Ứng dụng enzyme trong phân tích hóa học_1.pptx

CÔNG NGHỆ ENZYME ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC 1 GVHD TS Đỗ Việt Hà TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME Nhóm 11 Bùi Xuân Mỹ Duyên 18139033 Nguyễn Minh Luân 18139089 Nguyễn Thị Duyên 18139036 Nguyễn Thị Mỹ Xuyên 18139230 Nguyễn Thị Kim Ngân 18139105 THÀNH VIÊN NHÓM NỘI DUNG BÁO CÁO GIỚI THIỆU VỀ ENZYME 01 MỘT SỐ ENZYME ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CẢM BIẾN SINH HỌC DỰA TRÊN ENZYME ĐIỆN CỰC CÓ ENZYME CỐ ĐỊNH 03 HƯỚNG PHÁT TRIỂN 02 0.

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME TRONG PHÂN

● Bùi Xuân Mỹ Duyên 18139033

● Nguyễn Minh Luân 18139089

NỘI DUNG BÁO CÁO

GIỚI THIỆU VỀ

ENZYME

ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT

CẢM BIẾN SINH

HỌC DỰA TRÊN

ENZYME

ĐIỆN CỰC CÓ ENZYME CỐ ĐỊNH

GIỚI THIỆU VỀ

ENZYME

01

GIỚI THIỆU VỀ ENZYME

- Enzyme có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein Đa số enzyme có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn

- Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực

- Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzyme bị biến tính Môt trường acid hay base cũng làm enzyme mất khả năng hoạt động

- Enzyme có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện

Enzyme trong phân tích hóa học

Rất hữu ích và thuận

tiện vì độ đặc hiệu cao

và độ nhạy của chúng

Có thể sử dụng enzyme để định lượng

cơ chất, các chất hoạt hóa, chất kiềm hãm

Cho phép định lượng trên vật liệu thô và các chất không bền trong điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, được kiểm soát

CẢM BIẾN SINH HỌC DỰA TRÊN

ENZYME

02

2 Cảm biến sinh học dựa trên enzyme

 Cảm biến sinh học dựa trên vi chất lỏng liên tục

Enzyme: Cholesterol oxidase (ChOx), Cholesterol esterase (ChEt)

Ứng dụng: Kết hợp với thiết bị phân tích quang phổ, quang điện tử tia X và kỹ thuật hiển vi điện

tử quét để đo glucose oxidase

Sơ đồ cảm biến sinh học dựa trên vi chất lỏng nanocompozit có chức năng lưỡng enzyme được phát triển để phát hiện cholesterol (Ali et al., 2013)

2 Cảm biến sinh học dựa trên enzyme

 Cảm biến sinh học dựa trên vi lỏng giọt

Enzyme được ứng dụng: Glucose oxidase

Ứng dung: Kết hợp với phổ điện hóa (EIS) và phổ đo vôn theo chu kỳ (CV) đo glucose

Sơ đồ: (A) một cảm biến sinh học điện hóa dựa trên giọt để theo dõi lượng đường bằng cách sử dụng glucose oxidase; (B) cảm biến điện hóa dựa trên giọt; và (C) theo dõi

glucose trong giọt (C) (Gu et al., 2014)

HỆ THỐNG PHÁT QUANG SINH HỌC

TỪ LUCIFERASE

03

3 Hệ thống phát quang sinh học từ Luciferase

3 Hệ thống phát quang sinh học từ Luciferase

Thực nghiệm: Luciferase được cấy vào tế bào beta từ nguồn gốc acinar (Baeyens et al., 2009)

MỘT SỐ ENZYME

ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG

CÁC CHẤT

04

Malate dehydrogenase (MDH)

Nguồn gốc

Xuất hiện trong hầu hết các sinh vật bao gồm các mô động vật, thực vật và trong vi sinh vật

01

Là một thành phần của chu trình axit citric, nó được tìm thấy với một lượng lớn trong ti thể và các phân tử.

02

Người ta dùng enzyme malate dehydrogenase và NAD+ để xác định malicacid (có nhiều trong nho, rau, quả)

Cấu trúc

các tiểu đơn vị giống hệt nhau thường được sắp xếp dưới dạng dimer hoặc tetramer

 Trọng lượng phân tử của mỗi tiểu đơn vị khoảng 30–40 kDa Mỗi tiểu đơn vị thực hiện phản ứng xúc tác của nó một cách độc lập

 Cấu trúc thứ cấp của một đơn vị con chứa một đường trục song song 9 tấm beta được bao bọc bởi 9 vòng xoắn alpha lớn.

