó, các amylases ở một số Bacillus sp đã được tinh chế và phân loại [2,3]
1.3 α-AmylaseAmylase tái tổ hợp từ Bacillus sp trên E coli
Dey và cộng sự đã đưa ra nghiên cứu về một α-amylase chịu nhiệt mới từ Bacillus
sp N-1 [4] Gen α-amylase đã được biểu hiện từ nhiều loại Bacillus sp trong E coli để tăng
sản xuất amylase Một số sản phẩm gen cũng đã được báo cáo là tiết vào môi trường nuôi cấy
bởi E coli., chẳng hạn như penicillinase và xylanase của Bacillus sp Một α-amylase chịu
Trang 4nhiệt từ B stearothermophilus đã được nhân bản trong E coli và tăng sinh sản phẩm enzyme ngoại bào [59] Sự phân lập và phân loại đoạn 2,2 kb DNA ngược dòng của gen amylase từ B.
amyloliquefaciens cũng đã được báo cáo [6].
Enzyme amylase không hiệu quả trên các hạt tinh bột thô bởi vì các hạt này chống lại sự tiêu hóa ly giải tinh bột [7] Vùng liên kết đầu C-terminal đóng một vai trò trong liên
kết tinh bột thô Glucoamylase của nấm như Aspergillus spp và Rhizopus spp rất hiệu quả
với tinh bột thô, bởi vì chúng dường như có một vùng liên kết tinh bột COOH-terminal Các
enzym từ vi khuẩn như β-amylase của B.polymyxa và cylodextrin glucanotransferase của B
macerans cũng chứa miền này [8, 9].
4
Vũ Thu Hằng
Trang 5II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và các bước tinh sạch enzyme
Một dòng B amyloliqefaciens mới đã được phân lập từ đất của Thổ Nhĩ Kỳ và được
định danh bởi nhà máy ORBA Biochemicals (Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ)
Từ đó, một dòng đột biến được tạo ra bằng phương pháp xử lý với ethidium bromide/
UV [10] Vi khuẩn được phát triển trên một môi trường xác định trong 72 h [11]
Tiếp theo, enzyme vi khuẩn có trong bề mặt nuôi cấy được tinh chế bằng một loạt bốn bước:
+ Đầu tiên, 80% amoni sunfat được thêm vào phần nổi phía trên, ta thu được kết tủa Đem kết tủa này hòa tan trong dung dịch đệm Tris – HCl 20 mM (pH 7,6) và được thẩm tách qua đêm
+ Sau khi thẩm tách, dung dịch này được nạp vào cột Q Sepharose và tách rửa với dung dịch đệm trên thu chứa 0,5 M NaCl
+ Các phân đoạn được thu thập, thẩm tách với đệm Na-acetate 20 mM (pH 5,0) và được cô đặc bằng siêu lọc thông qua bộ cô đặc Centriprep-10 (Amicon)
+ Các mẫu cô đặc được áp dụng cho cột SP Sepharose và tách rửa với dung dịch đệm axetat Na 50 mM (pH 5,4) có chứa NaCl 1 M Các phân đoạn được thu thập và tập trung bởi siêu lọc trên máy cô đặc Centricon-10 (Amicon) Dung dịch đệm chứa 1 mM CaCl và 0,5 mM PMFS
2.2 Phân tích enzyme
α-Amylase hoạt động được phân tích bằng phương pháp tinh bột-iod [12] Một đơn vị enzyme (đơn vị/ml) được xác định bằng lượng enzyme tham gia thủy phân 1mg tinh bột (0,1%) trong 10 phút ở 37oC và pH 5,9 Sự cô đặc protein được tính toán bằng phương pháp Bradford [13] với albumin huyết thanh bò như một tiêu chuẩn
2.3 Xác định khối lượng phân tử
Điện di được tiến hành trong dung dịch đệm sodium dodecyl sulphate và trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) theo Laemmli [14]
2.4 Phân tích nguyên tố canxi
Sau khi thẩm tách các enzym đã được tinh sạch, nguyên tố canxi liên kết với α-amylase được xác định bằng cách hấp thụ nguyên tử ở bước sóng 239,9 nm với máy đo quang phổ nguyên tử Zeimman
