Ứng dụng enzyme trong phân tích hóa học 3

TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC BÀI BÁO CÁO MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME Chủ đề ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG HÓA HỌC 3 GVGD Ths Đỗ Việt Hà Nhóm 13 Thành viên nhóm Trần Lê Vi 18139222 Nguyễn Thị Quỳnh Như 18139141 Nguyễn Minh Anh 18139005 Trần Thị Kim Huyền 19139058 Nguyễn Minh Nhật 18139126 Mục Lục Chủ đề ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG HÓA HỌC 3 1 Chương 1 Tổng quan về enzyme 3 I Khái niệm enzyme 3 II Cấu trúc 3 III Cơ chế tác động 3 IV Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 4.

TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

BÀI BÁO CÁO MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME Chủ đề: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG HÓA

HỌC 3 GVGD: Ths.Đỗ Việt Hà

Nhóm 13

Thành viên nhóm:

Nguyễn Minh Nhật 18139126

Mục Lục

Chủ đề: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG HÓA HỌC 3 1

Chương 1 Tổng quan về enzyme 3

I Khái niệm enzyme 3

II Cấu trúc 3

III Cơ chế tác động 3

IV Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 4

V Vai trò của enzyme 4

Chương 2 Ứng dụng của enzyme trong hóa phân tích 4

I Xét nghiệm hàm lượng Glucose máu 4

1 Enzyme Glucose oxydase (GOD) 5

2 Enzyme Hexokinase (Ligase): 7

3 Enzyme Glucose dehydrogenase (GDH): 9

II Sử dụng enzyme Peroxidase để xác định hàm lượng thủy ngân trong nước bị ô nhiễm 10

1 Giới thiệu về enzyme peroxidase 10

2 Phương pháp xác định hàm lượng thủy ngân 10

3 Ưu điểm phương pháp 11

III Dùng enzyme Acetylcholinesterase để phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu 11

1 Giới thiệu enzyme Acetylcholinesterase 11

2 Cấu tạo 12

3 Cách phát hiện thuốc trừ sâu 12

Chương 3 Kết luận và xu hướng phát triển 13

I Kết luận 13

II Xu hướng phát triển: 13

TÀI LIỆU THAM KHẢO 14

Chương 1 Tổng quan về enzyme

I Khái niệm enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học được tổng hợp trong các tế bào sống có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng nhưng không bị biến đổi sau phản ứng

II Cấu trúc

• Thành phần: chỉ gồm protein hoặc protein kết hợp với một chất không phải protein

• Cấu trúc hóa học: có một vùng chuyên biệt gọi là trung tâm hoạt động, đây

là một chỗ lõm hoặc khe hở nhỏ trên bề mặt enzyme

• Cấu hình của trung tâm hoạt động phải tương thích với cấu hình không gian của cơ chất

III Cơ chế tác động

Gồm các bước:

• Enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp Enzyme – cơ chất

• Enzyme tương tác với cơ chất tạo sản phẩm

• Sản phẩm tạo thành và enzyme được giải phóng nguyên vẹn

IV Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

Hoạt tính của enzyme được xác định bằng lượng sản phẩm tạo thành từ một lượng cơ chất trên một đơn vị thời gian

Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme:

• Nhiệt độ: Trong giới hạn nhiệt hoạt tính của enzyme tỷ lệ thuận với nhiệt độ

• Độ pH: Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong 1 giới hạn pH xác định

• Nồng độ enzyme và cơ chất: Hoạt tính của enzyme thường tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme và cơ chất

• Chất ức chế hoặc hoạt hoá enzyme: Một số hoá chất có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính của enzyme

V Vai trò của enzyme

• Enzyme xúc tác làm tăng tốc độ các phản ứng, nếu tế bào không có enzim thì các hoạt động sống không thể duy trì và tốc độ phản ứng xảy ra quá

chậm

• Tế bào có thể điều chỉnh sự chuyển hóa bằng cách điều chỉnh tác động của enzyme, theo hướng ức chế hoặc hoạt hóa

