Biểu hiện gen flic cải biến của salmonella dublin trong escherichia coli và đánh giá hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp

Hà Nội - 2020TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********************** NGUYỄN THỊ NHUNG BIỂU HIỆN GENEfliCCẢI BIẾN CỦASalmonella dublinTRONGEscherichia coliV

Hà Nội - 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

**********************

NGUYỄN THỊ NHUNG

BIỂU HIỆN GENEfliCCẢI BIẾN CỦASalmonella

dublinTRONGEscherichia coliVÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

NGUYỄN THỊ NHUNG

BIỂU HIỆN GENEfliCCẢI BIẾN CỦASalmonella

dublinTRONGEscherichia coliVÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Võ Viết Cường PGS.TS Nguyễn Lai Thành

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được nhiều chỉ bảo,động viên, giúp đỡ của các thầy cô giáo, cán bộ nghiên cứu, bạn bè, đồng nghiệp và giađình.

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn TS Võ Viết Cường - Phòng Độc họcvà Các bệnh nhiệt đới - Viện Y sinh nhiệt đới, người luôn động viên, hướng dẫn và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp của mình.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Lai Thành

-Bộ môn Sinh học Tế bào – Khoa Sinh Học - ĐH Khoa học tự nhiên- ĐHQG Hà Nội, thầy đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và cho tôi những lời khuyên quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường.

Cũng nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo khoa Sinhhọc - Trường Đại học Khoa học tự nhiên, đã truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình đào tạo tại trường.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ nghiên cứu, kỹthuật viên Viện Y sinh nhiệt đới – Trung tâm nhiệt đới Việt Nga, đã luôn đồng hành và giúp tôi hoàn thành khóa luậnnày.

Cuối cùng, với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin dành cho gia đình và bạn bè,những người đã luôn hỗ trợ động viên tinh thần tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, ngày 21 tháng 02 năm 2020

Nguyễn Thị Nhung

MỤC LỤC

MỞĐẦU 1

CHƯƠNG 1-TỔNGQUAN 2

1.1 Salmonelladublin 2

1.2 Proteinflagellin 3

1.2.1 Đặc điểmcấutrúc 3

1.2.2 Flagellin trong đáp ứngmiễndịch 4

1.2.3 Ứng dụng của flagellin trongthựctiễn 5

1.3 Nghiên cứu sản xuất flagellin táitổhợp 8

1.3.1 Tổng hợp gene fliC mã hóachoflagellin 8

1.3.2 VectorpE-SUMO3 9

1.3.3 Chủng E coli sử dụng cho nhân dòng vector và biểu hiện protein tái tổ hợ.10CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU,PHƯƠNGPHÁP 13

2.1 Vậtliệu 13

2.1.1 Đối tượngnghiêncứu 13

2.1.2 Hóa chất vàthiếtbị 14

2.2 Phương phápnghiêncứu 17

2.2.2 Khuếch đại gene và tinh sạch sảnphẩmPCR 18

2.2.3 Cắt gene và vector bằng enzyme cắtgiớihạn 18

2.2.4 Ghép genevàovector 19

2.2.5 Biến nạp vào tếbàoE.coli 20

2.2.6 Tinhsạchvàđịnhlượngproteinflagellintáitổhợp 21

2.2.7 PhươngphápđọctrìnhtựacidaminbằngLC/MS 22

2.2.8Cácphầnmềm,chươngtrìnhtinsinhhọcsửdụngtrongnghiêncứu 23

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀTHẢOLUẬN 24

3.1.1 Khuếch đại gene và tinh sạch sảnphẩmPCR 24

3.1.2 Cắt gene và vector bằng enzyme cắtgiớihạn 25

3.1.3 Ghép gen vào vector và biến nạp vàoE.coliDH5α 26

3.1.4 Nhân dòngvectorpSUMO_fliC 26

3.2 Biểu hiện protein FliC táitổhợp 27

3.2.1 Biến nạp pSUMO_fliC vào E coliRosetta 1và so sánh kích thước gene fliC ở2 chủngE coli 27

3.2.2 Biểu hiện flagellin dạng dung hợp trong tếbàoE.coli 28

3.2.3 Tối ưu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào biểu hiệnE.coliRosetta1 29

3.3 TinhsạchvàđịnhlượngproteinFliC 38

3.3.1 Xử lý tiềntinh chế 38

3.3.2 Tinh sạch protein SUMO-fliC bằng sắc kýáilực 39

3.3.3 Đánh giá sự ổn định cấu trúc của protein dung hợp trong quá trình tinh sạchbằng phương phápWesternblot 40

3.3.4 Giải trình tự và cấu trúc protein flagellin táitổhợp 42

KẾT LUẬN VÀKIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆUTHAM KHẢO 46

PHỤLỤC 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Vikhuẩn Salmonella[9] 2

Hình 1.2: Lát cắt ngang cấu trúc roi (a) và cấu trúc proteinflagellin (b)[36] 4

Hình 1.3: Cơ chế bảo vệ phóng xạ củaflagellin[54] 7

Hình 1.4: Trình tự amino axit của flagellin sử dụng trongthínghiệm 9

Hình 2.1: Cấu trúc gene fliC 3cải biến 13

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kếthínghiệm 17

Hình 2.3 Sơ đồ cấu tạo đơn giản của hệ thốngkhốiphổ 23

Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại 3genefliC 24

Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm cắt gene fliC vàvectorpSUMO3 25

Hình 3.3: Sự phát triển của tế bào E.coli saubiếnnạp 27

Hình 3.4: So sánh gene fliC 3 sau khi biến nạp vào 2chủngE.coli 28

Hình 3.5:Biểu hiện protein ở tế bào E.coliRosetta1 29

Hình 3.6: Biểu hiện của protein flagellin trong các môi trườngnuôi cấy 31

Hình 3.7: Kiểm tra sự biểu hiện của fliC ở các nồngđộIPTG 33

Hình 3.9: Kiểm tra sự biểu hiện của fliC ở các điều kiện thời gian thu mẫu khácnhau 37

Hình 3 10: Kết quả xử lý tiền tinh chế flagellin tái tổ hợptrongure 39

Hình 3.11: Kết quả tinh sạch flagellin tái tổ hợp bằng sắc kýáilực 40

Hình 3.12: Xác định fliC bằngWesternblot 42

Hình 3 13: Trình tự acid amin tương ứng gen fliC 3tự nhiên 43

Hình 3.14: Đoạn trình tự axit amin protein tái tổ hợp được đọcngẫu nhiên 43

Hình 3.15: So sánh cấu trúc 3D dự đoán của protein flagellin tái tổ hợp với cấutrúc flagellintựnhiên 43

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các loại enzyme, kháng thể và hóa chất dùng trongnghiên cứu 14

Bảng 2.2: Môi trường và dung dịch dùng cho nghiêncứu 15

Bảng2.3: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.4: Thành phần phảnứngPCR 18

Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp phảnứngcắt 19

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng nối gene fliC vàovectorpSUMO3 19

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

AD Antigenin determinant Vùng quyết định kháng nguyênAmp Ampicillin Kháng sinh Ampicillin

ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic

APN Ammoium persufate Ammoium persufate

Apoptosis Apoptosis Chết theo chương trình

Bp Base pair Cặp bazo-nito

Dntp Nucleoside 5’- triphosphates Nucleoside 5’- triphosphates

OD Optical density Mật độ quang học

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

pSUMO Plasmid Ssmall Ubiquitin-like

Modifier

Plasmid tái tổ hợp mang gen FliC

PVDF Polyvinylidin difluorit Polyvinylidin difluorit

PBS Phosphate buffered saline Phosphate buffered saline

Rpm Revolutions per minute Vòng/phút

SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodexin sunfat

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamit có chứa SDS

TAE Tris-acetate-EDTA Tris-acetate-EDTA

TEMED Tetrathylethylenediamine Tetrathylethylenediamine

VD Variable domains Vùng biến đổi kháng nguyên

Luận văn caohọc NguyễnThịNhung

1

MỞ ĐẦU

Protein flagellin có nguồn gốc từ vi khuẩnSalmonella spp, từ lâu đãđượcchú

ý đến như một tá dược tiềm năng bởi các đặc tính hỗ trợ miễn dịch Vớikhảnăngkích thích mạnh mẽ hệ miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch kích ứng và kích hoạt sự biểuhiện của rất nhiều gene liên quan đến quá trình ngăn cản tế bào apoptosis Vì vậy,protein flagellin có nhiều ứng dụng đối với ngành công nghệ sinh học và y dượcnhư làm vaccine, chất hỗ trợ miễn dịch, kích hoạt hệ miễn dịch và chốngungthư

Trên thế giới, flagellin tái tổ hợp đã được nhiều công trình nghiên cứuđểứngdụng trong sinh học và điều trị Như chế phẩm Entolimod với thànhphầnchínhlàflagellincóchứcnăngtăngcườngphụchồihệmiễndịch,giảmcáctổnthươngdobện

h phóng xạ cấp và tăng tái tạo mô mới Ở Việt Nam, cho tới nay, mới chỉ có một vàinghiên cứu làm về flagellin tái tổ hợp này Cụ thể như nhóm nghiên cứuPhòngKỹthuật di truyền, Viện công nghệ sinh học đã biểu hiện và tinh sạch các protein fliC,

fljB có nguồn gốc từ chủngS entericalnhằm tạo vaccine tái tổ hợp và kit chẩn đoán

bệnh do vi khuẩn Salmonella ở gà Tương tự cách tiếp cận này, nhómnghiênc ứ u

t r ư ờ n g Đ H K H T N , Đ H Q G T P H C M c ũ n g b i ể u h i ệ n t h à n h c ô n g

p r o t e i n fliCnguồn gốc từ chủngS Enteritidis Tuy nhiên các nghiên cứu này chủ

hướngtạocácproteinflagellinlàmkhángnguyênchogiacầm.Mứcđộbiểuhiệnvàtinh sạchprotein tái tổ hợp mới ở quy mô nhỏ, hiệu suất chưacao

Chính vì vậy, mục tiêu để tài nghiên cứu này là nhằm tạo nguồn cung cấpflagellin tái tổ hợp lớn, chủ động với định hướng sử dụng cho hỗ trợ tăng cường

miễn dịch trên người Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài luận văn:“Biểu hiệngene fliC cải biến của Salmonella dublin trong Escherichia coli và đánh giá hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp” Đề tài được thực hiện tại phòng Độc

học và các bệnh nhiệt đới – Viện Y sinh nhiệt đới – Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga

Mục tiêu nghiên cứu:

- Tách dòng và biểu hiện genefliCmã hóa protein flagellin trongE.coli

- Tinh chế protein flagellin tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu làmthuốc

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN

1.1 Salmonelladublin

Salmonella dublinlà một chủng huyết thanh của loàiSalmonella enterica,

thuộc ChiSamonella, họEnterobacteriaceae Đây là một họ vi khuẩn đườngruột,có

dạng hình que, trực khuẩn gram âm, có đường kính khoảng 0,7-1,5 µm và

dàitừ2-5µm, đa số các loài trong chiSalmonellađều di chuyển bằng tiên mao Đây là một

loài có thể nuôi trong phòng thí nghiệm với tốc độ phân bào là 40

phút.Salmonellacó dải nhiệt sống rộng, từ 6-46oC và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ

37oC Trong điều kiện nuôi cấy, đa số các phân loài và các kiểu huyết thanh đềusinh trưởng tốt trong điều kiện pH trung tính từ 6,5-7,5[9]

Hình 1.1: Vi khuẩn Salmonella[9]

Salmonella dublinlà loài ký sinh trên gia súc và hiếm khi lây sang các động

vật khác Khi bị nhiễm vi khuẩn này, gia súc có biểu hiện bị tiêu chảy nặng và các

cáctriệuchứngtươngtựnhưthươnghàn.Ởngười,S.dublincóthểgâyratiêuchảyvà thường dẫn đến nhiễm truyền huyết và áp xe Hiện tượng nhiễm trùngvớiS.dublincó các triệu chứng rất giống với nhiễm trùng huyết doS.choleraesuis[9].

1.2 Proteinflagellin

1.2.1 Đặc điểm cấutrúc

Flagella là cấu trúc phức hệ protein giúpSalmonelladi chuyển Cấu trúc

xuyên màng nàygồm3 phần: thể gốc (basal body), một móc (hook) và roi(filament).Trongđó,sợiroicóchiềudàikhoảng10-15µm,đườngkínhlà20nm,vàđược cấutạo bởi 20,000 protein flagellin Các tiểu phần flagellin này góp phầntạonên cấu trúcdạng xoắn kép và cung cấp lực đẩy giúp tế bào di chuyển trong môi trường nhớt.Lát cắt ngang cấu trúc sợi roi cho thấy, mỗi sợi roi là một cấutrúcdạng ống, rỗng,

gồm 1 mặt trong và 1 mặt ngoài (Hình 1.2) Protein flagellin có cấu trúc gồm 4

domain: D0, D1, D2, và D3 Chuỗi amino acid của FliC bắt đầu từ D0 và sau đó qua

D1, D2 và D3 rồi cuối cùng là quay trở lại D2, D1 và D0 (Hình 1.2) Domain D0

gồm 2 chuỗi xoắn α ở đầu N và đầu C Domain D1 gồm 3 cấu trúc xoắn α và mộtchuỗi kẹp tóc β, tạo nên mặt ngoài của ống Các domain D0 và D1 nối với nhaubằng một cấu trúc loop dài khoảng 20A Các domain D2 và D3 chủ yếu là các chuỗi

β và tạo nên phần nhô ra ở mặt ngoài ống Các tiểu phẩn D0 và D1 đượcxếpcạnhnhau và có chiều gần như song songvớichiều dọc của sợi roi, tạo nên sựổnđịnhtrong cấu trúc roi 11 tiểu phần này liên kết với nhau theo dạng vòng và tạo nên cấutrúc dạng sợi của flagella Một điểm đáng chú ý là tương của D0 chủ yếulàcáctương táckỵnước, trong khi D1 chủ yếu là các liên kết ưa nước, điều nàygiảthiếtrằng, có thể domain D0 tạo ra sự ổn định về cấu trúc của flagella với các liên kết kỵnước, còn domain D1 tạo nên tính đa hình của sợi[19]

Về trình tự, các domain D0 và D1 được xem là hai vùng có trình tự bảo thủ,không đổi giữa các loài, trong khi đó, các domain D2 và D3 lại có trình tự amino

acid không ổn định và thậm chí ở một số loài nhưPseudomonas aeruginosa, FliC còn bị khuyết hoàn toàn domain D3 [38, 49], vàBacillus subtilis, flagellin chỉ bao

gồm 2 domain D0 và D1 [48]

A B

Hình 1.2: Lát cắt ngang cấu trúc roi (a) và cấu trúc protein flagellin (b)[36]

1.2.2 Vai trò của Flagellin trong đáp ứng miễndịch

Flagellin là gì, chức năng, vai trò (sách miễndịch)

