Thí nghiệm công nghệ sinh học dược báo cáo CUỐI kì sản xuất enzyme amylase bằng e coli tái tổ hợp

tiêu nghiên cứu: nắm rõ các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật, các bước tiếnhành tạo dòng biểu hiện protein, quy trình tinh chế amylase, biết cách tính toán các thông số

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Khoa Dược

Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Dược

BÁO CÁO CUỐI KÌ

GVHD: TS Lê Bảo

TS Lê Thùy Hương

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thúy Thanh – H1900167

Nguyễn Quốc Tựu – H1800350

Lê Kim Nhi – H1900126

Cù Thị Hoàng Yến – H1900222Bùi Nguyễn Thanh Ngân - H1900289Nguyễn Ngọc Kim Ngân - H1900290

Lê Ngọc Phương Linh - H1900282Phạm Thị Ngọc Mỹ - H1900233

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12, năm 2021

Mục lục

Tóm tắt 3

Giới thiệu 4

1 Chọn lọc giống vi sinh vật 4

1.1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme 4

1.1.1 Vật liệu 4

1.1.2 Thực hiện 5

1.1.3 Kết quả thí nghiệm 5

Nhận xét 11

1.2 Kháng sinh 11

1.2.1 Vật liệu 11

1.2.2 Thực hiện 12

1.2.3 Kết quả thí nghiệm 12

2 Tinh chế enzym Amylase bằng Alginat 13

2.1 Nguyên vật liệu 13

2.2 Tiến hành 13

2.2.1 Thu enzym thô 13

2.2.2 Tinh chế enzym thô 14

2.2.3 Xác định hàm lượng protein bằng OD280 14

3 Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli 15

3.1 Tách Plasmid dùng Spin Column 15

3.1.1 Vật liệu 15

3.1.2 Thực hiện 15

3.2 Biến nạp plasmid vào E coli 16

3.2.1 Vật liệu 16

3.2.2 Thực hiện 16

3.2.3 Nhận xét 21

3.3 Lưu dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp 21

3.3.1 Vật liệu 21

3.3.2 Thực hiện 21

3.3.3 Nhận xét 22

3.4 Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu 22

3.4.1 Vật liệu 22

3.4.2 Thực hiện 23

3.4.3 Nhận xét 25

4 Tinh chế protein tái tổ hợp 25

4.1 Khái quát về nguyên tắc của sắc ký ái lực 25

4.2 Sắc ký ái lực ion kim loại – IMAC 25

4.2.1 Vật liệu chuẩn bị 25

4.2.2 Chuẩn bị cột 26

4.2.3 Phá tế bào 26

4.2.4 Tinh chế protein His-tag 27

4.2.5 Xác định hàm lượng protein 27

5 Kết luận 29

Tóm tắt

Vấn đề nghiên cứu: “Sản xuất enzyme amylase bằng E coli tái tổ hợp”, thực hiện tại

phòng thí nghiệm vi sinh Đại học Tôn Đức Thắng TP.HCM 18/12/2021- 19/12/2021 Với mục

tiêu nghiên cứu: nắm rõ các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật, các bước tiếnhành tạo dòng biểu hiện protein, quy trình tinh chế amylase, biết cách tính toán các thông sốtrong quá trình tinh chế protein, hiểu nguyên tắc sắc ký ái lực và quá trình thực hành tinh chếprotein bằng sắc ký ái lực với Ni-sepharose, GST-sepharose.

