Thí nghiệm công nghệ sinh học dược báo cáo CUỐI kì sản xuất enzyme amylase bằng e coli tái tổ hợp

tiêu nghiên cứu: nắm rõ các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật, các bước tiếnhành tạo dòng biểu hiện protein, quy trình tinh chế amylase, biết cách tính toán các thông số

Chọn lọc giống vi sinh vật

Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme

 Cho vào 1g mẫu đất 10 μL đệm PBS

 Vortex để phân tán vi sinh vật vào đệm Để khoảng 15 phút cho đất lắng xuống đáy

 Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10, đánh số ống từ 1 đến 6

 Hút 100 μL huyền phù vi sinh vật đã pha loãng, trải lên môi trường phát hiện ống 4, 5 và

6 Ủ ở nhiệt độ 37 o C/ 24 giờ nhằm phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme amylase, protease trên 3 đĩa thạch tinh bột và 3 đĩa thạch gelatin.

Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết amylase ngoại bào.

 Môi trường phân lập: tinh bột

 Thuốc thử: dung dịch Lugol

Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết protease ngoại bào.

 Môi trường phân lập: thạch gelatin

1.1.3.1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Protease ngoại bào

Hình 1.1 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA

Trong thử nghiệm này, 50% được áp dụng cho ống 4, ống 5 và ống 6 Ở ống 4, (b) đĩa phân lập được sử dụng để phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA; ở ống 5, (c) đĩa phân lập cũng được dùng để phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA Ống 6 tiếp tục được đánh giá với cùng mục tiêu là xác định khả năng sinh protease ngoại bào trước khi thêm TCA Các bước này giúp so sánh mức độ sản xuất protease giữa các mẫu và điều kiện thử nghiệm.

Hình 1.2 trình bày ba hình đĩa phân lập sau khi nhỏ TCA 50% ở ống 4, ống 5 và ống 6, nhằm phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào Các phần (a), (b) và (c) tương ứng lần lượt thể hiện kết quả ở ống 4, 5 và 6, cho thấy sự hiện diện và mức độ hoạt động của protease ngoại bào trên đĩa sau xử lý TCA Qua đó, hình ảnh này cho phép so sánh mức độ sinh protease giữa các điều kiện thí nghiệm và cung cấp bằng chứng hình ảnh về hoạt tính enzyme của mẫu.

Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease ngoại bào

TT Mô tả Khả năng sinh protease ngoại bào

1 Khóm màu vàng nhạt đường kính khoảng 0,3 cm Có

2 Không thấy vi sinh vật tiết protease ngoại bào Không

3 Không thấy vi sinh vật tiết protease ngoại bào Không

Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở 37 o C trong

Trong 24 giờ, ống 4 cho thấy khả năng tiết protease ngoại bào, được nhận biết qua vòng sáng quanh chỗ vi sinh vật mọc do gelatin đã bị thủy phân nên không bị tủa Sau khi nhỏ TCA 50%, chỉ có một môi trường tạo vòng sáng quanh vị trí vi sinh vật mọc.

1.1.3.2 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Amylase ngoại bào

Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào trước khi nhỏ dung dịch

Quy trình nghiên cứu tập trung vào phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào thông qua đĩa phân lập và việc sử dụng Lugol như công cụ nhận diện ở từng giai đoạn, với ống 4 làm bước đầu, và ống 5, ống 6 liên quan đến các bước sau khi xử lý Lugol để đánh giá mức độ tiết enzyme của mẫu.

Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau khi nhỏ dung dịch

Trong thí nghiệm này, Lugol được bổ sung vào ống 4; đĩa phân lập được sử dụng để phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 5; tương tự, đĩa phân lập được sử dụng để phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 6.