Khả năng kíchthíchđáp ứng miễn dịch của flagellin đượccácnhómnghiêncứucủaCiacci-Woolwinevàcs(1998)vàWyaintvàcslần đầughi nhận, các công

trình bước đầunày đãchứng minh proteinflagellincủaSalmonellacó thểlàmột

chấtkíchthíchcáccytokine[13,55] Sau đó,McDermottvàcs(2000)đãchứngminhđápứngviêmởbạchcầuđơnnhântrongtươngtácvớiflagellin[33],cùngvớiđólàsựtươngtáccủacácthụthểbềmặtcáctếbào miễn dịchbẩmsinh TLR5 vớiflagellinđượcHayashivà cs(2003) ghinhận[18].Cácnghiêncứu sau nàycũngđã chứngminhcácproteintái tổhợpbịcắtbỏvùngsiêu biếnkhônglàmảnhhưởngtới khảnănggâyđápứngmiễndịch cuaflagellin,thayvàođó,cácvùngtrìnhtựbảo thủD0 vàD1mớilàcácyếutốtquantrọnggâyđápứngmiễndịchthôngquaTLR5[12,35]

Flagellin kích hoạt các tế bào miễn dịch thông qua thụ thể TLR5 [15, 35].Thụ thể TLR5 có cấu trúc gồm 3 domain, vùng lặp lại giàu leucine (LRC), vùngxuyên màng, và domain TIR [3] Thụ thể này sẽ nhận biết flagellin thông qua trình

tự các amino acid ở các vùng bảo thủ đầu N và C của flagellin Liên kết TLR5 được hình thành thông qua các dimer giữa các amino acid vị trí 12 và 13 củavùng LLR của TLR5 [30] Sự liên kết của flagellin với TLR5 dẫn đến sự tăngcường biểu hiệu của một loạt các gene, đặc biệt là các gene liên quan đến tổng hợp

flagellin-cytokine, các gene điều hòa nitric oxide, H2O2, chemokine và các protein bảo vệ tế

bào chủ [3, 16, 52] Đối vớiSalmonella, flagellin được bơm vào tế bào chủ thông

qua hệ thống tiết loại III (Type III secretion system) [7] Khi vào trong tế bào chất,flagellin được các protein NAIP5 và NAIP6 thuộc họ protein NAIP (hay còn gọi là

họ protein NLR, protein ức chế apoptosis) nhận biết và liên kết tạo thành phứcflagellin- NAIP5/6 [25] Phức hệ này sẽ tương tác với thụ thể NLRC4, kết quả làhoạt hóa caspase-1 và kích thích quá trình chuyển hóa từ pro-interleukin-1β thànhinterleukin-1β [14] Trong quá trình này, các domain bảo thủ đầu N và C củaflagellin là các vị trí liên kết với TLR và amino acid 35 ở đầu C của flagellin là dấuhiệu nhận biết của NLRC4 [28]

Ngoài TLR5, flagellin cũng bị nhận biết ở một thụ thể khác là TLR11.Tương tác giữa flagellin và TLR11 phức tạp hơn rất nhiều so với TLR5.Nghiênc ứ u

c ủ a H a t a i v à c s ( 2 0 1 6 ) đ ã c h ứ n g m i n h T L R 5 c ó t h ể t ư ơ n g

ở cảpHkiềmvàacid,trongkhiđó,TLR11chỉtạoliênkếtvớiflagellintrongmôitrườngacid[17] Hơn nữa, nghiên cứu này cũng chỉ ra, các domain đầu N và C củaflagellincóthểđộclậptươngtácvớiTLR11,trongkhiđó,TRL5cầntươngtácvớicả hai đầudomain để kích hoạt hệ thống miễn dịch [12] Thụ thể TLR11 thườngcótrên bề mặtcác tế bào biểu mô của các cơ quan như ruột, phổi và da, chúng cóvaitrò như một

hệ thống báo hiệu sự xâm nhập củaSalmonellavào cơ thể chuột[47].

1.2.3 Ứngdụng của flagellin trong thựctiễn

1.2.3.1 Flagellin có vai trò như một chất chống ungthư

CácchấtchủvậncủaTLRđượcchứngminhlàcókhảnăngchốngungthưởrất nhiều các môhình động vật và một số đã được thử nghiệm trên người Bảnthânvai trò của các thụ thể TLR đã rất phứctạp Một số nghiên cứu đã chứng minh các thụ thể TLR4 và TLR9 đóng vai trò nhưmột chất kích thích và thúc đẩy tế bàoungthư phát triển Nhưng ở một số nghiêncứu khác, TLR3 và TLR5 lại là các chấtứcchế khối u [6, 24, 50] Các chất chủ vậncủa TLR, mà đặc biệt là flagellin, không có chức năng như một hoạt chất miễndịch, chống lại ung thư hoặc kích thíchnó[43,45].Sfondrinivàcs(2006)đãghinhậnflagellincókhảnănglàmtăngtốcđộphát

triển của khối u [46] Kết quả này có thể do sự sai hỏng trong miễn dịch gây ra bởiflagellin trong đáp ứng với khối u Sự tương tác của flagellin với khối umiễndịchcao gây ra đáp ứng Th1 và ức chế Tress, làm ức chế tăng trưởng u Tuynhiên,đốivớikhốiumiễndịchyếu,nhưmộthệthốngđốilập,flagellingâyrađápứngTh2vàngă

n chặn quá trình apoptosis ở các tế bào ung thư [31, 46] Kết quả nàychothấy,k h ả năngchốngungthưcủaflagellinphụthuộcrấtnhiềuvàocácsựthíchứngmiễndị

ch của khối u [46] Để ngăn cản hiệu ứng kích thích tăng trưởng khối u,nhiềunghiêncứu đã phối hợp flagellin với CpG-ODN, từ đó dẫn tới tăng biểu hiện của IL-12 vàIL-23, kết quả là kích thích các quá trình ức chế tăng trưởng ung thư[37].Vì vậy, đểthử nghiệm và kiểm chứng những vai trò sinh học của flagellin thì việc sản xuấtđược protein một cách chủ động trong phòng thí nghiệm với cấu trúcvàhoạt tính gầngiống nhất với tự nhiên là điều rất cầnthiết

1.2.3.2 Cơ chế bảo vệ nhiễm xạ cấp củaflagellin

Có rất nhiều các công bố khoa học về khả năng hỗ trợ điều trị bệnh phóng xạcấp của flagellin Nghiên cứu của Vijay-Kumar và cộng sự (năm 2008) cho thấychuột được tiêm với 1 μg flagellin trước khi chiếu toàn thân 2 giờ bằng tia γ,g flagellin trước khi chiếu toàn thân 2 giờ bằng tia γ,vớitổngliều 8Gycó khả năng sống sót 75%, sau 40 ngày chuột vẫn sống khỏe mạnh, không

có các dấu hiệu tổn thương tế bào biểu mô ruột [52] Nghiên cứu khảnăngbảo vệphóng xạ của chế phẩm Entolimod/CBLB502 với thành phần chính là flagellin củaSalmonella trên khỉ, với liều chiếu toàn thân 6,50 - 6,75 Gy cho thấy Entolimodgiảm nguy cơ tử vong 2- 3 lần, sau 48 giờ chiếu xạ so với nhóm đối chứng.Entolimod tăng cường phục hồi cơ quan tạo máu, cơ quan của hệthốngmiễn dịch,giảm các tổn thương bệnh phóng xạ cấp thể tiêu hóa thông qua cơchếbảo vệ quátrình apoptotic, tăng cường quá trình tái tạo mô mới[26-27]

