(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC tập hóa SINH học TINH SẠCH và xác ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE tái tổ hợp

- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu trước tủa.. Xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa.. Tinh sạch protein - Trộn 1 ml dị

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HỨA TRƯỜNG CHINH - MSHV: 20C61005

TỪ KHỞI THÀNH - MSHV: 20C61012

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

AMYLASE TÁI TỔ HỢP

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH HỌC

Ngành: Hóa sinh học

Mã số ngành: 8420116

GVHD: TS Trần Quốc Tuấn

TP Hồ Chí Minh – Năm 2021

1

Mục lục

1 Tiến hành thí nghiệm 3

2 Tinh sạch Amylase tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực Ni2+-NTA agarose 3

3 Kết quả 4

4 Kết luận 15

1 Tiến hành thí nghiệm

- Ly tâm 100 ml dịch khuẩn ở tốc độ 7000 vòng/phút, ở 100C trong 10 phút để thu dịch enzyme ngoại bào bỏ sinh khối tế bào

- Dịch sau ly tâm lấy 50ml tủa muối và 50ml tủa dung môi hữu cơ

- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu (trước tủa)

- 2 mẫu tủa sẽ ly tâm, thu tủa và hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa) Xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa

- Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sạch bằng sắc ký ái lực

2 Tinh sạch Amylase tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực Ni 2+ -NTA agarose Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị cột

- Nhồi 1 lớp bông thủy tinh có độ dày khoảng 2 mm vào ống tiêm 3 ml (Lưu ý: bề mặt lớp bông bằng phẳng)

- Đặt một lớp giấy lọc lên cột

- Cố định cột lên giá đỡ và nối dây truyền dịch với cột

- Rửa cột với 1 ml đệm chiết tách, lặp lại 3 lần

Cân bằng Ni 2+ -NTA agarose

- Cho 500 µl dịch Ni2+-NTA agarose vào tube 1,5 ml; ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi

- Huyền phù tủa trong 1 ml đệm chiết tách, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa, bước này được thực hiện 3 lần

Tinh sạch protein

- Trộn 1 ml dịch enzyme sau tủa với Ni2+-NTA agarose cân bằng đã chuẩn bị ở bước trên, lắc ở 40C trong 1 giờ

- Sau 1 giờ, cho toàn bộ hỗn hợp protein và Ni2+-NTA agarose lên cột và thu dịch qua cột (FT – flow-through), để ổn định cột trong 10 phút

- Rửa phức hợp protein gắn với Ni2+-NTA agarose với 5 ml đệm rửa Thu nhận dịch rửa

giải Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong dịch rửa

- Thôi giải protein mục tiêu với 1 ml đệm thôi giải, lặp lại 5 lần Thu nhận các phân

đoạn protein thôi giải và bảo quản ở nhiệt độ lạnh Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong các phân đoạn

3

3 Kết quả

Đường chuẩn Bradford

Từ kết quả thu nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 µg/ml protein vẫn ghi nhận được giá trị

OD, điều này không đúng với lý thuyết Nên giá trị OD ở nồng độ 0 µg/ml protein sẽ được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng được hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2 được trừ cho 0.075 ở các nồng độ khảo sát; giá trị OD3 được trừ cho 0.076 ở các nồng độ khảo sát) Từ đó tính toán ∆OD giữa 3 lần lập lại, ta được kết quả như bảng sau:

Xây dựng đường chuẩn protein

Đường chuẩn tinh bột

Tương tự như trên, từ các giá trị OD ghi nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 µg/ml tinh bột vẫn ghi nhận được giá trị OD, điều này không đúng với lý thuyết Nên giá trị OD ở nồng độ 0 µg/ml tinh bột sẽ được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng được hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2, OD3 được trừ cho các giá trị tương ứng là 0.053, 0.054 và 0.055 ở các nồng độ khảo sát) Từ đó tính toán ∆OD giữa 3 lần lập lại, ta được kết quả như bảng sau:

