Ứng dụng enzyme trong phân tích hóa học 1

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM SEMINAR CÔNG NGHỆ ENZYME ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC GVHD TS ĐỖ VIỆT HÀ Nhóm sinh viên thực hiện Nhóm 11 Bùi Xuân Mỹ Duyên 18139033 Nguyễn Thị Duyên 18139036 Nguyễn Minh Luân 18139089 Nguyễn Thị Kim Ngân 18139105 Nguyễn Thị Mỹ Xuyên 18139230 Tháng 12 năm 2021 2 MỤC LỤC I GIỚI THIỆU VỀ ENZYME 3 II ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC 3 1 Việc sử dụng enzyme để phân tích, định l.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

SEMINAR CÔNG NGHỆ ENZYME ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME TRONG PHÂN TÍCH

HÓA HỌC

GVHD: TS ĐỖ VIỆT HÀ Nhóm sinh viên thực hiện: Nhóm 11

Bùi Xuân Mỹ Duyên 18139033 Nguyễn Thị Duyên 18139036 Nguyễn Minh Luân 18139089 Nguyễn Thị Kim Ngân 18139105 Nguyễn Thị Mỹ Xuyên 18139230

MỤC LỤC

I GIỚI THIỆU VỀ ENZYME 3

II ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC 3

1 Việc sử dụng enzyme để phân tích, định lượng các chất 4

1.1 Cảm biến sinh học dựa trên enzyme 4

1.1.1 Cảm biến sinh học dựa trên vi chất lỏng liên tục 4

1.1.2 Cảm biến sinh học dựa trên vi lỏng giọt 5

1.1.3 Hiệu quả của cảm biến sinh học từ enzyme 6

1.2 Hệ thống phát quang sinh học từ Luciferase 7

1.2.1 Luciferase với tư cách là gene reporter trong cơ thể sống 7

1.2.2 Luciferase ứng dụng thực nghiệm 7

1.3 Một số enzyme để định lượng các chất 8

1.3.1 Malate dehydrogenase (MDH) 8

1.3.2 Isocitrate dehydrogenase (IDH) 10

1.3.3 Enzyme Alcohol dehydrogenase (ADH) 11

1.3.4 Enzyme Urease 12

1.3.5 Sulfite oxidase 13

2 Điện cực có enzyme cố định 14

2.1 Nguyên tắc cấu tạo và hoạt động 14

2.2 Một số ví dụ về ứng dụng điện cực enzyme để phân tích các chất: 14

III KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN 15

BẢNG TỔNG HỢP CÁC ENZYME 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

I GIỚI THIỆU VỀ ENZYME

- Enzyme có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein Đa số enzyme có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn

- Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực

- Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzyme bị biến tính Môt trường acid hay base cũng làm enzyme mất khả năng hoạt động

- Enzyme có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng:

cation, anion hay trung hòa điện

- Enzyme chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase… và các enzyme hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein) Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần:

+ Apoenzyme: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzyme, quyết định tính đặc hiệu)

+ Coenzyme: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzyme), bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp

- Enzyme được ứng dụng trong hóa học là do enzyme có cảm ứng cao đối với nhiệt

độ, pH và những thay đổi khác của môi trường Rất hữu ích và thuận tiện vì độ đặc hiệu cao và độ nhạy của chúng

- Trong hóa phân tích để định tính và định lượng lượng một số chất Khi sử dụng enzyme để định lượng các chất thường có thể tiến hành theo 2 cách: Một là, dùng enzyme

có tác dụng phân giải riêng chất ấy, sau đó dùng một trong các phương pháp phân tích thông thường để định lượng các chất sau phản ứng, từ đó suy ra lượng có trong nguyên liệu cần nghiên cứu Hai là, nếu chất cần phân tích có tác dụng kiềm hãm, hoặc kích thích, hoặc đặc hiệu một enzyme nào đấy, ta có thể định lượng bằng cách xác định mức