• Khi một enzyme bị thiếu, cơ chất sẽ tích lũy lại hoặc chuyển hóa theo con đường phụ thành các chất độc hại gây nên các triệu chứng bệnh lí, gọi là bệnh rối loạn chuyển hóa

Chương 2 Ứng dụng của enzyme trong hóa phân tích

I Xét nghiệm hàm lượng Glucose máu

Phương pháp phổ biến hiện nay là dùng enzyme để đánh giá tình trạng rối loạn chuyển hóa glucid cũng như bệnh lý đái tháo đường hay hạ đường huyết

Phương pháp enzyme có độ đặc hiệu cao và thời gian nhanh nên rất hiệu quả 3 loại enzyme phổ biến hiện nay thường được dùng để định lượng glucose máu là hexokinase, glucose oxydase, glucose dehydrogenase

1 Enzyme Glucose oxydase (GOD)

1.1 Giới thiệu về Glucose oxydase

Nguồn gốc: Glucose oxydase có thể được thu nhận bằng nhiều con ñường khác nhau như tách từ thực vật, động vật, hay sinh tổng hợp từ vi sinh vật Hiện nay chủ yếu được tổng hợp bằng nấm mốc Aspergillus niger

Do đó người ta có thể sử dụng chế phẩm glucose oxidase để chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, làm thuốc thử trong hóa phân tích, sử dụng tính chất kháng sinh của glucose oxidase và ngăn ngừa các sản phẩm khỏi bị biến đổi

1.2 Phương pháp

Cơ chế là các loại enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa-khử liên quan đến phân

tử oxy (O2) là chất nhận electron Trong các phản ứng này, oxy bị khử thành nước (H2O) hoặc hydro peroxide (H2O2)

Đây là phương pháp phổ biến với các hóa chất cho máy hóa sinh bán tự động và một số máy hóa sinh tự động Phương pháp này kết hợp sử dụng emzym glucose oxydase và Peroxydase

GOD (glucose oxydase) Glucose + H2O -> Acid gluconic + H2O2

POD (Peroxydase) 2H2O2+ Phenol + 4 amino-Antipyrin -> Quinonemin +

4H2O

Phương pháp trải qua 2 bước Đầu tiên glucose trong mẫu được oxy hóa bởi enzym glucose oxydase để tạo H2O2 Tuy nhiên glucose oxydase có đặc hiệu cao với glucose trong khi trong huyết thanh còn có cả α-glucose với tỉ lệ 2/3 β-glucose, 1/3 α-β-glucose, do vậy một số hóa chất còn có thêm cả mutarotase để chuyển α-glucose thành β-glucose

H2O2 được tạo ra tỉ lệ thuận với nồng độ glucose Sau đó H2O2 tiếp tục tham gia phản ứng với Phenol và 4 amino-Antipyrin để tạo ra Quinonemin Quinonemin có màu hồng cánh sen, đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose Quinonemin được

đo ở bước sóng 540nm Một số phương pháp có thể đo ngay lượng H2O2 được tạo

ra mà không cần qua giai đoạn thứ 2 như máy đo đường huyết cầm tay hay máy khí máu

2 Enzyme Hexokinase (Ligase):

2.1 Giới thiệu về Hexokinase

Nguồn gốc: được tìm thấy trong tất cả các sinh vật, từ vi khuẩn, nấm men và động vật có xương sống khác Chúng được phân loại như một protein actin

Ứng dụng: trong y học, phân tích hóa học, điều chỉnh lượng đường có trong gan

và tuyến tụy, điều tiết sự trao đổi chất của glucose

2.2 Phương pháp

Đây là phương pháp phổ biến hiện nay trên các hệ thống máy tự động Phương pháp này là chính xác nhất hiện nay Bằng việc sử dụng enzyme Hexokinase nên rất đặc hiệu với glucose mà không bị nhiễu bởi các carbonhydrat khác Phương pháp trải qua 2 gian đoạn theo sơ đồ sau:

Hexokinase Glucose + ATP -> Glucose-6-Phosphat + ADP

G6PD Glucose-6-Phosphat + NADP+ -> 6-Phosphogluconat + NADPH +

H+

Giai đoạn 1: Hexokinase sẽ xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose tạo Glucose-6-Phosphat

Giai đoạn 2: G6PD sẽ xúc tác phản ứng oxy hóa Glucose-6-Phosphat để tạo NADPH Mật độ quang của NADPH tăng lên tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose và được đo ở bước sóng 340 nm

Cần lưu ý ở đây là Hexokinase xúc tác phản ứng phosphoryl cả fructose và mannose, tuy nhiên nồng độ các loại đường này trong máu là quá nhỏ và không đủ

để gây nhiễu cho phản ứng

Một lưu ý nữa là huyết thanh (huyết tương) vỡ hồng cầu có thể ảnh hưởng đến phương pháp này do trong hồng cầu có G6PD và 6-phosphogluconat dehydrogenase

mà cả 2 enzym này cũng sử dụng NADP+ làm cơ chất Do vậy ngày nay để giảm sự ảnh hưởng này người ta sử dụng G6PD của vi khuẩn (thay vì của nấm) vì G6PD của vi khuẩn sẽ sử dụng NAD+ thay thế NADP+

Đồng thời thay vì đo sự thay đổi mật độ quang của NADPH, hiện nay một số hóa chất sử dụng thêm một chất chỉ thị như phenazin methosulphat (PMS) hoặc Idonitrotetrazolium (INT) để tham gia phản ứng với NADPH tạo sản phẩm màu đo được ở bước sóng 520nm

2.3 Ưu điểm, nhược điểm

Ưu điểm của phương pháp này là có độ đặc hiệu cao Kết quả ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác

Nhược điểm là giá thành hóa chất còn cao

3 Enzyme Glucose dehydrogenase (GDH):

3.1 Giới thiệu về Glucose dehydrogenase

Nguồn gốc: được phân bố rộng rãi trong nhiều loài vi khuẩn và ở cả con người Trong các loài thực vật bậc cao, vài dạng dưới nhóm của G6PDH đã được tìm thấy trong cytosol, the plastidic stroma, và peroxisomes

Vai trò: Enzyme này là chất xúc tác cho con đường pentose phosphate, con đường chuyển hóa đóng vai trò giảm bớt năng lượng cung cấp cho tế bào bằng cách duy trì nồng độ của co-enzyme nicotinamide, adenine, dinucleotide phosphate Ứng dụng: trong y học, xét nghiệm, phân tích hóa học,…

3.2 Phương pháp

Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trên các máy đo đường huyết cá nhân Phương pháp chỉ xảy ra qua 1 phản ứng:

GDH β-D-Glucose + NAD+ -> D-Glucono-∆-lacton + NADH +

H+

NADH tạo ra được đo ở bước sóng 340 nm dưới dạng động học hoặc điểm cuối Ngoài ra người ta còn cho thêm mutarotase để chuyển các α-Glucose sang β-Glucose giúp kết quả được chính xác hơn

Tuy nhiên men GDH lại cũng phản ứng với các đường khác như maltose, galactose hay xylose Vì vậy nếu vì một lý do nào đó bệnh nhân có sử dụng các đường này trong điều trị sẽ làm kết quả tăng giả tạo Để tránh sai số này ngày nay người ta sử dụng loại GDH được phân lập từ chủng vi khuẩn Bacillus cereus rất đặc hiệu với glucose nên sẽ cho kết quả chính xác hơn và tương đương với phương pháp Hexokinase