Bảng 2 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase ngoại bào

TT Mô tả Khả năng sinh amylase ngoại bào

1 Khóm màu vàng nhạt, tròn, bìa không răng cưa, đường kính khoảng 3mm

2 Không thấy vi sinh vật tiết amylase ngoại bào Không

3 Không thấy vi sinh vật tiết amylase ngoại bào Không

Vi sinh vật đất được phân lập và nuôi trên môi trường tinh bột ở điều kiện 37°C trong 24 giờ, cho thấy khả năng tiết amylase ngoại bào Trong ống 4, vòng sáng nhỏ quanh khu vực vi sinh vật mọc cho thấy tinh bột đã bị thủy phân và dung dịch iốt không tạo màu, xác nhận hoạt động amylase ngoại bào.

Tại môi trường phát hiện ống 5 hầu như không có vòng sáng, môi trường phát hiện ống 6 cũng không có vòng sáng.

Kháng sinh

Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó đối với các sinh vật khác.

 Chủng kiểm tra: chủng Bacillus có khả năng sinh kháng sinh

 Chủng thử nghiệm: E coli vs Shigella

 Dung dịch PBS dùng làm mẫu chứng

 Đốt đèn cồn sát khuẩn tay và khu vực xung quanh

 Tất cả các thao tác đều phải thực hiện gần đèn cồn để đảm bảo vô khuẩn

Mở nắp ống nghiệm chứa vi khuẩn, dùng que bông vô trùng nhúng vào ống, ép que lên thành ống để ráo nước và rút que bông ra khỏi ống nghiệm.

 Trải đều vi khuẩn trên mặt thạch, lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay đĩa 60 độ

 Thực hiện trên 2 đĩa,1 đĩa chứa vi khuẩn E coli,1 đĩa chứa vi khuẩn Shigella

 Dùng dụng cụ đục lỗ đục ít nhất 3 lỗ trên đĩa thạch

 Cho khoảng 0,1 àl dịch nuụi cấy chứa vi khuẩn Bacillus vào 2 lỗ trống

 Lỗ trống cũn lại cho 0,1àl dung dịch PPS làm mẫu đối chứng

 Nuôi cấy ở 37°C trong 24h, thu kết quả

Hình 1: Thao tác đục lỗ trên đĩa thạch Hình 2: Kết quả thu được trên đĩa thạch E coli

Hình 3: Kết quả thu được trên đĩa thạch Shigella

Tinh chế enzym Amylase bằng Alginat

Nguyên vật liệu

Tiến hành

 Bỏ vỏ khoai lang, cắt nhỏ thành từng miếng

 Cân 30g khoai lang cho vào chày cối để ghiền nát với 30ml đệm phosphate

 Lấy 20ml có được từ việc nghiền chung với PBS và tiến hành ly tâm để thu dịch lỏng

 Lọc qua giấy lọc thu dịch lỏng chứa enzyme amylase thô

 Lấy 10ml dịch enzyme thô từ bước trước, cho dung dịch 30mL sodium alginate 2%, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, ủ trong 1 giờ

 Cho 20ml dung dịch CaCl2 0.7M vào dung dịch alginat + enzyme, khuấy đều Đem đi ly tâm và thu tủa

 Cho 20ml dung dịch glucose 2% 4°C và ủ 12 giờ Sau 12 giờ, lấy dịch ủ đi ly tâm thu dịch lỏng chứa enzyme amylase tinh

2.2.3 Xác định hàm lượng protein bằng OD280

 Lấy 2 eppendorf chứa 1.5ml enzym amylase thô và 1.5ml enzym amylase tinh, ly tâm

 Sau ly tâm: enzym amylase thô pha loãng 20 lần (50 uL Amylase thô + 950 uL nước), enzym amylase tinh không pha loãng (1000 uL Amylase tinh) => cho vào cuvet

 Cho cuvet vào máy đo OD ở bước sóng 280 nm Ống Độ hấp thu (A)

2.2.4 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Heinkel

 Nguyên tắc : xác định hoạt độ nhờ mức độ giảm màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iode.

- Đối với enzyme thô, pha loãng 100 lần với đệm phosphate.

- Đối với enzyme tinh chế, pha loãng 10 lần với đệm phosphate.