Giới thiệu

Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có đặctính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng và nuôi cấy bảo quảnchúng trong môi trường thích hợp Việc chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm các bước: phân lập

từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, bảo quản giống Đểphát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, ta có thể dựa vào chất chuyển hoá tạo ra nhưtạo kháng sinh hay tiết sắc tố enzyme ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường: amylase– tinh bột, protease – gelatin Chỉ có những chất nào trong đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, có tính chất kháng sinh thì sau khi nuôi sẽ tạo ra vùng ức chế đặc hiệu trên đĩa thạch

Tinh chế enzyme amylase bằng alginate được thực hiện bằng gel alginate Phương pháptinh chế là phương pháp cố định enzyme, theo cơ chế hấp phụ, amylase xem alginat cơ chất nênbám lên bề mặt các hạt gel, do đó có thể lọc lấy amylase dễ dàng Xác định hàm lượng protein(cơ chất của enzyme) bằng cách đo độ hấp thu OD280 Xác định hoạt tính amylase được thực hiệnbằng phương pháp Heinkel Hoạt độ của amylase được tính bằng lượng tinh bột bị phân giải dựatrên mức giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với thuốc thử Iod Sau đó tinh chế proteinbằng sắc ký ái lực theo nguyên tắc dựa vào sự gắn thuận nghịch của một nhóm chức năng trênprotein với một nhóm chức năng trên pha tĩnh sắc ký Chỉ protein đích mang nhóm chức năngđặc hiệu mới gắn vào pha tĩnh

Thạch Gelatin

Đệm PBS

1.1.2 Thực hiện

Cho vào 1g mẫu đất 10 μL đệm PBSL đệm PBS

Vortex để phân tán vi sinh vật vào đệm Để khoảng 15 phút cho đất lắng xuống

đáy Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10, đánh số ống từ 1 đến 6

Hút 100 μL đệm PBSL huyền phù vi sinh vật đã pha loãng, trải lên môi trường phát hiện ống 4, 5 và

6 Ủ ở nhiệt độ 37oC/ 24 giờ nhằm phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzymeamylase, protease trên 3 đĩa thạch tinh bột và 3 đĩa thạch gelatin

Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết amylase ngoại bào.

Môi trường phân lập: tinh bột

Thuốc thử: dung dịch Lugol

Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết protease ngoại bào.

Môi trường phân lập: thạch gelatin

Thuốc thử: TCA 50%

1.1.3 Kết quả thí nghiệm

1.1.3.1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Protease ngoại bào

(a) (b)

(c)

Hình 1.1 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA

50% ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA 50% ở ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào trước khi nhỏ TCA

50% ở ống 6

(a) (b)

(c)

Hình 1.2 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào sau khi nhỏ TCA 50%

ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào sau khi nhỏ TCA 50% ở ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh protease ngoại bào sau khi nhỏ TCA 50% ở

ống 6

Bảng 1 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease ngoại bào

TT Mô tả Khả năng sinh protease ngoại bào

2 Không thấy vi sinh vật tiết protease ngoại bào Không

3 Không thấy vi sinh vật tiết protease ngoại bào Không

Nhận xét

Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở 37oC trong

24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào ở ống 4 (xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vòngsáng, trong do gelatin đã bị thuỷ phân nên không bị tủa) Sau khi nhỏ TCA 50% thì chỉ có 1 môitrường tạo vòng sáng quanh chỗ vi sinh vật mọc

1.1.3.2 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Amylase ngoại bào

(a) (b)

(c)

Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào trước khi nhỏ dung

dịch Lugol ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào trước khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào

trước khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 6

(a) (b)

(c)

Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau khi nhỏ dung dịch

Lugol ở ống 4; (b) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 5; (c) Đĩa phân lập và phát hiện khả năng sinh amylase ngoại bào sau

khi nhỏ dung dịch Lugol ở ống 6

Bảng 2 Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase ngoại bào

ngoại bào

1 Khóm màu vàng nhạt, tròn, bìa không răng cưa, đường kính Có

khoảng 3mm

Nhận xét

Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường tinh bột và ủ ở 37oC trong 24giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào trong ống 4 (xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vòngsáng nhỏ, trong do tinh bột đã bị thuỷ phân nên không tạo màu với iod)

Tại môi trường phát hiện ống 5 hầu như không có vòng sáng, môi trường phát hiện ống 6 cũng không có vòng sáng