● MDH xúc tác thuận nghịch quá trình oxy

hóa L-malate thành oxaloacetate

Isocitrate dehydrogenase (IDH)

 Toàn bộ protein bao gồm hai cấu trúc bánh sandwich cạnh nhau quay

về hướng ngược nhau Sau đó, làm cho hai vị trí hoạt động của protein đối mặt với nhau

con người có 4 tiểu đơn vị.

● Isocitrate dehydrogenase (IDH) là các

phân tử phụ thuộc NADP xúc tác quá trình

khử carboxyl oxy hóa isocitrate để tạo ra

α-Oxoglutarate và với việc sản xuất đồng

thời NADPH

● Bằng cách sử dụng cation kim loại hóa trị

hai (Mg2+ hoặc Mn2+) trong chu trình axit

Alcohol dehydrogenase (ADH)

- Là một homodimer

- Mỗi monomer đều có hai miền:

• Miền liên kết NAD+ (có trang beta trung tâm gồm 6 sợi

bao quanh bởi các vòng xoắn alpha)

• Miền xúc tác

- Dimer hình thành với hai miền liên kết đóng gói với

nhau sao cho 2 trang beta trung tâm của chúng kết hợp

với nhau để tạo thành một trang beta 12 sợi Các miền

xúc tác nằm ở hai đầu đối diện

Cấu trúc của enzyme ADH Cấu trúc

Nguồn gốc của alcohol dehydrogenase

Gan của động

vật có vú

Nấm men (Saccharomyces)

Định lượng Ethanol trong máu bằng enzyme Acohol dehydrogenase

(ADH)

Enzyme ADH xúc tác phản ứng oxy hóa Ethanol thành Acetaldehyde, chuyển đổi

NAD+ thành dạng khử NADH

Cơ chế:

Phản ứng xảy ra như sau:

 Ethanol + NAD+ Acetaldehyde + NADH + H+

ADH

Sulfite oxidase

- Nguồn gốc: Có trong ty thể của tất cả các sinh vật nhân thực

- Cấu trúc: Là một homodimer, sulfite oxidase chứa hai tiểu đơn vị giống hệt

nhau với miền đầu cuối N và miền đầu cuối C Hai miền này được nối với nhau bằng mười axit amin tạo thành một mạch vòng

Định lượng sulfite trong thực phẩm

Sufite được xác định bằng enzyme bắt đầu từ năm 1983 Người ta dùng enzyme sulfite oxidase để xác định sulfite

Urease

Đậu nành

Urease được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn, thực vật, nấm và tảo

Helicobacter pylori Kebsiella aerogenes

Nguồn gốc

Định lượng urea trong máu và nước tiểu

Người ta dùng enzyme urease để định lượng urea

Cơ chế:

Xúc tác quá trình thủy phân urea thành amoniac và carbon

dioxide, thủy phân liên kế C-N Phản ứng xảy ra như sau:

Amoniac tác dụng với α-oxoglutarate và NADH dưới tác dụng của enzyme

Glutamate dehydrogenase (GLDH) tạo NAD+ Sự giảm mật độ quang của

NADH theo thời gian tỉ lệ với nồng độ urea trong mẫu bệnh phẩm ở bước sóng

340 nm

α-oxoglutarate + NADH + NH4+ L-glutamate + NADGLDH + + H2O

Urea + H2O 2NHUrease 3 + CO2

ĐIỆN CỰC CÓ ENZYME CỐ

ĐỊNH

05

Các enzyme cố định luôn có những đóng góp quan trọng trong phân tích sinh hóa Một trong những ví

dụ điển hình là điện cực có mang enzyme cố định

Điện cực enzyme được dùng để xác định nồng độ nhiều chất khác nhau như: glucose, một số acid hữu cơ (acid acetic, acid pyruvic, acid lactic, acid fomic,…) amino acid, các lipid, penicillin, và alcohol,

… trong số các biosensor ứng dụng trong lâm sàng, glucose biosensor được ứng dụng rộng rãi nhất để

xác định glucose trong máu

Nguyên Tắc Cấu Tạo Và Hoạt Động

Nguyên Tắc Cấu Tạo Và Hoạt Động

Thành phần cấu tạo

sinh học của điện cực

này là enzyme, được

Điện cực urea có mang enzyme urease cố định trong lớp gel gắn kèm với điện cực

thủy tinh

Ví dụ: Điện cực

urea

Trong điện cực urea,

urease cố định phân hủy

-• Tạo nguồn enzyme có chất lượng cao và theo quy mô công nghiệp

• Phát triển ngày càng nhiều enzyme trong thế giới vi sinh vật

• Hoàn thiện các phương pháp thu nhận, tinh sạch enzyme theo quy mô công nghiệp và mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực kĩ thuật tinh vi

06

HƯỚNG PHÁT TRIỂN

Tên enzyme Nguồn gốc Cơ chế Vai trò

Mycobacterium, Brevibacterium, Streptomyces, Bacillus

Xúc tác quá trình oxy hóa cholesterol (cholest-5-en-3β-ol) thành cholestenone (cholest-4- en-3-one)

Cảm biến sinh học dựa trên

vi chất lỏng liên tục đo cholesterol oleate

Cholesterol esterase Cholesterol esterase là

một ester của cholesterol.