Protein flagellin là chất chủ vận của thụ thể Toll-like 5 (TLR-5) có khả năngkích thích sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào Thụthể TLR-5 là protein xuyên màng, có mặt trên các tế bào miễn dịch (tế bào tua, bạchcầutrungtính,đạithựcbào,vv)vàtếbàobiểumôđườnghôhấp(mũi,họng,đườnghô hấp trên)

và phổi Phần nằm phía ngoài màng của thụ thể TLR-5 cóvùng giàu

leucine là nơi gắn của FliC để kích hoạt con đường phụ thuộc MyD88 [41].Saukhikích thích, MyD88 liên kết với phần nằm trong tế bào chất của TLR-5 vàIRAK-4 (kinase liên quan đến thụ thể interleukin-1), IRAK-1 và TRAF68 (yếu tốliên quan đến thụ thể TNF) IRAK-4 sau đó phosphoryl hóa IRAK-1 TRAF6 vớiIRAK1 đã được phosphoryl hóa giải phóng từ thụ thể và kích hoạtTAK1.TAK1(TGF-kíchhoạt kinase 1) sau đó phosphoryl hóa phức hợp IκB kinaseB kinase(IKK) và hoạt hóa protein mitogen (MAP) Kích hoạt phức hợp IKK dẫn đến kíchhoạt NF-κB kinaseB Cả hai kinase NF-κB kinaseB và MAP sau đógâyracảmứng của các gen liên

quan đến phản ứng viêm (Hình 1.3) Nhân tố NF- κB kinaseB có hiệu quả trong bảo vệ

phóng xạ thông qua việc kích thích sản xuất các loại cytokine gây viêm khác nhaugiúp ức chế quá trình tự chết của tế bào nhiễm xạ hoặc tham gia tái cấu trúc mô nhưIL-1, IL-3, IL-6,vv;tăngbiểuhiệngenchốngapoptoticnhưhọgenBcl-2,vv,tăngcácyếutốchốngoxyhóa khác nhau như r-GCS (tham gia tổng hợpglutathionie) làm giảm bớttổnthương do quá trình oxy hóa[29]

Hình 1.3: Cơ chế bảo vệ phóng xạ của flagellin [54].

Ngoài ra, các chemokin khi được các tế bào biểu mô tiết ra sẽ kích thích sự

di cư và trưởng thành của tế bào tua, hoạt hoá các tế bào lympho T thực hiện đáp

ứng miễn dịch đáp ứng Như vậy, có thể thấy flagellin đóng vai trò then chốt trong

cơ chế sản sinh đáp ứng miễn dịch, làm giảm độc tính của bức xạ với cơ thể

1.3 Nghiên cứu sản xuất flagellin tái tổhợp

Protein tái tổ hợp là những protein được sản xuất từ các đoạn ADN (gen)táitổhợp trong hệ thống tế bào hoặc cơ thể vốn không tạo ra nhiều hoặc không tạo ra tựnhiên protein này Các protein tái tổ hợp là công cụ quan trọng cho nghiên cứu cácquá trình sinh học như: phân tích điều hòa biểu hiện gen, phân tích cấu trúcvàchứcnăng của protein, phân tích tương tác protein - protein, tạo kháng thể.Tổnghợp mộtprotein tái tổ hợp đòi hỏi sử dụng một hệ thống biểu hiện phù hợp với cấu trúc vàhoạt tính của protein đó Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn chủng biểu

hiệnE coliRosetta 1 và vector pE_SUMO3 để tạo dòng tế bào biểu hiện FliC tái

tổhợp

Nhóm nghiên cứu của GS TS Trương Nam Hải - Viện Côngnghệsinhhọc/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cũng đã thành côngtrong nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch vùng epitope kháng nguyên roi flagellin

FliC, FljB củaS typhimuriumvàS enteretidistrong tế bàoE coli, tạo kit phát hiện nhiễmSalmonellavà vắc xin phòngSalmonellacho gà Trong nghiên cứunàyflagellin

được biểu hiện ở dạng cấu trúc dung hợp với Trx để làm tăng mức độbiểuhiện vàtính sinh miễn dịch của flagellin nên cấu trúc này không thể sử dụngđượccho người

[1-2] Nhằm tổng hợp flagellin ứng dụng trên người, chúng tôi sửdụnggenfliCđã loại

bỏ vùng biến đổi D2-D3 để giảm tính khángnguyên

1.3.1 Tổnghợp gene fliC mã hóa choflagellin

Như đã nói ở trên, các domain D0, D1, D2, D3 là các domain chính cấuthành nên protein flagellin, trong đó, các domain D0 và D1 được xem là các vùngtrình tự bảo thủ và có rất ít thay đổi giữa các loài Trong khi đó, các domain D2 vàD3 thường có những biến đổi đặc trưng cho loài

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 3 đoạn genefliCcó thông tin

trình tự khác nhau, được tổng hợp nhân tạo bởi Genscrip Trong đó, cấu

trúcfliC3được thiết kế dựa trên chế phẩm Entolimod (CBLB502) với thành phần

chínhlà

flagellinfliCtừ chủngSalmonella enterica serovar dublinkhai thác từ ngân hàng gene

quốc tế có mã số là AAA27081 Chế phẩm CBLB502 được sử dụng làm đối chứng[53]

Đoạn genefliC 3được thiết kế không có vùng D2 và D3 mà được thaythếbằng

một đoạn trình tự khoảng 16 amino axit tự bắt nguồn từ plasmid pGEX-KG (linker

domain) ở vị trí amino axit 176 và 402 theo đúng như thiết kế củaCBLB502(Hình

1.4) Toàn bộ trình tự nucleotide củafliC3 có kích thước 891 bp mã

hóachoflagellincókích

thướckhoảng33kDa.HaiđoạngensfliC1vàfliC2cónguồngốctừflagelinfliCcủachủngSal

monellaenterica serovarstyphymuriumvới mã số ngân hàng gene là NC_003197cũng

được loại bỏ vùng D2 và D3 với thiết kếfliC 2cácđoạn còn lại được nối với nhau

bằng một đoạn khoảng 29 amino acid bắt nguồntừplasmid pGEX-KG (linker

domain) có chiều dài 861 bp vàfliC 1813 bp[53]

Hình 1.4: Trình tự amino axit của flagellin sử dụng trong thínghiệm

1.3.2 VectorpE-SUMO3

Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phépphiên mã các gen được tách dòng và dịch mã các mARN của chúng trong tếbàovậtchủ để tổng hợp protein đích Vector có thể là plasmid, phage,cosmid

Vector pE-SUMO3 (5743 bp) của LifeSensors là vector thương mạiphổbiếnđược sử dụng trong nghiên cứu protein tái tổ hợp pE_SUMO3 có cấutrúcgồmđiểm khởi đầu sao chép (Ori) là vị trí gắn của DNA polymerase; các gen chỉthị chọn lọc (gen kháng kháng sinh ampicillin hoặc kanamycin) giúp sàng lọc cácdòng tế bào mang plasmid trên môi trường chọn lọc, vùng đa nhân dòng (MCS)(chứatrìnhtựcắtcủacácenzymecắtgiớihạn)thuậnlợiđểđưagenđíchvàovector

Vector pE-SUMO3 cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp đích dướidạngdunghợp với protein SUMO3 nhằm cải thiện tối đa mức độ biểu hiện và tính tan của

protein đích trong tế bàoE coli Đặc biệt, vector này thích hợp với những protein

cần chính xác axit amin đầu N để có hoạt tính, duy trì thời gian bán rã, nghiên cứucấu trúc, protein trị liệu (LifeSensors) Điều này rất phù hợp để lựa chọn pE-