độ ảnh hưởng của chúng đến hoạt độ enzyme, đối chiếu với bảng hoặc đồ thị chuẩn, để suy ra lượng chất cần phân tích Ví dụ như dùng enzyme phosphatase để định lượng ion fluo vì fluo có tác dụng kìm hãm enzyme này Phương pháp này có độ nhạy khá cao, có thể xác định được lượng fluo rất bé

- Có thể xác định các chất đặc biệt với hàm lượng rất thấp và bị lẫn với các chất

tương tự về mặt hóa học

- Cho phép định lượng trên vật liệu thô và các chất không bền trong điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, được kiểm soát

- Enzyme cũng được sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc hóa học như: dùng enzyme protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng enzyme endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid,… Ngoài ra, enzyme còn được dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích

1 Việc sử dụng enzyme để phân tích, định lượng các chất

1.1 Cảm biến sinh học dựa trên enzyme

- Enzyme là những protein có khả năng xúc tác các phản ứng hóa học với tốc độ tăng từ 105 đến 1017 lớn hơn so với các phản ứng không xúc tác (Hilvert, 2000) Các enzyme hoạt động như cảm biến sinh học thường xúc tác các phản ứng oxy hóa-khử Hiệu quả của các enzyme này có thể được theo dõi bằng nhiều phương pháp điện hóa khác nhau, điều này làm cho chúng trở thành cảm biến sinh học lý tưởng Ví dụ, glucose oxidase, một trong những cảm biến sinh học được sử dụng rộng rãi nhất, là một enzyme oxidoreductase chuyển các điện tử từ glucose thành oxy phân tử Cảm biến sinh học glucose, Clark Jr and Lyons (1962) mô tả lần đầu tiên vào năm 1962, sử dụng enzyme glucose oxidase cố định để xác định nồng độ glucose trong cơ thể

- Một trong những ưu điểm của việc sử dụng enzyme làm yếu tố nhận biết sinh học trong công nghệ cảm biến sinh học là chúng có tính chọn lọc cao đối với một chất nền

cụ thể hoặc một lớp chất nền Ưu điểm thứ hai là trong quá trình chu chuyển xúc tác, các enzyme có thể tạo ra các ion, proton, nhiệt, ánh sáng và / hoặc điện tử, tất cả đều là các thông số có thể đo được (Subrahmanyam et al., 2002)

1.1.1 Cảm biến sinh học dựa trên vi chất lỏng liên tục

- Trong hai thập kỷ qua, hệ thống vi lỏng liên tục đã được cải thiện Sự tiến bộ to lớn trong nghiên cứu vi chất lỏng đã tăng cường nghiên cứu các hệ thống sinh học từ phân tử đến các sinh vật đa bào nhỏ Các thiết bị phân tích dựa trên enzyme đã bổ sung thêm một khả năng tuyệt vời so với các phương pháp thông thường vì nó có thể phát hiện các hàm lượng nhỏ của các chất cần phân tích Do đó, cảm biến sinh học dựa trên enzyme dẫn đến giảm tiêu thụ thuốc thử, năng lượng, ít chất thải hơn, giảm chi phí và tích hợp các quá trình hóa học và sinh học trên một nền tảng duy nhất (Liu et al., 2010) Gần đây, cảm biến sinh học dựa trên vi lỏng liên tục đã được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng độc đáo khác nhau như: hóa học và sinh học hệ thống (Breslauer et al., 2006; Sato et al., 2008); sàng lọc sinh học và phát hiện thuốc (Hong et al., 2009); chuẩn đoán lâm sàng (Sato et al., 2008); thiết bị chăm sóc và các ứng dụng môi trường và y sinh (Hong et al., 2009) Trong phần bên dưới, ví dụ về cảm biến sinh học dựa trên vi lỏng liên tục sử dụng các yếu tố nhận dạng sinh học khác nhau được minh họa