Xây dựng đường chuẩn tinh bột

5

Nồng độ protein

Dịch

Enzyme thô trước tủa Enzyme tủa cồn Enzyme tủa muối

OD 595nm

0.118 0.12 0.121

Pha loãng 20 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein

Dựa vào phương trình đường chuẩn của protein: y = 0.001x + 0.0008 (phương trình 1) với

R2 = 0.9983, ta lần lượt tính nồng độ protein có trong:

❖ Protein trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)

Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 1 Từ đó ta suy ra được giá trị

x tương ứng với nồng độ protein có trong mẫu thử Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên nồng độ protein có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên

+ Với OD = 0.118 ➔

x = 117.2 µg/ml + Với OD = 0.120 ➔

x = 119.2 µg/ml + Với OD = 0.121 ➔

x = 120.2 µg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: ̅= 117.2+119.2+120.2 = 118.87 µg/ml

3

Vì mẫu được pha loãng 20 lần trước khi đo OD, nên [protein] = ̅× 20 = 2377.4 µg/ml = 2.3734 mg/ml Vậy trong 100 ml dịch nuôi cấy có: [protein] dịch enzyme thô = 2.3774 × 100 = 237.34 mg.

❖ Protein sau tủa cồn

Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa cồn tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 µg/ml

+ Với OD = 0.112 ➔ x = 111.2 µg/ml

+ Với OD = 0.111 ➔ x = 110.2 µg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 117.2+111.2+110.2 = 112.87 µg/ml

3

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml mẫu sau khi tủa cồn là: [protein] sau tủa cồn = ̅× 100 = 11287 µg = 11.287 mg.

Suy ra trong 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein] sau tủa cồn = 11.287 × 10 = 112.87 mg.

6

❖ Protein sau tủa muối

Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa muối tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.108 ➔ x = 107.2 µg/ml

+ Với OD = 0.110 ➔ x = 109.2 µg/ml

+ Với OD = 0.106 ➔ x = 105.2 µg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 107.2+109.2+105.2 = 107.2 µg/ml

3

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml mẫu sau khi tủa cồn là: [protein] sau tủa muối = ̅× 100 = 10720 µg = 10.72 mg.

Suy ra trong 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein] sau tủa muối = 10.72 × 10 = 107.2 mg Tinh sạch enzyme

pha loãng 30 lần (dịch rửa)

❖ Protein có trong dịch thôi giải 1 (TG1)

Cách tính nồng độ protein có trong TG1 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 (µg/ml)

+ Với OD = 0.120 ➔ x = 119.2 (µg/ml)

+ Với OD = 0.121 ➔ x = 120.2 (µg/ml)

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 117.2+119.2+120.2 = 118.87 (µg/ml)

3

0.119 mg/ml

7

❖ Protein có trong dịch thôi giải 2 (TG2)

Cách tính nồng độ protein có trong TG2 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.113 ➔ x = 112.2 µg/ml

+ Với OD = 0.115 ➔ x = 114.2 µg/ml)

+ Với OD = 0.111 ➔ x = 110.2 µg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 112.2+114.2+110.2 = 112.2 µg/ml

3

0.112 mg/ml

❖ Protein có trong dịch thôi giải 3 (TG3)

Cách tính nồng độ protein có trong TG3 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.139 ➔ x = 138.2 µg/ml

+ Với OD = 0.131 ➔ x = 130.2 µg/ml

+ Với OD = 0.129 ➔ x = 128.2 µg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 138.2+130.2+128.2 = 132.2 µg/ml

3

0.132 mg/ml

❖ Protein có trong dịch thôi giải 4 (TG4)

Cách tính nồng độ protein có trong TG4 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.127 ➔ x = 126.2 µg/ml

+ Với OD = 0.127 ➔ x = 126.2 µg/ml

+ Với OD = 0.123 ➔ x = 122.2 µg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 126.2+126.2+122.2 = 125.2 µg/ml

3

0.125 mg/ml

❖ Protein có trong dịch thôi giải 5 (TG5)

Cách tính nồng độ protein có trong TG5 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.099 ➔ x = 98.2 µg/ml