Xác định hoạt tính enyme thô và enzyme tinh chế, mỗi mẫu thực hiện 2 eppendorf (ống thử và ống chứng). Ống Độ hấp thu (A) Ống thử thô 1.500 Ống chứng thô 3.122 Ống thử tinh 0.923 Ống chứng tinh 1.780

Tính hiệu số đọc được trên máy giữ mẫu chứng và mẫu thử thô:

Tính hiệu số đọc được trên máy giữ mẫu chứng và mẫu thử tinh:

Từ ∆OD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột thủy phân tương ứng từ đó tính hoạt độ enzyme (HTE).

Lập đồ thị chuẩn: Ống thử nghiệm 0 1 2 3 4 5

Hút 0.1 mL từ các ống sang eppendorf mới

Hút 0,1 mL từ các ống sang eppendorf mới

TT Iode 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 Đo OD 560 nm 0,000 0,108 0,225 0,523 0,685 0,803

Hoạt tính chung của enzyme thô: HTCenzyme thô = HTE thô x N x Venzyme thô

Hoạt tính chung của enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE tinh x N x Venzyme tinh (N là hệ số pha loãng của enzyme) = 0.681 x 10 x 20 = 136.2 (U/ml)Hoạt tính riêng của enzyme thô: HTR = HTC / lượng protein (U/A280nm)

= 1289 Hoạt tính riêng của enzyme tinh: HTR = HTC / lượng protein (U/A280nm)

= 136.2 Hiệu suất cố định: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô.

Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô

HT (U/ml) = (Acontrol-Asample) / (A/mgStarch x 15 phút x 0.1 ml)

Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli

Tách Plasmid dùng Spin Column

 Chủng tạo dòng E coli đã được chèn vector có mang gen mục tiêu

 Kit tách plasmid (solution I, solution II, solution III, RNase, Washing buffer).

 Cho 1.5 mL dịch nuôi cấy vào eppendorf -> ly tâm thu tế bào

 Thêm 100 μL solution I, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.

 Thêm 200 μL solution II, trộn bằng cách đảo eppendorf lên xuống 4-6 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.

 Thêm 300 μL solution III, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.

 Ly tâm 12,000 rpm/min, trong 5 phút Thu dịch nổi.

 Cho dịch nổi vào spin column Ly tâm 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua.

 Cho 500 μL washing buffer, ly tâm 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua Lặp lại bước trên

 Ly tâm 1 phút để làm khô màng.

 Đặt cột vào eppendorf mới Cho TE buffer vào giữa cột, ủ 2 phút Ly tâm trong 2 phút để thu plasmid.

Hình 1: Spin Column trước khi ly tâm Hình 2: Spin Column sau khi ly tâm

Biến nạp plasmid vào E coli

 Plasmid biểu hiện có gen mục tiêu.

 Tế bào khả nạp E coli BL21 (DE3).

 Hộp thạch LB có sẵn kháng sinh chọn lọc tương ứng.

 Mọi hoạt động đều phải tiến hành trong đá lạnh và DNA được sử dụng cho quá trình biến nạp phải làm lạnh trước.

 Tiến hành biến nạp cho mẫu nước cất là phản ứng chứng âm, và plasmid chứa amyE mục tiêu vào E coli BL21 (DE3).

 Để tube chứa plasmid trong đỏ Lấy 50 àl tế bào khả nạp cần thiết.

Hình 1 Tiến hành thao tác trong đá lạnh.

 Lấy đủ số tube tế bào khả nạp cần thiết, làm đông trong đá khoảng 5 phút, không làm đông trên tay vì sẽ giết chết tế bào.

Chuyển plasmid vào tế bào khả nạp là bước then chốt của biến nạp; trộn nhẹ bằng cách chạm đáy ống và tránh thao tác mạnh để bảo toàn tế bào và tối ưu hiệu quả biến nạp Sau đó, chuẩn bị môi trường thạch LB chọn lọc, ví dụ LB Agar chứa ampicillin, để phân lập các tế bào được biến đổi.