1.2 Kháng sinh

Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó đối với các sinh vật khác

1.2.1 Vật liệu

Chủng kiểm tra: chủng Bacillus có khả năng sinh kháng sinh

Chủng thử nghiệm: E coli vs Shigella

Dung dịch PBS dùng làm mẫu chứng

2 đĩa thạch TSA

1.2.2 Thực hiện

Đốt đèn cồn sát khuẩn tay và khu vực xung quanh

Tất cả các thao tác đều phải thực hiện gần đèn cồn để đảm bảo vô khuẩn

Mở nắp ống nghiệm chứa vi khuẩn, dùng que bông vô trùng nhúng vào ống nghiệm chứa vi khuẩn, ép que trên thành ống để ráo nước, rút que bông ra khỏi ống nghiệm,Trải đều vi khuẩn trên mặt thạch, lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay đĩa 60 độ

Thực hiện trên 2 đĩa,1 đĩa chứa vi khuẩn E coli,1 đĩa chứa vi khuẩn Shigella

Để yên trong khoảng 3-5p

Dùng dụng cụ đục lỗ đục ít nhất 3 lỗ trên đĩa thạch

Cho khoảng 0,1 µl dịch nuôi cấy chứa vi khuẩn Bacillus vào 2 lỗ trống

Lỗ trống còn lại cho 0,1µl dung dịch PPS làm mẫu đối chứng

Nuôi cấy ở 37°C trong 24h, thu kết quả

1.2.3 Kết quả thí nghiệm

Hình 1: Thao tác đục lỗ trên đĩa thạch Hình 2: Kết quả thu được trên đĩa thạch E coli

Hình 3: Kết quả thu được trên đĩa thạch Shigella

2 Tinh chế enzym Amylase bằng Alginat

2.1 Nguyên vật liệu

Khoai lang

2.2 Tiến hành

2.2.1 Thu enzym thô

Bỏ vỏ khoai lang, cắt nhỏ thành từng miếng

Cân 30g khoai lang cho vào chày cối để ghiền nát với 30ml đệm phosphate

Lấy 20ml có được từ việc nghiền chung với PBS và tiến hành ly tâm để thu dịch

lỏng Lọc qua giấy lọc thu dịch lỏng chứa enzyme amylase thô

2.2.2 Tinh chế enzym thô

Lấy 10ml dịch enzyme thô từ bước trước, cho dung dịch 30mL sodium alginate 2%, dùngđũa thủy tinh khuấy đều, ủ trong 1 giờ

Cho 20ml dung dịch CaCl2 0.7M vào dung dịch alginat + enzyme, khuấy đều Đem đi ly tâm và thu tủa

Cho 20ml dung dịch glucose 2% 4°C và ủ 12 giờ Sau 12 giờ, lấy dịch ủ đi ly tâm thu dịch lỏng chứa enzyme amylase tinh

2.2.3 Xác định hàm lượng protein bằng OD280

Lấy 2 eppendorf chứa 1.5ml enzym amylase thô và 1.5ml enzym amylase tinh, ly tâm

2.2.4 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Heinkel

Nguyên tắc: xác định hoạt độ nhờ mức độ giảm màu của hỗn hợp phản ứng với dung

dịch iode

Tiến hành:

- Đối với enzyme thô, pha loãng 100 lần với đệm phosphate

- Đối với enzyme tinh chế, pha loãng 10 lần với đệm phosphate

Xác định hoạt tính enyme thô và enzyme tinh chế, mỗi mẫu thực hiện 2 eppendorf (ống thử

Tính hiệu số đọc được trên máy giữ mẫu chứng và mẫu thử thô:

∆OD = ODC – ODT = 3.122 – 1.500 = 1.622A

Tính hiệu số đọc được trên máy giữ mẫu chứng và mẫu thử tinh:

∆OD = ODC – ODT = 1.780 – 0.923 = 0.857A

15

Từ ∆OD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột thủy phân tương ứng từ đó tính hoạt

độ enzyme (HTE)

HTE thô = (3.122- 1.500) / (0.8388 x 15 x 0.1) = 1.289 (U/ml)

HTE tinh = (1.780 – 0.923) / (0.8388 x 15 x 0.1) = 0.681 (U/ml)

Hoạt tính chung của enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE tinh x N x Venzyme tinh (N là hệ số

Hoạt tính riêng của enzyme thô: HTR = HTC / lượng protein (U/A280nm)

= 1289

Hoạt tính riêng của enzyme tinh: HTR = HTC / lượng protein (U/A280nm)

= 136.2

Hiệu suất cố định: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô

Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô

HT (U/ml) = (Acontrol-Asample) / (A/mgStarch x 15 phút x 0.1 ml)

3 Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli.