II Sử dụng enzyme Peroxidase để xác định hàm lượng thủy ngân trong nước

bị ô nhiễm

1 Giới thiệu về enzyme peroxidase

Nguồn gốc: Peroxidase tìm thấy ở nhiều nguồn thực vật khác nhau như cải ngựa,

đu đủ, chuối, nhân trần…

Peroxidase là một nhóm các enzyme phổ biến quan trọng trong xúc tác quá trình oxi hóa chất nền bằng hydrogen peroxide hoặc peroxide hữu cơ Ngoài quá trình phân hủy peroxide, có những quá trình sinh học khác sử dụng enzyme này cho chức năng thích hợp

Chẳng hạn: enzyme peroxide có khả năng làm giảm ô nhiễm nước bằng cách xử

lý sinh học các hợp chất phenol, cresol và phenol clo hóa trong nước thải

2 Phương pháp xác định hàm lượng thủy ngân

Phương pháp cần dùng enzyme peroxidase, chất chỉ thị Indigocacmin 0,1%, nước thải chưa qua xử lý

Peroxidase xúc tác cho quá trình oxy hóa Ind khi có mặt H2O2:

Indigocacmin (màu xanh) + H2O2 → Indigocacmin (màu vàng) + H2O + O2 Theo dõi quá trình mất màu của Indigocacmin tính theo thời gian từ khi bắt đầu cho nước thải đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng hơi xanh

Khi enzyme bị ức chế bởi Hg2+ , tốc độ oxy hóa cơ chất sẽ nhỏ đi, thời gian mất màu dài hơn Như vậy, thời gian mất màu ti lệ thuận với nồng độ Hg2+ ức chế enzyme

Ảnh hưởng của ph đến hoạt độ của enzyme

Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme peroxidase hoạt động mạnh nhất tại giá trị

pH = 6,5 Ion Hg2+ ảnh hưởng đến hoạt tính cùa enzyme peroxide, tại giá trị nồng

độ Hg2+ là 5 mg/1 enzyme hoàn toàn mất hoạt tính

3 Ưu điểm phương pháp

Phát triển phương pháp sinh học dùng enzyme để phát hiện ion Hg2+ trong môi trường

Dễ dàng nhận biết được hàm lượng Hg2+ trong nước

Enzyme peroxidase nhạy cảm với tác nhân thường gặp sẽ nhanh chóng mất hoạt tính

Nguyên liệu rẻ tiền, giảm điều kiện về kinh tế

III Dùng enzyme Acetylcholinesterase để phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu

1 Giới thiệu enzyme Acetylcholinesterase

Acetylcholinesterase (AChE) là một enzyme đích quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer AChE được tìm thấy chủ yếu ở các mối nối thần kinh cơ và trong các synap thần kinh hóa học của loại cholinergic Một số các hợp chất chứa photpho hữu

cơ như các chất độc thần kinh và thuốc trừ sâu gây ức chế enzyme này, từ đó tạo nên độc tính AChE thuộc họ enzyme carboxylesterase

2 Cấu tạo

Đây là một enzyme xúc tác sự phân hủy của acetylcholine và một số este choline khác Acetylcholinesterase gồm 2 phần là acetic acid và choline gắn vào với nhau

3 Cách phát hiện thuốc trừ sâu

Enzyme acetylcholinesterase (AchE) xúc tác thủy phân cơ chất acetylcholin thành cholin và ãitaxetic

Axit acetic sẽ phản ứng với chất chỉ thị màu màu vàng

Dựa vào đặc tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm phospho hữu cơ và carbamate: Khi cho enzyme acetylcholinesterase vào trong mẫu phân tích có chứa dư lượng thuốc trừ sâu phospho hữu cơ, carbamate kìm hãm hoạt động enzyme hàm lượng axit acetic giảm, màu sẽ bị thay đổi Dựa vào

sự đổi màu so với mẫu ddooois chứng không có thuốc trừ sâu hoặc thang màu chuẩn

có thể định tính hoặc bán định lượng thuốc trừ sâu trong mẫu phân tích

Chương 3 Kết luận và xu hướng phát triển

I Kết luận

Ta có thể thấy được nếu như enzyme bị kìm hãm đặc hiệu, nhạy với một chất nào đó, có thể dùng enzyme đó để phát hiện và định lượng chất đó Điều này sẽ giúp ích rất nhiều trong các lĩnh vực trong đời sống như y khoa, môi trường, sinh học, Việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui

mô công nghiệp, không ngừng tăng về khối lượng, chủng loại và lĩnh vực ứng dụng Hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Các chế phẩm enzyme được ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như y học, hoá học, thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và các lĩnh vực khác