Hình 2 Chuẩn bị môi trường LB Agar Ampicillin 30 μL / mL.

 Gây sốc nhiệt bằng cách đặt các tube trên bể cách thuỷ ở nhiệt độ chính xác 42°C trong

30 giây và sau đó làm lạnh trong đá 10 phút.

Thêm 1 mL dung dịch LB vào mỗi ống và ủ ở 37°C trong 1 giờ để ổn định tế bào và đảm bảo sự biểu hiện của gen kháng sinh trên plasmid có thời gian biểu hiện Quá trình này giúp tế bào ổn định và plasmid duy trì thời gian biểu hiện mong muốn, chuẩn bị cho các bước tiếp theo trong quy trình.

Hình 3 Ủ tế bào ở 37°C trong 1 giờ.

 Ly tâm 13,000 vòng/ phút trong 15 giây, thu tế bào.

 Đổ bỏ phần môi trường bên trên, chỉ chừa lại khoảng 100μL ở đáy tube.

 Nhẹ nhàng phân tán tế bào vào phần môi trường còn lại, chuyển toàn bộ sang hộp thạch chứa môi trường có kháng sinh Ampicillin.

Hình 4 Thạch chứa môi trường có kháng sinh Ampicillin.

Dùng que gạt vô trùng để trải vi khuẩn trên mặt thạch Que gạt được tiệt trùng bằng cách nhúng vào cồn tuyệt đối và chỉ đốt que trước khi sử dụng.

Hình 5 Quá trình trải vi khuẩn a) Tiệt trùng que trải; b) Trải vi khuẩn lên mặt thạch.

 Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 37ºC, phải lật ngược hộp thạch để tránh sự ngưng đọng hơi nước trên mặt thạch.

Hình 6 Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 37ºC.

Kết quả thí nghiệm cho thấy trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc, cho thấy các tế bào đã nhận được plasmid pET28b(+) mang gen kháng Ampicillin, khẳng định sự hiện diện của plasmid và khả năng biểu hiện gen kháng thuốc thông qua vector pET28b(+).

Lưu dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp

 Hộp thạch chứa các tế bào nhận được plasmid pET28b(+) có mang gen đề kháng Ampi

 Ống môi trường chứa 3mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampi.

 Sau khi ủ đủ thời gian, các tế bào nào nhận được plasmid pET28b(+) có mang gen đề kháng Ampi sẽ mọc thành khuẩn lạc.

 Chọn 2-5 khuẩn lạc có kích thước lớn để lưu chủng.

 Dùng que cấy vô trùng hay đều tip vô trùng, chấm vào đỉnh khuẩn lạc.

Trong nghiên cứu vi sinh, nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin là một phương pháp được dùng để đánh giá nhạy cảm với kháng sinh và quan sát hành vi tăng trưởng của vi khuẩn trong điều kiện có chất ức chế Nội dung này nhấn mạnh vai trò của môi trường nuôi cấy, sự tác động của kháng sinh đến quá trình phát triển và phân bố vi khuẩn, đồng thời nhấn mạnh tầm quan trọng của tuân thủ an toàn sinh học và các biện pháp quản lý rủi ro trong phòng thí nghiệm để đảm bảo kết quả đáng tin cậy và an toàn cho người thực hiện.

Hình 1 Ống chứa môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampi đã được cấy que và ủ 37 o C sau 18 giờ.

 Cho vào 2 eppendorf có nắp đậy 250 μL glycerol 80% và 1 mL huyền dịch vi khuẩn đã nuôi 18 giờ, trộn đều, đậy chặt nắp.

 Ghi nhãn và bảo quản ở -80 o C hoặc -20 o C

Sau khi mẫu được ủ ở điều kiện phù hợp, tiến hành lưu trữ bảo quản mẫu bằng glycerol và ghi nhãn đầy đủ để nhận diện Mẫu bảo quản an toàn và có thể dùng lại cho mục đích nuôi cấy hoặc phân tích khi cần Khi cần sử dụng, chỉ cần lấy mẫu ra và kích hoạt lại để tiếp tục hoạt động.

Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu

 Chủng E coli BL21(DE3) có gen mục tiêu

 Lấy một khuẩn lạc E coli cấy vào 2 mL LB + Ampi 30μg/mL, ủ qua đêm 37 o C trên máy lắc.

 Cấy pha loãng 1:100 vào bình tam giác chứa 20mL LB + Ampi 30 μg/mL Lắc 37 o C 200 rpm đến khi đạt OD600 khoảng 0,5-0,6.

Chia môi trường nuôi cấy E coli thành hai chai, mỗi chai 10 mL: một chai bổ sung IPTG 100 mM để đạt nồng độ cuối cùng là 1 mM IPTG, chai còn lại làm chứng không cảm ứng.

Hình 2 Thao tác chia môi trường nuôi cấy.

Hình 3 Bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy E coli đã thêm IPTG 100mM

 Tiếp tục lắc thêm 30 phút.

Hình 4 Bình thêm IPTG 100mM được cho vào máy lắc 30 phút.

 Tiến hành thu tế bào bằng cách ly tâm 5,000 rpm trong 10 phút ở 4 o C.

 Cho tế bào vào tủ bảo quản ở -80 o C hay -20 o C nếu không dùng ngay.

Việc lắc thêm vài giờ giúp cho cảm ứng diễn ra đầy đủ Tế bào thu được sau khi ly tâm là tế bào đã được cảm ứng biểu hiện bởi IPTG, có thể bảo quản để khi cần dùng sẽ lấy ra kích hoạt lại.

Tinh chế protein tái tổ hợp

Khái quát về nguyên tắc của sắc ký ái lực

Nhựa sắc ký chứa ion Ni2+ có ái lực đặc hiệu với chuỗi histidine được gắn trên protein ở 6–8 vị trí (His-tag) Nhờ sự gắn kết giữa Ni2+ và chuỗi histidine, phương pháp sắc ký ái lực cho phép tinh chế protein đích một cách hiệu quả Quá trình elution được thực hiện bằng đệm chứa imidazole, chất có ái lực mạnh với Ni2+ và cạnh tranh với histidine để giải phóng protein khỏi cột.

Sắc ký ái lực ion kim loại – IMAC

Chuẩn bị dung dịch đệm phù hợp bằng cách pha loãng nồng độ Bảng pha loãng như dưới đây: Đệm Stock Tỉ lệ pha loãng

Tổng Thể tích cần sử dụng (ml)

Để chuẩn bị các đệm cho quá trình xử lý, dùng đệm 8X pha theo tỉ lệ 1 ml đệm 8X với 7 ml nước để được các đệm chạy 8X, đệm ion 8X và đệm rửa 8X; sau khi pha, cất đệm ở nơi bảo quản phù hợp Đối với đệm thôi 4X, pha theo tỉ lệ 1 ml đệm 4X với 3 ml nước để tạo đệm thôi 4X, và cũng cất giữ đúng cách.

4.2.2 Chuẩn bị cột Đầu tiên rửa cột rỗng với nước cất vô trùng, sau đó gắn lên giá sao cho cột thẳng đứng Phân tán nhựa sắc ký bằng cách úp ngửa để nhựa sắc ký được phân tán đều trong cột Tiếp đến cho 2 mL Ni-Sepharose vào cột và cẩn thận không cho dính vào thành cột Đợi khoảng 1 giờ để sepharose lắng xuống và mở cột để dung dịch bảo quản cột chạy xuống hết và lưu ý tránh để cột bị khô.

 Rửa cột lần lượt với các đệm đã được pha ở trên (1 thể tích là 0.5 ml)

 2 thể tích nước cất vô trùng

 Sử dụng môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli không thêm chất cảm ứng IPTG IPTG là chất cảm ứng promoter cảm ứng cho quá trình phiên mã.