2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
Các mẫu enzyme được ủ trong 10 phút trong khoảng tăng nhiệt 30 và 90oC Để đánh giá độ ổn định, các enzym được giữ trong 4 h và các hoạt độ còn lại được xác định Giá trị pH tối ưu cho các enzym được xác định trong hệ đệm Britton và Robinson từ pH 4 đến 9 Độ ổn định pH của enzyme được xác định bằng cách ủ 2 giờ trong cùng một chất đệm (pH 5 và 8)
Trang 62.6 Ảnh hưởng của một số ion kim loại
Các mẫu enzyme được ủ với một số ion kim loại 1 và 5 mM Các hoạt động tương đối được thể hiện dưới dạng phần trăm hoạt động kiểm soát chưa được xử lý được coi là 100%
2.7 Tính chất động học của enzym
Hằng số động học là Km và Vmax được đo bằng cách ước tính quá trình thủy phân với phương pháp tinh bột – iod và sử dụng một số nồng độ tinh bột Giá trị Km và Vmax được xác định bằng cách sử dụng phương trình Michaelis-Menten
2.8 Độ đặc hiệu của cơ chất
Tính đặc hiệu của cơ chất với các enzym tinh khiết đã được nghiên cứu, đó là sự hiện diện của các chất nền khác nhau Các nồng độ đường khử được tạo ra đã được xác định bằng phương pháp axit dinitrosalicylic [15] với maltose là tiêu chuẩn
2.9 Thủy phân tinh bột hòa tan
Sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột bằng α-amylase được hiển thị trên các tấm silica gel (dày 0,5 mm và 20 cm x20 cm) bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
2.10 Sự suy thoái hạt tinh bột thô
Các loại hạt tinh bột thô bao gồm khoai tây, khoai lang, lúa mì, gạo và ngô được rửa 5 lần bằng nước Milli-Q Các ngũ cốc được làm khô và 5% mỗi loại hạt tinh bột lơ lửng trong
400 mL dung dịch đệm axetat 50 mM (pH 5,5) chứa 10 mM 2-ME (mercaptoethanol) và 5 mMCaCl2 Phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 100 ml enzym dung dịch Hỗn hợp cơ chất enzyme được ủ trong 12,18 và 24 giờ, sau đó ly tâm và các chất nổi được sử dụng đểxác định đường giải phóng bằng axit dinitrosalicylic phương pháp với maltose làm tiêu chuẩn Tất
cả các loại hạt tinh bột được rửa hai lần bằng etanol nguyên chất và t-butylbrượu bia
Sau khi đông khô, chúng được kiểm tra bằng cách quét kính hiển vi điện tử [16]
6
Vũ Thu Hằng
Trang 7III TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP 3.1 Khuếch đại gen α-AmylaseAmylase
Trình tự DNA bộ gen của B amyloliquefaciens sp kiểu dại được chuẩn bị theo các
quy trình của Maeda et al [17] và Silhavy et al [18] Gen α-amylase mã hóa enzyme trưởng thành được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi (Pharmacia Amersham Biochem):
N-5’GAATTCCATGGTAAATGGCACGCTGATGCAGTA TTTTG3’
và C-5’TTTCTGCAGTTATTTCTGAACATAA ATGGAGACGG3’
Phản ứng PCR được thực hiện với ExTaq polymerase và chất xúc tác từ Takara (Nhật Bản, Kyoto) với chu kỳ có chương trình: biến tính ở 95oC trong 20 giây, ủ ở 60oC trong 20s,
độ giãn dài ở 72oC trong 30s, tổng cộng 35 chu kỳ
3.2 Chèn đoạn gen vào vector nhân bản
Sản phẩm PCR được cắt bởi 2 loại enzym cắt giới hạn PstI và NcoI Sau đó sản phẩm được tinh sạch bằng điện di trên Gel agarose 1,2% và sử dụng bộ lọc microcon 50 (Amicon) Đoạn DNA sản phẩm này sau khi được tinh sạch sẽ chèn vào đoạn PstI-NcoI của vectơ pKK233-2 (Pharmacia Amersham Biochem.), cuối cùng tạo ra plasmid sản phẩm là pKKAM