II Xu hướng phát triển:

Các enzyme có thể được chiết xuất từ các nguồn vi sinh vật, động vật và thực vật, trong đó, phần lớn được sản xuất từ vi sinh vật bởi sử dụng phương pháp vi sinh

là cách kinh tế nhất để sản xuất enzyme trên quy mô lớn

Với công nghệ sản xuất enzyme truyền thống, các enzyme được tách chiết từ các

cơ quan động vật, các nguyên liệu thực vật sau khi được nghiền hoặc từ quá trình lên men vi sinh vật trên quy mô lớn Các enzyme này phải trải qua các quá trình tinh chế tiếp theo bằng cách sử dụng nhiều kỹ thuật hóa học, cơ học và nhiệt học, như cô đặc, kết tủa, ly tâm, lọc và sắc ký Sau khi được tinh chế đến mức mong muốn, enzyme cô đặc được bào chế thành sản phẩm cuối cùng Các chế phẩm enzyme cuối cùng thường được bán trên thị trường ở dạng hạt hoặc dạng lỏng Enzyme ở trạng thái khô ổn định hơn nhiều so với trạng thái dung dịch Sấy phun là công nghệ được

sử dụng trong nhiều thập kỷ và vẫn là một trong những phương thức sản xuất phổ biến cho các sản phẩm enzyme công nghiệp Bên cạnh đó là các chế độ sấy khác như

đông lạnh, chân không Các sản phẩm enzyme rắn có thể được bào chế dưới dạng viên nang, viên nén

Với sự phát triển của các công nghệ enzyme mới như kỹ thuật di truyền và protein, việc sản xuất enzyme công nghiệp đã trở nên dễ dàng, với giá thành thấp hơn, đồng thời chất lượng và hiệu quả cao hơn

Sự ra đời của kỹ thuật di truyền, công nghệ DNA tái tổ hợp là bước đột phá quan trọng nhất trong sản xuất enzyme trong suốt 30 năm qua Kỹ thuật di truyền liên quan đến việc thay đổi gen ở vi sinh vật mã hóa protein Sự biểu hiện của enzyme tăng lên đáng kể khi sử dụng các hệ thống biểu hiện mạnh hoặc nhiều bản sao Các enzyme mới không thể tiếp cận trước đây có thể được nhân bản và sản xuất từ một sinh vật chủ đã được biết đến Bằng cách này, các enzyme từ hầu hết mọi nguồn trong tự nhiên đều có thể tiếp cận được, bao gồm cả enzyme từ các vi sinh vật nguy hiểm hoặc không được chấp thuận, từ các mô thực vật, động vật sinh trưởng chậm hoặc hạn chế

Kỹ thuật protein là công cụ quan trọng được sử dụng để tăng cường hoạt tính enzyme và tính chọn lọc cơ chất, sự bền nhiệt Nó đã tạo ra một cuộc cách mạng trong phát triển các enzyme có sẵn trên thị trường thành các chất xúc tác công nghiệp tốt hơn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]

https://www.tuyenlab.com/2016/02/3-phuong-phap-enzym-dung-e-xet-nghiem.html?m=1&fbclid=IwAR10rrNjMFBSovpLNjjqFrWgCaRXUL7s1mPvaIz lXNULLK0NWG6uFEwL44Y

[2]

https://baocantho.com.vn/cam-bien-phat-hien-du-luong-thuoc-tru-sau-a79355.html

[3] https://3bscitech.com.vn/thuoc-bvtv-tren-rau-qua-1-2-1818615.html