Thế một nhóm –OH (hydroxyl) bằng một nhóm –O – alkyl gây biến đổi cholesterol

Cảm biến sinh học dựa trên

vi chất lỏng liên tục đo cholesterol oleate

Glucose oxidase Nấm Aspergillus niger,

Nấm Penicillium glaucum

xúc tác quá trình oxy hóa β- d – glucose thành axit gluconic

Cảm biến sinh học dựa trên

vi lỏng giọt đo lượng glucose trong máu.

BẢNG TÓM TẮT ENZYME

Tên enzyme Nguồn gốc Cơ chế Vai trò

princeps, Renilla reniformis, Click beetle luciferase

Oxy hóa chất nền của chúng tạo

ra phát quang sinh học

Cấy vào tế bào, giúp xét nghiệm dựa trên phát quang sinh học trong cơ thể sống

Trong ti thể và các phân tử.

Oxy hóa L-malate thành oxaloacetate bằng cách sử dụng làm chất điện tử.

bị khử thành NADH

Định lượng malic acid có nhiều trong nho, trong rau, quả

Isocitrate

dehydrogenase

(IDH)

Vi khuẩn Escherichia coli

Oxy hóa isocitrate để tạo ra α-Oxoglutarate và với việc sản xuất đồng thời NADPH

Định lượng isocitric acid trong nước trái cây

princeps, Renilla reniformis, Click beetle luciferase

Oxy hóa chất nền của chúng tạo

ra phát quang sinh học

Cấy vào tế bào, giúp xét nghiệm dựa trên phát quang sinh học trong cơ thể sống

Trong ti thể và các phân tử.

Định lượng malic acid có nhiều trong nho, trong rau, quả

Isocitrate

dehydrogenase

(IDH)

Vi khuẩn Escherichia coli

Định lượng isocitric acid trong nước trái cây

Tên enzyme Nguồn gốc Cơ chế Vai trò

Alcohol

dehydrogenase

Gan của động vật có vú Nấm men

(Saccharomyces)

Xúc tác phản ứng oxy hóa Ethanol thành Acetaldehyde, chuyển đổi

Định lượng Ethanol trong máu

thực

Oxy hóa sulfite thành sulfate và giải phóng H2O2

Định lượng sulfite trong thực phẩm

Thực vật (Đậu nành)

Phân hủy urea thành NH4+ và HCO3- Enzyme cố định trong điện cực urea

để xác định hàm lượng urea Xúc tác quá trình thủy phân urea

thành amoniac và carbon dioxide  

Định lượng urea trong máu và nước tiểu

Glutamate

dehydrogenase

Chủ yếu trong gan, thận

và cơ tim, với hàm lượng thấp hơn trong não, cơ xương và bạch cầu.

trong máu và nước tiểu.

Aminoacyl-coenzyme A synthesis catalyzed by adenylation domains – Uwe Linne, Antje Schäfer, Milton

T.Stubb, Mohamed A.Marahiel

Adenylat cyclase at the US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)

Malate dehydrogenase_Wikipedia.

Malate dehydrogenase_ScienceDirect

Function, kinetic properties, crystallization, and regulation of microbial malate dehydrogenase, PMC Thư

viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ

Isocitrate Dehydrogenase_Wikipedia

Structure of the Monomeric Isocitrate Dehydrogenase: Evidence of a Protein Monomerization by a Domain Duplication_ScienceDirect

Structure, Kinetic, and Chemical Mechanism of Isocitrate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis,

PMC Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Peroxidase(s) in Environment Protection, Neelam Bansal and Shamsher S Kanwar

Công nghệ Enzyme, Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh năm 2012

H.J Edenberg, W.F Bosron, Alcohol Dehydrogenases, Comprehensive Toxicology, Volume 10, 2018, Pages

126-145

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9519-2:2016 (EN 1988-2:1998) về Thực phẩm - Xác định sulfite – Phần 2: Phương

pháp enzyme

Wikipedia Tây Ban Nha

PGS.TS Đỗ Quý Hai , Công nghệ enzyme và ứng dụng, Đại học Huế

Tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Hóa sinh”, Bộ Y Tế, Năm 2014

Molecular Dynamics Study of Helicobacter pylori Urease, Mona S Minkara, Melek N Ucisik, and

Kenneth M Merz, Jr

THANKS!