Plasmid pKKAM được biến nạp thành E coli JM109
3.3 Giải trình tự sản phẩm PCR
Trình tự DNA được xác định bằng máy phân tích giải trình tự DNA (model 377 A, Perkin-Elmer)
3.4 Đưa gen nhân bản vào vectơ biểu hiện
Để tạo một plasmid biểu hiện khác, gen của enzyme trưởng thành được chèn vào plasmid pET21d (Novagen) có chứa promoter T7
Đầu tiên, pKKAM được cắt bởi PstI và được điền vào bằng phân đoạn Klenow trước khi cắt bằng NcoI
Đoạn DNA được gắn vào vectơ pET21d giữa NcoI và vị trí EcoRI Kết quả tạo plasmid biểu hiện được đặt tên là pETAM
3.5 Biến nạp plasmid biểu hiện vào E coli
Plasmid pETAM được chuyển vào E coli HB101 và sau đó là chuyển vào HMS174 (DE3) và BL21 (DE3)
3.6 Tối ưu hóa và biểu hiện α-Amylaseamylase
Vi khuẩn được phát triển ở 37oC trong môi trường chứa 2L LB-broth bổ sung 50 mg/
ml ampicillin trên máy quay lắc ở 200 vòng/phút trong 3 giờ
Isopropyl-β-δ thiogalactopyranoside (IPTG) đã được thêm vào nồng độ cuối cùng là 1
mM để cảm ứng sự biểu hiện của α-amylase
Trang 8Vi khuẩn phát triển ở 200 vòng/phút ở 18oC trong 2 ngày Môi trường nuôi cấy được
ly tâm và phần nổi phía trên bị loại bỏ
Các tế bào bị treo trong 50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl và 1 mM EDTA và được
ly giải với 0,1 mg/ml enzyme lysozyme ở 30oC trong 1 giờ
Các huyền phù hình cầu được tách bằng ly tâm (15.000 vòng/phút, 15 phút) và phần nổi phía trên được sử dụng làm mẫu α-amylase
8
Vũ Thu Hằng
Trang 9Hình 2 Cấu trúc của plasmid pET21d, pKKAM, pETAM với các vị trí cắt giới hạn Đoạn gen amylase gồm 1,4kb được chèn vào plasmid pKK232 2 Plasmid này tạo ra pKKAM Plasmid pET21d có một promoter lac và pKKAM được nhân bản trong pET21d, tạo pETAM.
IV KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trang 104.1 Kết quả đặc tính của α-Amylaseamylase từ B amyloliquefaciens
Các α-amylase thu được từ B amyloliquefaciens chủng dại và chủng đột biến đã được
tinh sạch qua bốn bước như phần 2.1 ở trên Sản lượng của enzyme rất thấp Có thể một số protease đã liên kết với enzyme Do đó, một chất ức chế protease là phenyl methlysulphonyl fluoride (PMFS) đã được sử dụng
Sau khi tinh sạch, mỗi enzyme cho thấy một dải đơn trên gel điện di SDS-polyacrylamide
Bảng 1 Các chỉ số đặc tính của α amylase từ B amyloliquefaciens
Sản phẩm sau ly giải Glucose, maltose, maltotriose,… Glucose, maltose, maltotriose,…
Số nguyên tử Ca liên
kết với enzyme
4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt động của α-amylase từ B amyloliquefaciensamylase từ B amyloliquefaciens
Một số chỉ số của 2 loại enzym tinh sạch được thống kê cho thấy α-amylase đột biến
có phạm vi pH và nhiệt độ khác để kết thúc hoạt động ổn định hơn trong khoảng từ 5 đến pH
8 sau 2 h so với chủng dại (Bảng 1, hình 3) Độ pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của cả hai enzym
là 6,0 và 55oC Enzyme đột biến cũng ổn định nhiệt hơn (70% ở 50oC trong 4 giờ) so với loại
tự nhiên
Enzyme đột biến có độ ổn định cao hơn so với loại tự nhiên về pH và điều kiện nhiệt
độ Người ta cũng thấy rằng cả hai amylase đều hoạt động mạnh hơn ở pH kiềm hơn là pH axit
10
Vũ Thu Hằng
Trang 11Hình 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt động của enzyme.