SUMO3 làm vector biểu hiện genefliCtạo protein flagellin tái tổ hợp Việc giữ ổn

định được vùng bảo thủ D0 và D1 (thuộc đầu N, đầu C) của flagellin làrấtquantrọng, vì thụ thể TLR-5 sẽ nhận biết và liên kết với flagellin thông qua trình

tự các amino acid vùng này, dẫn đến sự tăng cường biểu hiện của một loạt cácgene,đặcbiệt là các gene liên quan đến tổng hợp cytokine, các gene điều hòa nitricoxide, chemokine và các protein bảo vệ tế bào chủ [3], từ đó kích hoạt hệ thốngmiễn dịch của tếbào

Hơn nữa, pE-SUMO3 chứa trình tự mã hóa oligo-histidine (His-tag), hỗ trợviệc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho sự phát hiện protein mục tiêu ở dạngdung hợp nhờ kháng thể đặc hiệu với His-tag [5] Sau khi tinh sạch, protein đíchđược cắt ra khỏi protein dung hợp với SUMO bằng enzyme SUMO protease 2 làmột enzyme có khả năng nhận biết cấu trúc bậc ba của SUMO để cắt thay vì nhậnbiết trình tự axit amin bậc một, tránh hiện tượng cắt không đặc hiệu trong phân tửprotein [32]

1.3.3 ChủngE.colisửdụngchonhândòngvectorvàbiểuhiệnproteintáitổhợp

Lựa chọn hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp thích hợp là yếu tố quan trọngđểđạtđượcnăngsuấtvàchấtlượngmongmuốn.Mỗihệbiểuhiệnđềucónhữngưuđiểm và nhượcđiểm nhất định, phù hợp với đặc điểm của gen và protein ngoạilai.Ví dụ như để biểuhiện protein cần có quá trình cải biến sau dịch mã nhưglycosylhóa protein cần sửdụng hệ thống biểu hiện nhân thực như nấm men, côn trùng,vv.Tuy nhiên, các hệbiểu hiện này rất tốt cho các protein phức tạp nhưnghiệusuấtthấp, chi phí sản xuấtlớn, thời gian nuôi cấy dài Với các protein từ sinh vật nhân sơ, hệ biểu hiện là vikhuẩn sẽ có nhiều ưu thế nổi trội với tính phù hợp củahệthống biểu hiện với đặc

điểm cấu trúc protein hầu như không có cải biến Do đó,E.

colikhi được nghiên cứu và phát triển đã trở thành hệ biểu hiện hiệu quả và rất phổ

biến đối với các protein tương đối đơn giản

Vi khuẩnE coliđược sử dụng rộng rãi và sớm nhất Những protein sảnxuấttừE.colithườngđượcsửdụngtrongnhiềulĩnhvựcnhưnghiêncứucấutrúc,côngnghiệ

p dược phẩm, công nghiệp enzyme và thực phẩm.E colicó nhiều ưuđiểmnhư thao

tác đơn giản, thời gian sinh trưởng ngắn (thời gian thế hệ là 20phút),môitrườngnuôicấyđơngiản,chiphíthấp,độổnđịnhcủaproteincaomàhiệusuấtsinhtổn

g hợp protein lớn Hơn nữa, có rất nhiều chủngE colikhác nhau

nhưBL21,Rosettagami mang promoter mạnh, điều khiển chặt chẽ quá trình sản

xuất protein ngoại lai Lượng protein ngoại lai biểu hiện trong tế bàoE colicó thể

lên tới50%protein tổng số của tế bào[42]

Khi sản xuất các protein trị liệu dùng trong lĩnh vực y khoa, protein cần phảiđược loại bỏ lipopolysaccharide (nội độc tố) để hàm lượng của chúng nằm trong

giới hạn cho phép Vì trong quá trình sinh trưởng,E colitích lũy các nội độc tố có

thể gây ra phản ứng phụ cho người và động vật qua đường máu [22]

Các gen đích được nhân bản trong tế bàoE colidưới sự kiểm soát củacáctín

hiệu phiên mã T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase không những làm tăngmức độ biểu hiện mà còn chỉ biểu hiện gen duy nhất được nhân bản ởT7promoter.Khi có mặt lactose hoặc các chất đồng hình với lactose trong tế bào, T7RNA polymerase sẽ được kích hoạt Gen ngoại lai được điều hòa phiên mãthôngquaoperonlacUV5.Dođó,đểkíchhoạtlacpromoter,chấtcảmứngIPTGthườngđượcsửdụng.PhântửIPTGvìcócấutrúctươngtựnhưlactosenênsẽgắnđượcvàochấtức chế (protein lacI)làm thay đổi cấu hình của chất ức chế nên không bámđượcvào lac operator Sau đó,T7 RNA polymerase được kích hoạt nhanh chóngphiênmã gen ngoại lai để dịch mãtổng hợp nên protein đích[22]

Các chủngE coliRossetta 1 bắt nguồn từ chủng BL21 lacZY mang đột biến

mất gene lacY mã hóa cho lac permease Việc đột biến gene lac permease có tácdụng làm cho tối ưu khả năng tiếp nhận chất cảm ứng IPTG trong tất cả các tế bào

trong quần thể Khi biểu hiện ở mức thấp, chủngE coliRosseta 1 có thể làm tăng

cường tính tan và hoạt tính của các protein đích Ngoài ra, chủngE coliRosetta1còn

chứa plamid pRARE mang các gene mã hóa các tARN nhận biết các codon hiếm

trongE.colinhư AGG, AGA (arginine), AUA (isoleucine), CUA(leucine),CCC

(proline), giúp tổng hợp các protein có nguồn gốc từ sinh vật nhân thực Vì vậy, quátrình tổng hợp protein ngoại lai tránh được các hiện tượng gắn nhầmaxitamin hoặcphân cắt chuỗi peptide, ảnh hưởng đến mức độ tổng hợp và hoạt tínhcủaprotein đích[21, 42] Vì thế, đây là chủng rất thích hợp để sử dụng làm hệ thống biểu hiệnprotein flagellin trong nghiên cứu này

Chủng tế nàoE.coliDH5α cũng là một chủng tế bào được phát triểnnhằmmục

đích chuyển gene Tuy nhiên, dòng tế bào này đã được gây các đột biếnđểnâng cao

hiệu quả biến nạp và phát triển tốt hơn [40] Cụ thể, chủngE.coliDH5α bị gây đột

biến lacZ Delta M15 nhằm giúp người thực hiện có thể sàng lọc các tếbàochứa genetái tổ hợp bằng phương pháp chọn lọc xanh- trắng [10] Đột biếnEndA1,khiến chocác gene biến nạp vào tế bào không bị enzyme endonuclease phân hủy, nhờ đó nâng

cao hiệu quả biến nạp [11] Ngoài ra, chủng tế bàoE coliDH5α còn chứađộtbiếngenerecA1.GenerecAlàgenemãhóacho1proteincókíchthước38kDa, chịu

trách nhiệm sửa chữa các sai hỏng và bất thường của ADN Dựa trêncácphân tích

về đặc điểm phân tử của hệ thống recA, Cox và cs (1991) đã cung cấp các bằngchứng thuyết phục rằng nhiệm vụ chính của recA là sửa chữa ADN [34] Cụ thể,protein recA đã biến đổi để trở thành trung tâm của hệ thống sửa chữa ADN tái tổ

hợp, vì vậy việc tạo ra đột biến bất hoạt gene này trongE coliDH5α làm tăng độ ổn định của quá trình biến nạp [23].E coliDH5α đã là lựa chọn hàng đầu cho nhiều

nghiên cứu về chuyển gen, đặc biệt là nhân dòng vector và nghiên cứu của chúng tôicũng không ngoại lệ Đây chính là hệ thống có rất nhiều ưu điểm đểđảmbảo hiệucủa của nghiên cứu đã được chúng tôi sửdụng

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vậtliệu

2.1.1 Đối tượng nghiêncứu

2.1.1.1 Plasmid và mồi nhângene

- Trong nghiên cứu này genfliC 3cải biến có nguồn gốc từ chủngSalmonella

enterica serovar dublin, có mã số ngân hàng gen là AAA27018 Ngoài ra, chúng tôi

cũng thiết kế và biểu hiện thêm 2 dòng tế bào cải biếnfliC 1vàfliC 2có nguồn gốc từ chủngSalmonella enterica serovar styphymurium, mã số ngân hàng gen là NC_003197 nhằm so sánh và mở rộng nghiên cứu [4] Các đoạn genefliC 1, fliC 2

và fliC 3dạng cải biến được tổng hợp trong vector pUC bằngphươngpháp tổng hợp

gene (Gene Script) Trình tự các đoạn genfliCcải biến đượctrìnhbày trong phụ lục9.