8

+ Với OD = 0.091 ➔ x = 90.2 µg/ml

+ Với OD = 0.091 ➔ x = 90.2 µg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 98.2+90.2+90.2 = 92.87 (µg/ml)

3

0.093 mg/ml

❖ Nồng độ protein trung bình có trong 5 phân đoạn thôi giải

[protein TB]thôi giải =

1+ 2+ 3+ 4+ 5

=

118.87+112.2+132.2+125.2+92.87

= 116.27µg/ml

0.116 mg/ml

Vậy trong 5 ml dịch thôi giải có [protein] = 0.016 x 5 = 0.58 mg

❖ Protein có trong dịch rửa (Flow-through)

Cách tính nồng độ protein có trong dịch rửa tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.098 ➔ x = 97.2 (µg/ml)

+ Với OD = 0.090 ➔ x = 89.2 (µg/ml)

+ Với OD = 0.089 ➔ x = 88.2 (µg/ml)

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 97.2+89.2+88.2 = 91.53 (µg/ml)

3

Vì mẫu được pha loãng 30 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml dịch rửa là: [protein] dịch rửa = ̅× 30 = 2746 (µg/ml) = 2.746 (mg/ml). Vậy trong 5 ml dịch rửa có [protein] = 2.746 x 5 = 13.73 mg

Hoạt tính enzyme

Dịch

Enzyme thô trước tủa

Enzyme tủa cồn

Enzyme tủa muối

OD thử không - thử thật

0.157 0.167 0.143 0.118 0.119 0.121 0.226 0.225 0.226

Pha loãng 15 lần đo hoạt tính Pha loãng 50 lần đo hoạt tính Pha loãng 50 lần đo hoạt tính

9

Công thức tính hoạt tính enzyme

×

×

Trong đó :

(Công thức 1)

X : Số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn

v : Thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme t : Thời gian enzyme phản ứng

K : Hệ số pha loãng

Giả sử thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng là 1 ml, thời gian phản ứng là 10 phút

Dựa vào phương trình đường chuẩn của tinh bột: y = 0.0231x + 0.0073 (phương trình 2) với

R2 = 0.9812, ta lần lượt tính hoạt tính enzyme có trong:

❖ Enzyme trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)

Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 2 Từ đó ta suy ra được giá trị x tương ứng với lượng tinh bột có trong mẫu thử Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên lượng tinh bột có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên + Với OD = 0.157 ➔

x = 6.481 mg + Với OD = 0.167 ➔

x = 6.913 mg + Với OD = 0.143 ➔

x = 5.874 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: ̅= 6.481+6.913+5.874 = 6.423 mg

3

Vì mẫu enzyme thô được pha loãng 15 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong dịch nuôi cấy = 6.423 ×15 = 9.635 U

10 ×1

❖ Enzyme tủa cồn

Cách tính hoạt tính enzyme trong mẫu sau khi tủa cồn tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.118 ➔ x = 4.792 mg

+ Với OD = 0.119 ➔ x = 4.835 mg

+ Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg

10

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: ̅=4.792+4.835+4.922 = 4.850 mg

3

Vì mẫu enzyme sau tủa cồn được pha loãng 50 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính enzyme sau tủa cồn =

4.850×50

= 24.25 U

10 ×1

❖ Enzyme tủa muối

Cách tính hoạt tính enzyme trong mẫu sau tủa muối tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.226 ➔ x = 9.468 mg

+ Với OD = 0.225 ➔ x = 9.424 mg

+ Với OD = 0.226 ➔ x = 9.468 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: ̅= 9.468+9.424+9.468 = 9.453 mg

3

Vì mẫu enzyme sau tủa muối được pha loãng 50 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase sau tủa muối = 9.453×5010×1 = 47.265 U

Hoạt tính enzyme sau khi được tinh sạch bằng sắc ký ái lực

Dịch

TG1

TG2

TG3

TG4

TG5

Dịch rửa (5 ml)