Quy trình xử lý mẫu nuôi cấy E coli được tóm tắt ở mức tổng quan: tách tế bào khỏi dung dịch nuôi và thu phần cặn chứa tế bào, sau đó chuẩn bị tế bào bằng một dung dịch đệm nhằm hỗ trợ phân tán và bảo toàn protein tránh biến tính do nhiệt Toàn bộ thao tác được thực hiện ở điều kiện lạnh để giữ protein ở trạng thái ổn định và tối ưu cho các bước xử lý tiếp theo.

Xử lý mẫu E coli bằng phương pháp siêu âm trong đệm nhằm phá vỡ tế bào và chuẩn bị cho các bước phân tích tiếp theo Nhiệt độ được kiểm soát để tránh biến tính do quá trình siêu âm, vì nhiệt sinh ra có thể làm thay đổi cấu trúc protein và các thành phần tế bào Quá trình được thực hiện cho đến khi tế bào bị phá vỡ và mẫu đạt trạng thái phù hợp để tiến hành các bước xử lý tiếp theo.

 Lấy 1 mL dịch tán siêu âm vào 2 eppendorf Một eppendorf đi nạp cột sắc kí và một eppendorf đi đo OD.

 Ly tâm cả 2 ống với tốc độ 14.000 vòng/5 phút, thu dịch nổi là các protein là dung dịch A.

4.2.4 Tinh chế protein His-tag

Đầu tiên nạp 1 mL dịch A lên cột, mở van và để cột chạy cho quá trình tách, sau đó thu được dung dịch B Dung dịch B chứa các protein không có ái lực với cột, tức là các protein không gắn với vật liệu của cột và được thu nhận ở đầu ra của quá trình tách.

Rửa cột bằng 2,5 mL đệm chạy 1X để thu được B1 B1 chứa các protein có ái lực thấp đối với cột và có thể chứa một lượng protein đích do đệm chạy có chứa 40 µL.

 Rửa cột lần lượt với mỗi thể tích đệm rửa 1X 5 lần, thu được 5 ống C1-C5 vào 5 ống eppendorf Kiểm tra sự hiện diện của protein bằng cách đi đo OD.

 Thôi cột bằng cách cho lần lượt 6 thể tích đệm thôi 1X và thu dịch chảy D1-D6 vào 6 ống eppendorf Kiểm tra sự hiện diện protein bằng cách đo OD.

 Tái cân bằng cột bằng 2.5 mL đệm chạy 1X và bảo quản cột.

4.2.5 Xác định hàm lượng protein

Xác định hàm lượng protein trong dịch A, B, B1, C và D1-D6 theo phương pháp đo OD ở bước sóng 280 nm.

Bảng 1 Bảng kết quả đo OD 280 nm

Tên mẫu Trị số OD (Abs) Ống A 0,332 Ống B 0,048 Ống B1 0,183

Bảng 2 Bảng đo OD 280 nm C1-C5

Tên mẫu Trị số OD (Abs)

• Ống B đo OD là 0.048 A nên có 1 lượng protein không có ái lực với cột bị chảy ra.

 Hàm lượng protein tái tổ hợp có trong 5 ống C theo phương pháp đo OD là 1.259A

 Hàm lượng protein tái tổ hợp có trong 6 ống D theo phương pháp đo OD là 1.643A

 Trong ống A đo OD có giá trị cao nhất là 0.332 nên lượng protein có trong ống A là cao nhất

Giá trị đo ở các ống D cao và không đồng đều, đặc biệt ở ống D4 nồng độ protein tăng bất thường lên 0,338 A Nguyên nhân có thể là lượng protein His-tag còn lại trong cột của các nhóm trước chưa được rửa giải hết, dẫn đến sự tăng nồng độ protein một cách bất thường tại vị trí này.

Kết luận: Hàm lượng protein trong ống A cao nhất nhưng không bằng tổng lượng protein của các ống còn lại khi được cộng lại Hiện tượng này xảy ra khi cột sắc ký bị nhiễm hoặc dung dịch đệm bị nhiễm, gây thêm tạp chất trong các ống.