BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ T[.]
Trang 1ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN
MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ
VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG
NẤM MEN Pichia pastoris
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kì công trình nào trước đây Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này
Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Phan Vũ Hải Yến
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố
Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm đại học
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người cô kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Th.S Nguyễn Xuân Đồng và K.S Lê Thị Huỳnh Trâm đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi về kiến thức chuyên môn và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ Vi sinh - Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và
hỗ trợ tôi về kinh phí cũng như thiết bị để tôi có thể thực hiện đề tài
Tôi cũng cảm ơn các bạn trong nhóm ESS đã luôn cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận văn này
Và cuối cùng, hơn ai hết, từ đáy lòng con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi dạy con khôn lớn, luôn bên con và là nguồn động viên to lớn của con, tạo mọi điều kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn
Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014
Phan Vũ Hải Yến
Trang 4MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề: 1
1.2 Mục đích nghiên cứu đề tài 2
1.3 Nội dung nghiên cứuc 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3
2.1 Cấu tạo lignocellulose 3
2.1.1 Cellulose 4
2.1.2 Hemicellulose 6
2.1.3 Lignin 7
2.2 Enzyme cellulase 8
2.2.1 Phân loại enzyme 8
2.2.2 Cơ chế tác dụng của cellulase 9
2.2.3 Vi sinh vật sản xuất cellulase 10
2.3 Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum 11
2.3.1 Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum 11
2.3.2 Đặc điểm của phức hệ cellulosome 12
2.4 Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 14
2.4.1 Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris 14
2.4.2 Tích hợp gen ngoại lai vào P pastoris 14
2.4.3 Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris 15
Trang 52.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium
thermocellum 16
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 19
3.1.1 Địa điểm nghiên cứu: 19
3.1.2 Thời gian nghiên cứu: 19
3.2 Nguyên liệu 19
3.2.1 Chủng vi sinh vật 19
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 19
3.2.3 Hóa chất 20
3.2.4 Môi trường 22
3.2.4.1 Môi trường LB (Luria-Bertani): 22
3.2.4.2 Môi trường MD (Minimal Dextrose): 22
3.2.4.3 Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 22
3.2.4.4 Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): 22
3.2.4.5 Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC 23
3.2.5 Plasmid 23
3.2.5.1 Plasmid pJET1.2/blunt 23
3.2.5.2 Plasmid pPIC9K 24
3.2.6 Các cặp mồi sử dụng 25
3.3 Phương pháp nghiên cứu: 26
3.3.1 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum 26
3.3.1.1 Thiết kế mồi 26
Trang 63.3.1.2 Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C thermocellum bằng phản ứng
PCR dựa vào cặp mồi đã thiết kế 27
3.3.1.3 Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy 28
3.3.1.4 Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt 28
3.3.1.5 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp 29
3.3.1.6 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp 30
3.3.1.7 Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 31
3.3.1.8 Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E coli 32
3.3.1.9 Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn 33
3.3.1.10 Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên GenBank 34
3.3.2.Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 34
3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn 34
3.3.2.2 Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON 35
3.3.2.3 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 36
3.3.2.4 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp 36
3.3.2.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E coli DH5α 36
3.3.2.6 Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc 37
3.3.2.7 Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn 37
3.3.2.8 Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương ứng trên GenBank 38
Trang 73.3.3 Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa
enzyme endoglucanase D 38
3.3.3.1 Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp 39
3.3.3.2 Phương pháp điện biến nạp 39
3.3.3.3 Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D 40
3.3.3.4 Phương pháp ly trích DNA tổng số 40
3.3.3.5 Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41
3.3.5 Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P pastoris tái tổ hợp 42
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43
4.1 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của Clostridium thermocellum 43
4.1.1 Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR 43
4.1.2 Tạo dòng E coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD 44
4.1.3 Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 45
4.1.4 Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn 46
4.1.5 Kiểm tra dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng giải trình tự 48
4.2.1 Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 52
4.2.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI 53
4.2.3 Kiểm tra dòng E coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD bằng giải trình tự 55
Trang 84.3 Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD 57
4.3.1 Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115 58
4.3.2 Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D 59
4.3.3 Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R 60
4.3.4.Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P pastoris tái tổ hợp 62
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63
5.1 Kết luận 65
5.2 Đề nghị 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC
Trang 9DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
BMGY Buffered Glycerol-complex
BMMY Buffered Methanol-complex
CBD Cellulose binding domain
CMC Carboxymethyl-cellulose
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
Mut Methanol Utilisation
NCBI National Center for Biotechnology Information
PCR Polymerase Chain Reaction
Taq Thermus aquaticus
TAE Tris – acetate – EDTA
TE buffer Tris EDTA buffer
YNB Yeast Nitrogen Base
YPD Yeast Extract Peptone Dextrose
Trang 10DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose 3
Hình 2.2 Lignocellulose 4
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử Cellulose 5
Hình 2.4 Cấu trúc cellulose 6
Hình 2.5 Hemicellulose 7
Hình 2.6 Lignin 7
Hình 2.7 Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase 9