Hình: Sơ đồ cảm biến sinh học dựa trên vi chất lỏng nanocompozit có chức năng lưỡng

enzyme được phát triển để phát hiện cholesterol (Ali et al., 2013)

- Ví dụ, cảm biến sinh học dựa trên vi chất lỏng nanocompozit có chức năng lưỡng enzyme được phát triển để phát hiện cholesterol (Ali et al., 2013) Trong công trình này, ông Ali và công sự đã tích hợp thành công hai loại enzyme là là cholesterol oxidase (ChOx) và cholesterol esterase (ChEt) lên trên và hạt nano niken oxit (nNiO) Sau đó,

họ gắn chúng lên ống nano cacbon nhiều thành (MWCNTs) Tiếp đến, được kết hợp với thiết bị phân tích quang phổ; quang điện tử tia X và kỹ thuật hiển vi điện tử quét Con chip chế tạo được sử dụng để đo sự thay đổi chronoamperometry khi có các nồng độ cholesterol oleate khác nhau (0,25 – 12,93 mM) Kết quả cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa sự thay đổi chronoamperometric và nồng độ cholesterol oleate Hệ thống tích hợp mới mang lại khả năng tái tạo cao, độ chọn lọc và độ nhạy tuyệt vời 2.2mA/mM/cm2

1.1.2 Cảm biến sinh học dựa trên vi lỏng giọt

- Chất vi lỏng dựa trên giọt là một trong những hệ thống quan trọng nhất được tích hợp với công nghệ cảm biến sinh học Gần đây, vi lỏng dựa trên giọt đã được sử dụng rộng rãi như một nền tảng mới cho nhiều ứng dụng bao gồm môi trường, y sinh, an ninh

và quốc phòng với tính di động tốt hơn và năng lượng thấp Trong phần sau đây, ví dụ

về cảm biến sinh học dựa trên vi chất lỏng dạng giọt sử dụng yếu tố nhận dạng sinh học khác nhau được minh họa

Hình: Sơ đồ của (A) một cảm biến sinh học điện hóa dựa trên giọt để theo dõi lượng

đường bằng cách sử dụng men glucose oxidase; (B) cảm biến điện hóa dựa trên giọt; và (C) theo dõi glucose trong giọt (C) (Gu et al., 2014)

- Một ví dụ về cảm biến điện hóa vi lỏng dựa trên giọt sử dụng vi điện cực đen Pt

và các enzyme để phát hiện glucose đã được chứng minh bởi (Gu et al., 2014) Phổ trở kháng điện hóa (EIS) và đo vôn theo chu kỳ (CV) được sử dụng để đo sự thay đổi của dòng điện hóa do quá trình oxy hóa β- d -glucose, tạo ra sản phẩm phụ là H2O2 Hệ thống cảm biến sinh học điện hóa dựa trên vi lỏng tích hợp mới cung cấp một cảm biến glucose

