BÁO cáo THỰC tập hóa SINH học TINH SẠCH và xác ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE tái tổ hợp

- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu trước tủa.. Xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa.. Tinh sạch protein - Trộn 1 ml dị

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự

NHIÊN

HỨA TRƯỜNG CHINH - MSHV: 20C61005

TỪ KHỞI THÀNH - MSHV: 20C61012

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

AMYLASE TÁI TỔ HỢP

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH HỌC

Ngành: Hóa sinh học

Mã số ngành: 8420116 GVHD: TS Trần Quốc Tuấn

TP Hồ Chí Minh - Năm 2021

Mục lục

1 Tiến hành thínghiệm 3

2 Tinh sạchAmylasetái tổ hợp bằng sắc kí ái lực Ni2+-NTA agarose 3

3 Kết quả 4

4 Kết luận 15

1 Tiến hành thí nghiệm

- Ly tâm 100 ml dịch khuẩn ở tốc độ 7000 vòng/phút, ở 100C trong 10 phút để thu dịch enzyme ngoại bào bỏ sinh khối tế bào

- Dịch sau ly tâm lấy 50ml tủa muối và 50ml tủa dung môi hữu cơ

- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu (trước tủa)

- 2 mẫu tủa sẽ ly tâm, thu tủa và hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa) Xác định hoạt tính

enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa

- Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sạch bằng sắc ký ái lực

2 Tinh sạch Amylase tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực Ni 2+ -NTA agarose

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị cột

- Nhồi 1 lớp bông thủy tinh có độ dày khoảng 2 mm vào ống tiêm 3 ml (Lưu ý: bề mặt lớp bông bằng phẳng)

- Đặt một lớp giấy lọc lên cột

- Cố định cột lên giá đỡ và nối dây truyền dịch với cột

- Rửa cột với 1 ml đệm chiết tách, lặp lại 3 lần

Cân bằng Ni 2+ -NTA agarose

- Cho 500 pl dịch Ni2+-NTA agarose vào tube 1,5 ml; ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi

- Huyền phù tủa trong 1 ml đệm chiết tách, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa, bước này được thực hiện 3 lần

Tinh sạch protein

- Trộn 1 ml dịch enzyme sau tủa với Ni2+-NTA agarose cân bằng đã chuẩn bị ở bước trên, lắc ở 40C trong 1 giờ

- Sau 1 giờ, cho toàn bộ hỗn hợp protein và Ni2+-NTA agarose lên cột và thu dịch qua cột (FT - flow-through), để ổn định cột trong 10 phút

- Rửa phức hợp protein gắn với Ni2+-NTA agarose với 5 ml đệm rửa Thu nhận dịch rửa

giải Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong dịch rửa

- Thôi giải protein mục tiêu với 1 ml đệm thôi giải, lăp lại 5 lần Thu nhận các phân

đoạn

protein thôi giải và bảo quản ở nhiệt độ lạnh Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong các phân đoạn

3 Kết quả

Đường chuẩn Bradford

OD2

Từ kết quả thu nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 pg/ml protein vẫn ghi nhận được giá trị OD, điều này không đúng với lý thuyết Nên giá trị OD ở nồng độ 0 pg/ml protein sẽ được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng được hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2 được trừ cho 0.075 ở các nồng độ khảo sát; giá trị OD3 được trừ cho 0.076 ở các nồng độ khảo sát) Từ đó tính toán AOD giữa 3 lần lập lại, ta được kết quả như bảng sau:

Xây dựng đường chuẩn protein

0 2 4 6 8 10

Tương tự như trên, từ các giá trị OD ghi nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 pg/ml tinh bột vẫn ghi nhận được giá trị OD, điều này không đúng với lý thuyết Nên giá trị OD ở nồng độ 0 pg/ml tinh bột sẽ được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng được hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2, OD3 được trừ cho các giá trị tương ứng là 0.053, 0.054 và 0.055 ở các nồng độ khảo sát) Từ đó tính toán AOD giữa 3 lần lập lại, ta được kết quả như bảng sau:

1

Xây dựng đường chuẩn tinh bột

Nồng độ (mg/ml)

OD1

OD2

OD3

Đường chuẩn tinh bột

Dịch OD 595nm

Enzyme thô trước tủa 0.118 0.12 0.121

Dựa vào phương trình đường chuẩn của protein: y = 0.001x + 0.0008 (phương trình 1) với

R2 = 0.9983, ta lần lượt tính nồng độ protein có trong:

❖ Protein trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)

Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 1 Từ đó ta suy ra được giá trị x tương ứng với nồng độ protein có trong mẫu thử Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên nồng độ protein có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên + Với OD = 0.118^ x=117.2 gg/ml

+ Với OD = 0.120■*x=119.2 gg/ml

+ Với OD = 0.121■*x=120.2 gg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: X =

Vì mẫu được pha loãng 20 lần trước khi đo

OD, nên [protein] = X X 20 = 2377.4 pg/ml = 2.3734 mg/ml Vậy trong 100 ml dịch nuôi cấy có: [protein]dịch enzyme thô = 2.3774 X 100 = 237.34 mg

❖ Protein sau tủa cồn

Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa cồn tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.118^ x=117.2 gg/ml

+ Với OD = 0.112^ x=111.2 gg/ml

+ Với OD = 0.111^ x=110.2 gg/ml

117.2+111.2+110.2

= 112.87 pg/ml

Nồng độ protein

Pha loãng 20 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein

Pha loãng 100 lần đo protein

117.2 + 119.2 + 120.2 , ,

-= 118.87 pg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X =

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml

mẫu sau khi tủa cồn là: [protein]sau tủa cồn = X X 100 = 11287 pg = 11.287 mg.