Hình 2.8 Clostridium thermocellum 11
Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của Cellulosome 12
Hình 3.1 Thang DNA 1 Kb 21
Hình 3.2 Plasmid pJET 1.2 24
Hình 3.3 Plasmid pPIC9K 25
Hình 3.4 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR 27
Hình 3.5 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R 32
Hình 3.6 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 37
Hình 3.7 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD 43
Hình 4.2 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) 444
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R 45
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2-CelD bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR 46
Hình 4.5 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5 𝛼 chứa pPIC9K-CelD bằng môi trường LB/ ampicillin (50 µg/ml) 51
Trang 11Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E coli
DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R 52
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi
CelDF/ CelDR và sản phẩm cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI 53
Hình 4.8 Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid
pPIC9K-CelD trên NCBI 56
Hình 4.9 Sàng lọc thể biến nạp P pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD 58 Hình 4.10 Sàng lọc tế bào P pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418
60
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid
pPIC9K-CelD vào bộ gen P pastoris GS115 61
Hình 4.12 Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm
với thuốc đỏ Congo 63
Trang 12DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Các cặp mồi được sử dụng có trình tự như sau: 26
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR 27
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2 29
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R 31
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI 33
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI 35
Bảng 3.7 Thành phần phản ứng nối CelD vào vector biểu hiện pPIC9K 36
Bảng 3.8 Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI 38
Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng P pastoris tái tổ hợp 64
Trang 13CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề:
Ethanol là một trong những dung môi quan trọng trong công nghiệp hóa học
và công nghệ sản xuất thực phẩm Gần đây, ethanol được coi là một nhiên liệu sạch
có khả năng tái tạo, có thể thay thế một phần cho các nguồn nhiên liệu hoá thạch đang ngày càng cạn kiệt như than đá, dầu mỏ trong tương lai Hiện nay 98% ethanol được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu thực phẩm.Điều này sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tình hình an ninh lương thực trên thế giới Trong khi đó, sản xuất nông nghiệp hàng năm sinh ra một lượng lớn phụ phế phẩm như rơm rạ, cám mì, trấu, bã mía,…Việc tận dụng được nguồn chất thải này để sản xuất ethanol sinh học không những giảm khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt mà còn giảm ô nhiễm môi trường Tuy nhiên việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tái sinh này vẫn còn gặp nhiều khó khăn khi sản xuất ở quy mô công nghiệp
Trong công nghệ sản xuất cồn sinh học, hai hướng chính để thủy phân cellulose là phương pháp hóa học và sinh học Trong thủy phân hóa học, cellulose
bị phân hủy thành đường đơn dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao Công nghệ này mặc dù có hiệu suất cao nhưng rất độc hại và phức tạp, ảnh hưởng xấu đến môi trường và con người Chính vì vậy, hướng ứng dụng enzyme để thủy phân cellulose
là một hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn đem đến những đột phá về mặt công nghệ Enzyme cellulase là enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân cellulose thành glucose – nguyên liệu chính trong sản xuất cồn sinh học Tuy nhiên, việc sử dụng chúng vẫn còn hạn chế vì chi phí sản xuất enzyme cellulase cao và hiệu suất chuyển hóa cơ chất thấp Nguyên nhân là do quá trình thu nhận enzyme trực tiếp từ
vi sinh vật tốn nhiều thời gian và công sức, khó thực hiện ở quy mô công nghiệp, enzyme đôi khi không có đủ các đặc tính mong muốn Chính vì thế, ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp
là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng lớn
Trang 14Hiện nay trên thế giới đã có những nghiên cứu về hệ enzyme phân hủy
cellulose của cellulosome ở vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt Clostridium thermocellum
Hướng biểu hiện hệ cellulosome tái tổ hợp để thu nhận được số lượng lớn cellulosome có chức năng phân giải cellulose được coi là hướng có tiềm năng nhất trong công nghệ sản xuất cồn từ cellulose Trên cơ sở đó đề tài: “Tạo dòng plasmid
tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn
Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành
Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông – lâm nghiệp và ứng dụng để sản xuất cồn sinh học với giá thành hợp lý
1.2 Mục đích nghiên cứu đề tài
Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum
1.3 Nội dung nghiên cứu:
- Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium
thermocellum bằng phản ứng PCR
- Tạo dòng tế bào E coli DH5𝛼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa
gen CelD
- Tạo dòng E coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pPIC9K chứa gen mã hóa
enzyme endoglucanase D
- Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme
endoglucanase D
Trang 15CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1 Cấu tạo lignocellulose
Lignocellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên Hàng năm sản lượng sinh khối thực vật trên Trái Đất khoảng 200 tỉ tấn, trong đó 90% là lignocellulose (Himmel và cộng sự, 2007) Việc chuyển hóa lignocellulose không chỉ quan trọng đối với vòng tuần hoàn vật chất mà còn ảnh hưởng đến việc tái hồi dinh dưỡng cho cây
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và một số thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose chủ yếu có trong phụ phế phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất giấy và các chất thải rắn,…Về thành phần cấu tạo, lignocellulose gồm cellulose, hemicellulose
và lignin Số lượng mỗi loại polymer thay đổi tùy loài, tuổi và từng bộ phận khác nhau của cây
Hình 2.1 Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose
Nguồn: Pérez và cộng sự (2002)
Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất cồn sinh học Tuy nhiên đây là một hợp chất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên vì nó có cấu trúc đa dạng và phức tạp, bao gồm các thành phần có độ polymer hóa cao và liên kết với nhau một cách chặt chẽ Do đó muốn phân hủy được chúng, cần phải có một hệ enzyme chuyên biệt, đòi hỏi một hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp hệ enzyme để phân hủy chúng (Himmel và cộng sự, 2007)