OD thử không - thử thật

0.161 0.161 0.169 0.173 0.175 0.171 0.121 0.121 0.129 0.157 0.167 0.143 0.069 0.071 0.061

Pha loãng 30 lần đo hoạt tính Pha loãng 20 lần đo hoạt tính Pha loãng 10 lần đo hoạt tính

Pha loãng 5 lần đo hoạt tính

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 1 (TG1)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG1 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.161 ➔ x = 6.654 mg

+ Với OD = 0.161 ➔ x = 6.654 mg

11

+ Với OD = 0.169 ➔ x = 7.0 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 6.654+6.654+7.0 = 6.769 mg

3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 30 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong TG1 =

6.769×30

= 20.307 U

10 ×1

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 2 (TG2)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG2 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.173 ➔ x = 7.173 mg

+ Với OD = 0.175 ➔ x = 7.260 mg

+ Với OD = 0.171 ➔ x = 7.090 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 7.173+7.260+7.090 = 7.174 mg

3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 20 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong TG2 = 7.171×20 = 14.384 U

10 ×1

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG3 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg

+ Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg

+ Với OD = 0.129 ➔ x = 5.268 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 4.922+4.922+5.268 = 5.037 mg

3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 10 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong TG3 = 5.037×10 = 5.037 U

10 ×1

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG4 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.157 ➔ x = 6.481 mg

+ Với OD = 0.167 ➔ x = 6.913 mg

12

+ Với OD = 0.143 ➔ x = 5.874 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 6.481+6.913+5.874 = 6.422 mg

3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 5 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong TG4 =6.10422×5×1 = 3.211 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 5 (TG5)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG5 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.069 ➔ x = 2.671 mg

+ Với OD = 0.071 ➔ x = 2.758 mg

+ Với OD = 0.009 ➔ x = 0.074 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 2.671+2.758+0.074 = 1.834 mg

3 Dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong TG5 = 1.

10834×1×1 = 0.183 U

Hoạt tính chung trong phân đoạn thôi giải = ổ ℎ ạ í ℎ ủ 5 ℎâ ạ ℎô ả 5 đ ạ ℎô ả 5

20.307 + 14.384 + 5.037 + 3.211 + 0.183

=

5

= 8.624 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch rửa (Flow-through)

Cách tính hoạt tính enzyme trong dịch rửa tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.008 ➔ x = 0.030 mg

+ Với OD = 0.01 ➔ x = 0.117 mg

+ Với OD = 0.009 ➔ x = 0.074 mg

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: ̅= 0.030+0.117+0.074

= 0.074 mg

3 Dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong dịch rửa = 0.

10074×1×1 = 0.007 U

13

Fraction Thể tích Nồng độ protein Hàm lượng protein Hoạt tính

Enzyme sau tủa

cồn

Enzyme sau tủa

muối

Enzyme trong

dịch rửa

❖ Tính hoạt tính riêng

Hoạt tính riêng =

Tổng hoạt tính enzyme

Tổng hàm lượng protein

+ Hoạt tính riêng của dịch enzyme thô = 2379.635.74 = 0.04 U/mg

+ Hoạt tính riêng của enzyme sau tủa cồn = 112.24.2587 = 0.215 U/mg

+ Hoạt tính riêng của enzyme sau tủa muối = 47.

107.2652 = 0.44 U/mg + Hoạt tính riêng của enzyme thôi giải = 8 624

58 = 14.87 U/mg + Hoạt tính riêng của enzyme dịch rửa = 0

13.007.73 = 0.0005 U/mg

Độ tinh sạch = Hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch Hoạt tính riêng ban ầu đ ạ ℎô ả 5

+ Độ tinh sạch của enzyme thô = 1

+ Độ tinh sạch của enzyme sau tủa cồn = 0.215

0.04 = 5.375 + Độ tinh sạch của enzyme sau tủa muối = 0 44 = 11

+ Độ tinh sạch của enzyme thôi giải = 14.87

0.04 = 371.75 + Độ tinh sạch của enzyme dịch rửa = 0.0005

0.04 = 0.0125

14