4.1.2 Kết quả động học của enzyme
Enzyme cho thấy động học kiểu Michaelis khi thủy phân tinh bột hòa tan Các loại
amylase hoang dã và đột biến có Km và Vmax khác nhau (Bảng1)
4.1.3 Các sản phẩm từ phản ứng thủy phân của α-amylase từ B amyloliquefaciensamylase
Các sản phẩm chính sau phản ứng của một α-amylase từ tinh bột hòa tan là maltooligosaccharides [23] Tác dụng của enzym đối với tinh bột hòa tan chỉ ra rằng hai enzyme tuân theo cùng một mô hình hoạt động, kể từ khi sản phẩm thủy phân của tinh bột hòa tan bởi cả hai amylase thì maltose là sản phẩm chính, các oligosaccharid malto nhỏ và
một lượng nhỏ glucose (Hình 4) Enzyme đường hóa từ B subtilis tạo ra phần lớn glucose và maltose từ tinh bột trong khi amylase dạng lỏng từ B amyloliquefaciens tạo ra chủ yếu là maltosaccharid [24] Một số nhà nghiên cứu cũng đã thu được kết quả tương tự với các chủng
Bacillus khác [25,26].
Hình 4 Phân tích sắc ký lớp mỏng của các sản phẩm chính từ phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan bằng amylase chủng dại và đột biến
Glucose (G1), maltose (G2), maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5), maltohexaose (G6) và maltoheptaose (G7).
Trang 124.1.4 Phân tử khối của enzyme
Trọng lượng phân tử của các enzym được ước tính vào khoảng 52 kDa bằng điện di trên gel SDS-polyacrylamide
4.1.5 Số lượng nguyên tử Canxi trong cấu trúc của enzyme α-amylase từ B amyloliquefaciensamylase
Tất cả các amylase đều là canxi metalloenzyme [27] Các nguyên tử Canxi liên kết chặt chẽ với phân tử enzyme, chúng có ảnh hưởng lớn đến cấu tạo và tính ổn định enzyme
[28] Người ta thấy rằng amylase của B amyloliquefaciens chủng dại chứa một ion Ca2+ trong khi enzyme đột biến tiếp nhận hai ion Đây có thể là lý do giải thích cho việc enzym từ chủng đột biến chịu được nhiệt độ cao hơn so với chủng dại Vì canxi có ảnh hưởng đến sự ổn định của enzyme
4.1.6 Cơ chất tạo độ đặc hiệu tốt nhất
Độ đặc hiệu của cơ chất amylase cho thấy maltopentaose là chất nền tốt nhất α-Amylase của chủng đột biến cho thấy sự khác biệt với loại hoang dã và amylase này hoạt động tích cực hơn đối với các chất nền lớn như amylopectin và tinh bột hòa tan chứa các mối liên kết α-1,6 và 1,4 glycosidic
4.1.7 Ion hoạt hóa và ion ức chế
Hoạt động của amylase được tăng tốc bởi một số kim loại các ion (Bảng 2) 1 mM ion kim loại hiệu quả hơn 5 mM Mg, Ba và Cu kích thích hoạt động của chủng dại, nhưng chỉ có
Mg là có hiệu quả với chủng đột biến Hg, Fe, Zn và Ag là những chất ức chế mạnh trên hoạt động của cả hai loại enzym
Bảng 2 Hiệu quả của các ion kim loại khác nhau trên hoạt động của của α amylase từ
B.amyloliquefaciens (% hoạt động)
4.2 Kết quả biểu hiện α-Amylaseamylase từ B amyloliquefaciens trên E coli
Gen α-amylase của B amyloliquefaciens chủng dại được biểu hiện ở E coli Plasmid
pKKAM được khuếch đại bằng PCR và trình tự nucleotide của DNA đoạn 1452 cặp bazơ có chứa amylase trưởng thành gen xác định
12
Vũ Thu Hằng