Hình 2.1: Cấu trúc gene fliC 3 cải biến.

- VectorpSUMO3cókíchthước5743bpđượcdùngchomụcđíchtáchdòngvà biểu

hiện genefliC(Life-sensor) (phụ lục1).

- Cặp mồi nhân genefliCdo Phòng độc học và các bệnh nhiệt đới, Viện Y

sinh nhiệt đới thiết kế (trình tự gạch chân là trình tự nhận biết của enzyme giới hạntươngứng):

F_Flic/BsaI: 5’TATATGGTCTCTAGGTATGGCACAAGTCATTAAT 3’ R_Flic/SalI: 5’CCGGCGCGGTCGACTTAACGCAGTAAAGAGAG 3’

2.1.1.2 Chủng vi sinhvật

- ChủngEscherichia coliDH5α (cung cấp bởi Viện Công nghệ sinh học)

được dùng cho mục đích tách dòng genefliC.

- ChủngEscherichia coliRosetta 1 (Viện Công nghệ sinh học) đƣợcdùngcho

mục đích biểu hiện protein tái tổ hợp

Enzyme cắt giới hạnBsaI,SalI,XbaI, T4 DNA ligase, thang

chuẩn protein, loading dye 6X, TAE 50X, kháng thể 2

kháng chuột cộng hợp peroxidase, màng PVDF

Thermo

Kháng thể 1 kháng histag Invitrogen

NaCl, CaCl2, NaOH, IPTG, Na2HPO4, NaH2PO4, K2HPO4,

KH2PO4, Tris-HCl, ammonium persulfate (APS),

acrylamide, bis-acrylamide, glycine, glycerol, Temed,

ethidium bromide, Skimmed milk, tween 20, Ethanol,

Methanol, acid axetic, urea, Phenylmethanesulfonyl Fluoride

(PMSF), Comassie Brilliant Blue,

2-Mercaptoethanol, Imidazol, Bromphenol Blue

Merck

Yeast extract, trypton, LB-broth Bio-basic

GeneJET PCR Purification Kit Thermo

Mega quick spin plus Fragment DNA purification Kit Intron

plasmid GenJET Plasmid Miniprep Kit Thermo

Bảng 2.2: Các môi trường và dung dịch dùng cho nghiên cứu

Môi trường SB - 3 g NaH2PO4; 1,5 g KH2PO4; 0,25g NaCl; 0,5g

Tris HCl 20mM, pH 8 3,152 g Tris HCl Hòa tan trong nước đến 1 lít, pH 8Treatment buffer 6X 0,453g tris-base, 6 ml glycerol, 1,2 sg SDS, 6 mg bromophenol blue, 1 ml 2-mecaptoethanol.Agarose 1% 1 g bột agarose pha trong đệm TAE 1X đến 100 mlDung dịch nhuộm DNA Ethidium bromide pha trong nước cất đến nồng

độcuốicùng là 0,5 µg/mlĐệm chạy điện di

protein 14,4 g glycine; 3,02 g trisbase; 1 g SDS Bổ sungnướccất đến 1 lít

Gel polyacrylamide

Gel tách 12,6% (1 bản): 1,0 ml H2O; 2,25 ml Tris HCl

pH 8,8; 1,8 ml Glycerol 50% ; 3,8 ml Bis- acrylamide30%; 90µl SDS 10%; 60µl APS 10%; 6µl Temed.Gel cô 5% (1 bản): 1,3 ml H2O; 0,5 ml Tris HCl pH6,8; 0,35 ml Bis-acrylamide 30%; 10 µl SDS 10%; 20

µl APS 10%; 2 µl Temed

Dung dịch nhuộm gel

SDS-PAGE 0,025g Coomassie Brilliant Blue; 40 ml methanol; 10 ml acid axetic Dẫn nước cất đến 100 mlDung dịch rửa gel 5 ml methanol; 7,5 ml acid acetic Dẫn nước cất đến100 mlĐệm cho Western blot:

- 25 ml Tris-HCl 1M, pH 7,5; 10 ml NaCl 5M Dẫnnước cất đến 1lít

- là dung dịch TBS 1X bổ sung thêm Tween-20 đếnnồng độ cuối cùng là0,1%

- 5g skimmed milk pha trong 100 ml TBS1X

Bảng2.3: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Tủ an toàn sinh học BMB-II-Laminar-S LAMSYSTEMS, Đức

Máy ly tâm lạnh dung tích lớnX-15R Beckman coulter, Hoa KỳMáy ly tâm để bàn Eppendorf, Đức

Máy điện di ADN Biorad, Hoa Kỳ

Bể ổn nhiệt WCB-22 DAI HAN, Hàn Quốc

Máy đo quang phổ BioSpec-mini, Hoa Kỳ

Máy lắc ổn nhiệt NB-205VL N-biotek, Hàn Quốc

Máy nhân bản gene Eppendorf, Đức

Nguồn và bể điện di protein Cleaver Scientific, Anh

Nguồn và bể chạy western blot Cleaver Scientific, Anh

2.2 Phương pháp nghiêncứu

2.2.1 Thiết kế thínghiệm

Nghiên cứu này được tiến hành dựa theo sơ đồ

Hình 2.2 Theo đó, mẫu ADN ban đầu sẽ được khuếch đại bằng

phảnứngPCR và tinh sạch, sản phẩm thu được được cắt bằng enzyme cắt giới hạnvớicặpenzyme BsaI và SalI nhằm tạo đầu nối với vector Sau khi vector và ADNđượccắt,chúng được ghép với nhau tạo thành vector SUMO_fliC Vector hoàn

chỉnhcuốicùng được biến nạp vào dòngE coliDH5α để nhân lên lượng lớn và tiếp tụcbiếnnạp vào tế bàoE coliRosetta 1 để sản xuất protein flagellin Sản phẩm protein

flagellin tái tổ hợp thu được sẽ được tinh sạch và định lượng Protein flagellintáitổhợp sau đó sẽ được giải trình tự và dự đoán cấu trúc 3D để so sánh vớiflagellintựnhiên

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm

2.2.2 Khuếchđại gene và tinh sạch sản phẩm PCR

GenefliCcải biến từ vector pUC-FliC được khuếch đại bằng cặp mồi đặc

hiệu: F-FliC/BsaI và R-FliC/SalI

Dự kiến sản phẩm PCR của các genfliC 1,fliC 2vàfliC 3sẽ có kích thước lần

Sau khi khuếch đại bằng phản ứng PCR, sản phẩm PCR của genefliC 1,

fliC2, fliC 3được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET PCR Purification Kit theo

hướngdẫncủa nhà sản xuất và điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả

2.2.3 Cắt gene và vector bằng enzyme cắt giớihạn

Enzyme giới hạn là một endonuclease nhận biết và cắt ADN tại trình tự đặchiệu gồm 4, 6 hoặc 8 nucleotide tạo thành đầu bằng hoặc đầu dính Plasmid

pSUMO3 và sản phẩm PCR khuếch đại đoạn genefliCđã tinh sạch được xử lý tạo đầu dính bằng cặp enzyme giới hạnBsaIvàSalI(Thermo) Thành phần phản ứng

được thể hiện ở bảng dưới đây:

Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt

Thành phần Thể tích (µl)Nước cất 2X 30

10X Tango buffer 5DNA/ pSUMO3 10

2.2.4 Ghépgene vàovector

GenefliCvà vector pSUMO3 được cắt bởi cặp enzyme giới hạnBsaIvàSalI, sau đó genefliCvà vector pSUMO3 được tinh sạch và trộn với nhau theotỷlệ3 : 1 để tiến hành phản ứng ghép nối đoạn genefliCvào vector pSUMO3 sử dụng enzymeT4DNAligase[53].Thànhphầnphảnứngđượcthểhiệnởbảngdướiđây:

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng nối gene fliC vào vector pSUMO3

phẩmlạiđược biến nạp vào tế bàoE.coliDH5α bằng phương pháp sốc nhiệt Plasmid táitổhợp pSUMO3 mang genefliCđược ký hiệu là pSUMO-fliC sẽ được sàng

lọctrênmôi trường LB có bổ sung Ampicillin và nuôi cấy ở 37°C qua đêm

2.2.5 Biếnnạp vào tế bào E.coli

2.2.5.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coliD H 5 α

Sản phẩm của phản ứng nối được biến nạp vào tế bào khả biếnE.

colibằngphương pháp sốc nhiệt với quy trình như sau: 5 µlsảnphẩm lai hoặc 1

µlADNplasmid được cho vào ống eppendorf 1,5 ml đã chứa 50 µl tế bào khả

biếnE.coli,đảo nhẹ nhàng cho đều, đặt tế bào trên đá trong 30 phút Mẫu trên đá lạnh

đượcđặtngay vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42°C trong 90 giây Sau đó mẫu được lấyravàlàmlạnh nhanh trên đá khoảng 2 phút Ống tế bào được bổ sung 600 µlmôitrườngLBlắc ở 37°C trong 45 phút Khi các ống tế bào vẩn đục, đem ly tâm

trong5phútởnhiệtđộphòng,bỏ300µldịchnổi.Dịchcònlạiđượctrộnđềurồicấytrải trên 1đĩa petri có chứa môi trường LBA đặc, nuôi ở 37°C qua đêm Kiểmtrakhuẩn lạc,bọc đĩa bằng parafilm và cất ở 4°C[44]

2.2.5.2 Tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp từ tế bào E.coli

ADN plasmid được tách sử dụng hóa chất và quy trình của bộkitGeneJETPlasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) Sản phẩm ADN plasmidđược hòatrong50 µl đệm elution buffer và bảo quản ở -20°C

2.2.5.3 Biến nạp và biểu hiện protein tái tổ hợp trên tế bào E coli Rosetta1

đ ư ợ c h o à l ạ i t r o n g đ ệ m T r i s - H C l 2 0 m M , p H 8

đ ể đ ạ t O D 6 0 0 = 1 0 S a u đó,50µl dịch tế bào được trộn với 10µlđệm biến tính mẫu 6X và biến tính ở100°C

trong 15 phút Hút khoảng 5µl mẫu tra vào giếng SDS-PAGE 12,6% và điện dikiểm tra sự biểu hiện flagellin[44].

Theo như nhà cung cấp, dòng tế bàoE coliRosetta 1 thích hợp để

biểuhiệncác protein tái tổ hợp nhưngtỷlệ biến nạp thành công vào dòng tế

bàonàykhôngcao như dòngE coliDH5α Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiếnhànhtối ưu hóa quy trình biến nạp plasmid vàoE coliRosetta 1 của Sambrook

vàcs(2003) Tế bào thu được sẽ được tách và điện di trên gel SDS-PAGE, vàphântíchhình ảnh bằng phần mềm ImageJ để xác định điều kiện tối ưu Các điểmđượchiểuchỉnhgồm:

- Thành phần môi trường nuôi cấy cảmứng

- Nồng độ chất cảmứng

- Nhiệt độ biểuhiện

- Thời gian thumẫu

2.2.6 Tinhsạch và định lượng protein flagellin tái tổhợp

2.2.6.1 Điện di protein trên SDS-PAGE và phân tích hìnhảnh

Protein được điện di biến tính trên gel SDS-PAGE theo phương pháp củaLaemmli (1970) Hút khoảng 5µl dịch protein biến tính tra vào giếng và điện diprotein ở hiệu điện thế 200V trong 1 giờ Gỡ gel và nhuộm trong dung dịchCoomassie brilliant blue ít nhất 1 giờ Rửa gel bằng dung dịch rửa cho tới khi quansát thấy băng [51] Chụp ảnh và phân tích kết quả bằng phần mềm ImageJ

2.2.6.2 Tinh sạch protein flagellin tái tổ hợp bằng sắc ký ái lựchis-tag.

Dịch tế bào sẽ được phá vỡ bằng sóng siêu âm trong 15 phút, sửdụngmáysiêu âm tự động (20ml) Ly tâm dịch phá tế bào ở 11000 vòng/phút trong

10 phút thu pha tủa chứa protein SUMO-fliC Phần cặn được hòa lại trong đệmchứa50mMPBS, 500mM NaCl, 1% triton X100 và 4 M urea và lắc nhẹ trong 10phút Sau đó ly tâm dịch ở 11000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi chứa

SUMO-fliC.TiếnhànhsắckýtrêncộtsắckýHitrap(GEHealthcare):Đưatoànbộdịchnổichứa proteinlên cột Rửa cột bằng 35 ml đệm rửa I có chứa 10 mMImidazole,đẩyproteinSUMO-

fliCrakhỏicộtbằng20mlđệmthumẫuchứa100mMImidazole

thu 10 phân đoạn mỗi phân đoạn thu 2 ml, rửa cột lần hai bằng đệm rửa I chứa 500

mM Imidazole Đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford và điệndikiểmtra protein trên gel SDS-PAGE12,6%

2.2.6.3 Thẩm tách loạimuối

Dịch protein sau tinh sạch sẽ chứa 2M ure được đặt trong túithẩmtách(SnakeSkinTMDialysis Tubing, 10K MWCO, Thermo Scientific) và đượcthẩmtích2 lần trong dung dịch đệm (20mM Tris-HCl, pH 8, không chứa ure), mỗilần trong 1 giờ ở 4oC Hàm lượng protein sau thẩm tích được định lượng bằngmáynonodrop.Dịch protein sau thẩm tích được bảo quản ở -80oC

2.2.6.4 Phương pháp lai Westernblot

PhươngphápWesternblotnhằmxácđịnhflagellintrongmẫuđượctiếnhànhtheo

phương pháp của Burnette (Burnette, 1981) Sau khi điện di trênSDS-PAGE,proteinđược chuyển lên màng PVDF bằng bộ chuyển màng Biorad (Mỹ) ởhiệuđiện thế100V trong 1 giờ Sau đó phủ màng bằng dung dịch Skimmed milk 5% để che chắnnhững vị trí không gắn protein Rửa màng bằng đệm TBS 1X rồi ủ màng với khángthể 1 trong 1 giờ Tiếp theo, màng được rửa lại bằng đệm và ủ vớikhángthể 2 Hiệnmàu bằng dung dịch TMB và quan sát sự xuất hiện của băng protein flagellin trênmàng lai[54]