Suy ra trong 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein]sau tủa cồn = 11.287 X 10 = 112.87 mg

❖ Protein sau tủa muối

Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa muối tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD =0.108 +x = 107.2 pg/ml

+ Với OD =0.110 +x = 109.2 pg/ml

+ Với OD =0.106 +x = 105.2 pg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X =

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo

OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1

Suy ra trong 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein]sau tủa muối = 10.72 X 10 = 107.2 mg

❖ Protein có trong dịch thôi giải 1 (TG1)

Cách tính nồng độ protein có trong TG1 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD=0.118 + x=117.2 (pg/ml)

+ Với OD=0.120■* x=119.2 (pg/ml)

+ Với OD=0.121■* x=120.2 (pg/ml)

117.2+119.2+120.2

= 118.87 (gg/ml)

» 0.119 mg/ml.

107.2 + 109.2 + 105.2

-— = 107.2 gg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X =

+ Với OD = 0.099 ^ x = 98.2 pg/ml

9

❖ Protein có trong dịch thôi giải 2 (TG2)

Cách tính nồng độ protein có trong TG2 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.113 ■* x= 112.2pg/ml

+ Với OD = 0.115 ■* x= 114.2pg/ml)

+ Với OD = 0.111 ■* x= 110.2pg/ml

, 112.2 + 114.2 + 110.2

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X — - -= 112.2 pg/ml

« 0.112 mg/ml

❖ Protein có trong dịch thôi giải 3 (TG3)

Cách tính nồng độ protein có trong TG3 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.139+x = 138.2 pg/ml

+ Với OD = 0.131■*x = 130.2 pg/ml

+ Với OD = 0.129■*x = 128.2 pg/ml

, ,.^ 138.2+130.2+128.2 „ _ , ,

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X — - -— 132.2 pg/ml

» 0.132 mg/ml

❖ Protein có trong dịch thôi giải 4 (TG4)

Cách tính nồng độ protein có trong TG4 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.127^ x = 126.2 pg/ml

+ Với OD = 0.127^ x = 126.2 pg/ml

+ Với OD = 0.123^ x = 122.2 pg/ml

, ,.^ 126.2+126.2+122.2 , ,

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X — - -— 125.2 pg/ml

» 0.125 mg/ml.

❖ Protein có trong dịch thôi giải 5 (TG5)

Cách tính nồng độ protein có trong TG5 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD =0.121 ^x = 4.922 mg

1 0

+ Với OD = 0.091 + x = 90.2 gg/ml

+ Với OD = 0.091 + x = 90.2 pg/ml

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X =

« 0.093 mg/ml

❖ Nồng độ protein trung bình có trong 5 phân đoạn thôi giải

TG1+TG2+TG3+TG4+TG5 118.87+112.2 + 132.2+125.2 + 92.87

[protein TB]thôi giải = -= -= 116.27 gg/ml

a 0.116 mg/ml

Vậy trong 5 ml dịch thôi giải có [protein] = 0.016 x 5 = 0.58 mg

❖ Protein có trong dịch rửa (Flow-through)

Cách tính nồng độ protein có trong dịch rửa tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.098 ^ x= 97.2 (pg/ml)

+ Với OD = 0.090 ^ x= 89.2 (pg/ml)

+ Với OD = 0.089 ^ x= 88.2 (pg/ml)

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: X =

Vì mẫu được pha loãng 30 lần trước khi đo

OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml

Vậy trong 5 ml dịch rửa có [protein] = 2.746 x 5 = 13.73 mg

Hoạt tính enzyme

Dịch OD thử không - thử thật

Enzyme thô trước tủa 0.1

0.1 43

Pha loãng 15 lần đo hoạt tính

0.1 21

Pha loãng 50 lần đo hoạt tính

Enzyme tủa muối 0.2

26

26

Pha loãng 50 lần đo hoạt tính

98.2+90.2+90.2

-= 92.87 (gg/ml)

97.2+89.2 + 88.2

-= 91.53 (gg/ml)

1 1

Công thức tính hoạt tính enzyme

X X K

t X V Trong đó :

X : Số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn

v : Thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme

t : Thời gian enzyme phản ứng

K : Hệ số pha loãng

Giả sử thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng là 1 ml, thời gian phản ứng là 10 phút

Dựa vào phương trình đường chuẩn của tinh bột: y = 0.0231x + 0.0073 (phương trình 2)

với

R2 = 0.9812, ta lần lượt tính hoạt tính enzyme có trong:

❖ Enzyme trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)

Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 2 Từ đó ta suy ra được giá trị x tương ứng với lượng tinh bột có trong mẫu thử Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên lượng tinh bột có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên + Với OD =0.157 ^ x = 6.481mg

+ Với OD =0.167 ^ x = 6.913mg

(Công th c 1)ức 1)