3.1 Tách Plasmid dùng Spin Column

3.1.1 Vật liệu

Chủng tạo dòng E coli đã được chèn vector có mang gen mục tiêu

Kit tách plasmid (solution I, solution II, solution III, RNase, Washing buffer)

Máy ly tâm

3.1.2 Thực hiện

Cho 1.5 mL dịch nuôi cấy vào eppendorf -> ly tâm thu tế bào

Thêm 100 μL đệm PBSL solution I, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

Thêm 200 μL đệm PBSL solution II, trộn bằng cách đảo eppendorf lên xuống 4-6 lần, ủ ở nhiệt

độ phòng 1 phút

Thêm 300 μL đệm PBSL solution III, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

Ly tâm 12,000 rpm/min, trong 5 phút Thu dịch nổi

Cho dịch nổi vào spin column Ly tâm 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua

Cho 500 μL đệm PBSL washing buffer, ly tâm 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua Lặp lại bước trên

1 lần nữa

Ly tâm 1 phút để làm khô màng

Đặt cột vào eppendorf mới Cho TE buffer vào giữa cột, ủ 2 phút Ly tâm trong 2 phút để thu plasmid

Bảo quản Plasmid ở - 20°C

Hình 1: Spin Column trước khi ly tâm Hình 2: Spin Column sau khi ly tâm

3.2 Biến nạp plasmid vào E coli

3.2.1 Vật liệu

Plasmid biểu hiện có gen mục tiêu

Tế bào khả nạp E coli BL21 (DE3).

Hộp thạch LB có sẵn kháng sinh chọn lọc tương ứng

3.2.2 Thực hiện

Mọi hoạt động đều phải tiến hành trong đá lạnh và DNA được sử dụng cho quá trình biến nạp phải làm lạnh trước

Tiến hành biến nạp cho mẫu nước cất là phản ứng chứng âm, và plasmid chứa amyE mục

tiêu vào E coli BL21 (DE3).

Để tube chứa plasmid trong đá Lấy 50 µl tế bào khả nạp cần thiết.

Hình 1 Tiến hành thao tác trong đá lạnh.

Lấy đủ số tube tế bào khả nạp cần thiết, làm đông trong đá khoảng 5 phút, không làm đông trên tay vì sẽ giết chết tế bào

Chuyển toàn bộ plasmid vào tube chứa tế bào khả nạp tương ứng Dùng ngón tay khẩy nhẹ vào đáy ống để trộn, không hút lên xuống vì sẽ giết chết tế bào và làm giảm hiệu quả biến nạp Chuẩn bị hộp thạch LB chọn lọc: môi trường LB Agar Ampicillin 30 μL đệm PBSL / mL

Hình 2 Chuẩn bị môi trường LB Agar Ampicillin 30 μL đệm PBSL / mL.

Gây sốc nhiệt bằng cách đặt các tube trên bể cách thuỷ ở nhiệt độ chính xác 42°C trong

30 giây và sau đó làm lạnh trong đá 10 phút

Cho thêm 1 mL LB vào mỗi tube, ủ tế bảo ở 37°C trong 1 giờ để làm ổn định tế bào và gen đề kháng kháng sinh trên plasmid có thời gian biểu hiện

Hình 3 Ủ tế bào ở 37°C trong 1 giờ.