2.2.7 Phương pháp đọc trình tự acid amin của bằngLC/MS

Phương pháp đọc trình tự protein được thực hiện theo mô tả của HãngProteomics International Ban đầu, các mẫu protein tinh sạch sẽ được phân mảnhbằng sử dụng trypsin phân hủy protein hình thành các đoạn peptit đạt các tiêu chuẩnphân tích (thường dưới 20 axit amin) (Bringans et al Proteomics 2008) Sau đó,các đoạn peptide được phân tích bằng phân tích LC-MS:

Hình 2.3 Sơ đồ cấu tạo đơn giản của hệ thống khối phổ

Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity HPLC,các acid amin có thể được phân tách Các peptit có cùng kích thước sẽ lầnlượtđivào thiết bị phun Agilent 1260 Chipcube Nanospray trên máy quang phổ khối Agilent

6540.Các peptid sẽ được phun tơi thành các giọt nhỏ đa điện tích ra khỏiđầukim phun.Kếtquả là chỉ còn peptid tích điện và bay vào bộ phận phân tích khối của máy khối phổ

MS.Các peptide được tải lên cột ProtID-Chip-150 C18 sử dụng phađộnglà 1 gradiengồm nước / acetonitrile / axit formic 0,1% (v / v) đóng vai tròtrongsựphântáchpeptitvàtốiưucườngđộtínhiệu.Cáctínhiệuquangphổđượcphântíchđể xácđịnh các protein quan tâm bằng phần mềm Mascot sequence matching với cơ sở dữliệuMSPnr100database

2.2.8 Các phần mềm, chương trình tin sinh học sử dụng trong nghiêncứu

- Phần mềm BLAST-online được dùng để kiểm tra trình tựnucleotide

- Phần mềm ImageJ được sử dụng để đo độ sáng của băng điệndi

- Phần mềm GelQuant dùng để dự đoán kích thước băng độtbiến

- Phần mềm Design expert được sử dụng để phân tích tìm ra điều

kiệntốiưu biểu hiện của protein tái tổhợp

- Chương trình dự đoán cấu trúc 3D của proteinPHYRE2

- http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế và nhân dòng vector pSUMOfliC

3.1.1 Khuếch đại gene và tinh sạch sản phẩmPCR

Các đoạn genefliC1, fliC2, fliC3được khuếch đại bằng phản ứng PCRsửdụng

vector pUC_fliC làm DNA khuôn bằng cặp mồi đặc hiệu chứa trình tự nhận biết

củaBsaIvàSalI Gene thu nhận từ phản ứng PCR được tinh sạch bằng bộkitGenJet

PCR purification kit và sau đó kiểm tra kích thước bằng điện di trêngelagarose 1%

Theo đó như thiết kế, kích thước các genefliC 1,fliC 2vàfliC 3lầnlượt là 813 bp, 861

bp và 891 bp Kết quả trên bản điện di cho thấy, ở các giếng2,3, 4 đều xuất hiện cácbăng sáng, không có các băng phụ, điều này chứng tỏ cặp

thu genefliCkhông bị ngoạinhiễm.

Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại 3 gene fliC

Marker;Giếng 1: Đối

chứng âm;

Giếng 2:Sản phẩm PCR gene fliC

1;Giếng 3: Sản phẩm PCR gene fliC

2; Giếng 4: Sản phẩm PCR gene

fliC 3;

Các băng sản phẩm PCR đều trong khoảng 800-900bp, phù hợp với thiết kế mồi.

3.1.2 Cắtgene và vector bằng enzyme cắt giớihạn

Sản phẩm PCR của các genefliC 1, fliC 2, fliC 3sẽ được đem đi cắtbằngenzyme cắt giới hạnBsaIvàSalIcùng với vector pSUMO3 để tạo đầu dính.

Sản phẩm cắt được tinh sạch bằng kit sau đó được điện di trên gel agarose 1%đểkiểmtra (Hình 3.2) Ảnh điện di sản phẩm tinh sạch trên hình 3 chỉ ra rằng cácbăng DNAcókíchthướcđúngnhưlýthuyếtvàđủchấtlượngtinhsạchđểnốigene

Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm cắt gene fliC và vector pSUMO3

Giếng M: marker 1kb (Norgen);

Giếng 1: sản phẩm cắt gene fliC 1 bằng BsaI và

SalI;Giếng 2: sản phẩm cắt gene fliC 2 bằng BsaI và

SalI; Giếng 3: sản phẩm cắt gene fliC 3 bằng BsaI và

SalI; Giếng 4: sản phẩm cắt gene pSUMO3 bằng BsaI

và SalI.

Các băng của các gen fliC đều có kích thước phù hợp với thiết kế lý thuyết

3.1.3 Ghépgen vào vector và biến nạp vào E coliDH5α

Khi nằm trong hỗn hợp phản ứng nối gene, các đầu dính sẽ bắt cặp với nhautheo nguyên tắc bổ sung Phản ứng ghép gene theo tỷ lệ 3 gen : 1 vector, dướisựxúctác của enzyme T4 DNA ligase các đầu dính bổ sung sẽ bắt cặp với nhau để tạoplasmid tái tổ hợp pSUMO3_fliC Hỗn hợp của phản ứng lai được biến nạp

vàotếbàoE coliDH5α và sàng lọc trên môi trường chọn lọc có bổ sung khángsinhampicillin Trong vector pSUMO3 có chứa trình tự genblamã hóa cho

enzyme β- lactamase có khả năng phânhủychất kháng sinh ampicillin Vì vậy, chỉnhững tế bào mang plasmid biến nạp mới có khả năng sống trên môi trường khángsinh.Điềunày tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sàng lọc Sau khi nuôicấytrongmôi trường LB đặc có chứa ampicillin, tế bào được nuôi cấy ở 37oC qua đêmvàquansát sự hình thành khuẩn lạc Các khuẩn lạc này sẽ được nuôi cấy trong

môitrườngLBA cho tách chiết DNA plasmid để kiểm tra trình tự genfliCbằng phươngphápgiải trình tự Kết quả giải trình tự genfliCcho thấy đoạn genfliCtrong vector pSUMO3cókíchthướcgiốngnhưtrìnhtựgenfliCđặttổnghợp(Phụlục1).

Từ trình tự này, chúng tôi tiến hành so sáng lại với trình tựfliCban đầu bằng phần mềm BLAST Kết quả ghi nhận, trình tự được biến nạp vàoE.

coliDH5αcókíchthước891bp,tươngtựnhưthiếtkếbanđầu.Tỷlệnucleotidbắtcặpsaiđạt0%và

không xuất hiện các gap (nucleotid không bắt cặp) giữa 2 trình tự (Phụ lục 6) Kết quả giải trình tự của genfliC 1vàfliC 2cũng cho kết quả tương tự Nhưvậy,genfliCcải biến đã được tách dòng thành công trong vector pSUMO3, và trongquátrình biến nạp vào tế bàoE coliDH5α, không xuất hiện

các đột biến làm thay đổi trình tự của đoạn gene banđầu

3.1.4 Nhândòng vectorpSUMO_fliC

Khi trình tự genefliCgắn được vào vector pSUMO3 sẽ tạo nên tổ

hợpmớiđược gọi là pSUMO_fliC Khi đó, vector sẽ được đóng vòng và

enzymeβ-lactamasesẽđượcbiểuhiệnnhờhoạtđộngcủapromotorT7.KếtquảtrênHình3.3,ởđĩasố1tếb àoE.coliDH5αkhôngmangsảnphẩmlaiđượcnuôitrênmôitrườngLBđểkiểmtrakhảnăn

gpháttriểncủachủngsaukhisốcnhiệt.Kếtquảchothấy