có độ nhạy cao và chi phí thấp với phản ứng tuyến tính lên đến 43,5 mM

1.1.3 Hiệu quả của cảm biến sinh học từ enzyme

- Các phương pháp tiêu chuẩn để xác định và phát hiện các mục tiêu cụ thể rất tốn kém, tốn thời gian và thiếu tính di động Sự tích hợp của microfluidics và cảm biến sinh học cung cấp một công cụ mạnh mẽ để thay thế các công cụ truyền thống cồng kềnh với khả năng hợp nhất các thành phần hóa học và sinh học thành một nền tảng duy nhất Cảm biến sinh học được coi là một công cụ phân tích mạnh mẽ và có khả năng hữu ích cho nhiều ứng dụng khác nhau, từ phát hiện thuốc, chẩn đoán y tế, an toàn thực phẩm, giám sát nông nghiệp và môi trường, an ninh và quốc phòng (Lindholm-Sethson et al., 2003) Cảm biến sinh học có thể được định nghĩa là một thiết bị phân tích (Lindholm-Sethson et al., 2003; Subrahmanyam et al., 2002) kết hợp yếu tố nhận dạng nhạy cảm sinh học (Mohanty and Kougianos, 2006) được cố định trên đầu dò hóa lý được kết nối với máy dò để xác định sự hiện diện của một hoặc nhiều chất phân tích cụ thể (Rasooly and Jacobson, 2006), nồng độ và động học của chúng trong mẫu Tính đặc hiệu và tính chọn lọc của cảm biến sinh học chủ yếu dựa trên các đặc tính ái lực của yếu tố nhận dạng sinh học Tín hiệu bắt nguồn từ sự tương tác giữa chất cần phân tích và yếu tố nhận biết sinh học sau đó được chuyển đổi bởi một bộ chuyển đổi thành một chỉ số quang học hoặc điện (Turner, 2013) Mặt khác, công nghệ microfluidics cung cấp khả năng tuyệt vời để thực hiện và phân tích các hoạt động phức tạp bao gồm sinh học hóa học và hệ thống (Breslauer et al., 2006; Sato et al., 2008), sàng lọc sinh học và khám phá thuốc (Fan et al., 2008) , chẩn đoán lâm sàng (Sato et al., 2008), phát hiện các chất độc khác nhau (García-Alonso et al., 2009), và các thiết bị ứng dụng y sinh, môi trường ở các nước đang phát triển và phát triển (Yu et al., 2013)

1.2 Hệ thống phát quang sinh học từ Luciferase

- Luciferase là một loại enzyme tạo ra ánh sáng khi oxy hóa chất nền của chúng Được tìm thấy tự nhiên trong đom đóm, trong các vi sinh vật biển và trên cạn phát sáng như là: Gaussia princeps, Renilla reniformis, Click beetle luciferase

1.2.1 Luciferase với tư cách là gene reporter trong cơ thể sống

- Hình ảnh các bước trong tạo ảnh phát quang sinh học trong cơ thể sống (Doyle

- Cuối cùng d: Dữ liệu thu được được truyền qua phần mềm hình ảnh Để tiến hành nghiên cứu

con vật này trong 36 ngày Đặt biệt, họ chỉ ra rằng luciferase không có ảnh hưởng tiêu cực đến tế bào

1.3 Một số enzyme để định lượng các chất

1.3.1 Malate dehydrogenase (MDH)

Người ta dùng enzyme malate dehydrogenase và 𝑁𝐴𝐷+ để xác định malicacid (có nhiều trong nho, rau, quả)

- Nguồn gốc: Enzyme này xuất hiện trong nhiều sinh vật bao gồm các mô động vật

và thực vật và trong vi sinh vật Là một thành phần của chu trình axit xitric, nó được tìm thấy với một lượng lớn trong ti thể và các phân tử

Hình Cấu trúc enzyme Malate dehydrogenase (MDH)

- Cơ chế:

MDH xúc tác thuận nghịch quá trình oxy hóa L-malate thành oxaloacetate bằng cách sử dụng 𝑁𝐴𝐷+ làm chất điện tử 𝑁𝐴𝐷+ nhận ion hydride và bị khử thành NADH

L-malate + 𝑁𝐴𝐷+ Oxaloacetate + NADH + 𝐻+

Trong quá trình chuyển đổi malate thành oxaloacetate, một sự thay đổi cấu trúc quan trọng xảy ra trên liên kết của chất nền trong đó một “vòng lặp” lật để chặn vị trí hoạt động khỏi dung môi Khi điều này xảy ra, các chất cặn khác trong vị trí hoạt động được đưa đến gần chất nền hơn để cho phép chuyển đổi Arg102 và Arg109 tham gia vào quá trình lật vòng này và do đó bất biến Sau khi lật vòng, phức hợp malate được ổn định

MDH

1.3.2 Isocitrate dehydrogenase (IDH)

Người ta sử dụng enzyme isocitrate dehydrogenase để xác định isocitric acid

- Nguồn gốc: Vi khuẩn Escherichia coli

- Cấu trúc:

Isocitrate dehydrogenase được phân loại là cấu trúc alpha beta

Thành phần thứ cấp của nó chủ yếu bao gồm các xoắn alpha và các tấm beta được sắp xếp thành cấu trúc bánh sandwich alpha beta alpha ba lớp

Toàn bộ protein bao gồm hai cấu trúc bánh sandwich cạnh nhau quay về hướng ngược nhau Sau đó, điều này làm cho hai vị trí hoạt động của protein đối mặt với nhau Trong isocitrate dehydrogenase của con người có 4 tiểu đơn vị

Hình Cấu trúc enzyme Isocitrate dehydrogenase (IDH)

- Cơ chế: IDH là các phân tử phụ thuộc NADP xúc tác quá trình khử carboxyl oxy hóa isocitrate để tạo ra α-Oxoglutarate và CO2 với việc sản xuất đồng thời NADPH Bằng cách sử dụng cation kim loại hóa trị hai (Mg2+ hoặc Mn2+) trong chu trình axit tricacboxylic

D-isocitrate + NADP+ IDH 𝛼-Oxoglutarate + NADPH + CO2 + H+

1.3.3 Enzyme Alcohol dehydrogenase (ADH)

Hình Cấu trúc của enzyme ADH

- Nguồn gốc:

 Ở động vật có vú, chúng có nhiều trong gan nhưng hiện diện ở các mức độ khác nhau trong các mô khác

 Nấm men (Saccharomyces)

- Cấu trúc: Alcohol dehydrogenase là một chất homodimer Mỗi monome đều có

374 đvC với khối lượng phân tử là 74000 dalton Có hai miền: Miền liên kết NAD+ bao gồm một tấm beta trung tâm gồm 6 sợi bao quanh bởi các vòng xoắn alpha NAD+ liên kết với đầu cuối C của bảng beta Miền xúc tác cũng có cấu trúc alpha / beta Giao diện giữa các miền tạo thành một khe hở chứa vị trí xúc tác hoạt động Có hai cation 𝑍𝑛2+

trên mỗi monome, một ở vị trí xúc tác là bắt buộc đối với xúc tác Chất nền rượu liên kết bên trong khe hở nơi có cation 𝑍𝑛2+, trong khi vòng nicotinamide của NAD+ tìm đường hướng vào khe hở Dimer hình thành với hai miền liên kết NAD+ đóng gói với nhau sao cho 2 trang beta trung tâm của chúng kết hợp với nhau để tạo thành một trang beta 12 sợi Các miền xúc tác nằm ở hai đầu đối diện

- Vai trò: Dùng để định lượng ethanol trong máu Ngoài những phương pháp bình

thường, người ta còn dùng enzyme ADH để xác định ethanol

- Cơ chế: Oxy hóa ethanol thành acetaldehyde, chuyển đổi NAD+ thành dạng khử NADH

Phản ứng xảy ra như sau:

1.3.4 Enzyme Urease

Hình Cấu trúc enzyme Urease

- Nguồn gốc: Urease được tìm thấy trong rất nhiều vi khuẩn, nấm, tảo, thực vật,

và một số động vật không xương sống, thậm còn có thể tồn tại trong đất Chẳng hạn Urease có trong Vi khuẩn Helicobacter pylori, vi khuẩn Bacillus pasteri, vi khuẩn Kebsiella aerogenes; đậu nành, đậu rựa

- Cấu trúc: Urease thực vật được tạo thành từ polypeptite chuỗi đơn trái ngược

với urease của vi khuẩn, bao gồm hai hoặc ba polypeptite được ký hiệu là alpha, beta và gamma Vị trí hoạt động của urease thực vật tương tự như urease của vi khuẩn, bao gồm trung tâm với 2 ion Niken, cách nhau một khoảng cách là 3,7 Å

- Vai trò: Người ta dùng enzyme urease để định lượng urea trong máu và nước

Urease

GLDH