Ly tâm 13,000 vòng/ phút trong 15 giây, thu tế bào

Đổ bỏ phần môi trường bên trên, chỉ chừa lại khoảng 100μL đệm PBSL ở đáy tube

Nhẹ nhàng phân tán tế bào vào phần môi trường còn lại, chuyển toàn bộ sang hộp thạch chứa môi trường có kháng sinh Ampicillin

Hình 4 Thạch chứa môi trường có kháng sinh Ampicillin.

Dùng que gạt vô trùng để trải vi khuẩn trên mặt thạch Que gạt được tiệt trùng bằng cáchnhúng trong cồn tuyệt đối và chỉ đốt que trước khi sử dụng

Hình 5 Quá trình trải vi khuẩn a) Tiệt trùng que trải; b) Trải vi khuẩn lên mặt thạch.

Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 37ºC, phải lật ngược hộp thạch để tránh sự ngưng đọng hơi nước trên mặt thạch

Hình 6 Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 37ºC.

Dùng que cấy vô trùng hay đều tip vô trùng, chấm vào đỉnh khuẩn lạc.

Cấy que vào ống môi trường chứa 3 mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampi (nghiêng ống để môi trường tràn lên gần miệng ống, nhúng que vào để phân tán vi khuẩn trên vào môi trường)

Hình 2 Thao tác chia môi trường nuôi cấy.

Hình 3 Bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy E coli đã thêm IPTG 100mM.

Tiếp tục lắc thêm 30 phút

Hình 4 Bình thêm IPTG 100mM được cho vào máy lắc 30 phút.

Tiến hành thu tế bào bằng cách ly tâm 5,000 rpm trong 10 phút ở 4oC

Cho tế bào vào tủ bảo quản ở -80oC hay -20oC nếu không dùng ngay

3.4.3 Nhận xét

Việc lắc thêm vài giờ để giúp cho cảm ứng đủ Tế bào sau khi ly tâm thu được là tế bào đã được cảm ứng biểu hiện bởi IPTG, cho bảo quản khi nào cần thì lấy ra kích hoạt

4 Tinh chế protein tái tổ hợp

4.1 Khái quát về nguyên tắc của sắc ký ái lực

Nhựa sắc ký (resin) được gắn các ion kim loại hóa trị II là Ni, ion này có ái lực với đoạn peptid được gắn kết với 6-8 đoạn histidine Từ đó dựa vào sự gắn kết thuận nghịch của phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế protein Protein đích sẽ được thôi bằng đệm có chứa thành phần chính là imidazole, một chất có ái lực mạnh với cột Ni hơn Histidine

4.2 Sắc ký ái lực ion kim loại – IMAC

4.2.1 Vật liệu chuẩn bị

Đệm chạy 8X (binding buffer)

Đệm thôi 4X (Elution buffer)

Đệm ion 8X (charge buffer)

Đệm rửa 8X (washing

buffer) Đệm bảo quản cột

Chuẩn bị dung dịch đệm phù hợp bằng cách pha loãng nồng độ Bảng pha loãng như dướiđây:

Đệm Stock Tỉ lệ pha Tổng Thể tích cần sử dụng Cách pha

Rửa cột lần lượt với các đệm đã được pha ở trên (1 thể tích là 0.5 ml)

Sử dụng môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli không thêm chất cảm ứng IPTG IPTG

là chất cảm ứng promoter cảm ứng cho quá trình phiên mã

Lấy 15 mL môi trường nuôi cấy E coli đi ly tâm, bỏ phần dung dịch bên trên thu phần cặn bên dưới Phần dưới là các tế bào E coli Lấy 2 mL đệm chạy 1X cho vào tế bào E coli Phân tán tế bào và đặt trên cốc mỏ vịt có chứa đá để giúp protein không bị biến tính bởi nhiệt độ

Đem hỗn hợp E coli và đệm đi siêu âm (lưu ý vẫn đặt trên đá vì lúc siêu âm nhiệt độ tăngcao dễ gây biến tính) Lặp lại quá trình siêu âm đến khi hỗn hợp không bị nhớt Lúc này

tế bào đã bị phá vỡ để sẵn sàng cho bước tiếp theo