Kiểm nghiệm thuốc bằng các phương pháp sinh học

Kiểm nghiệm thuốc bằng PP thử trên động vật Dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm đưa vào cơ thể một liều lượng theo qui định để đánh giá chất lượng của chế ph

Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học

Hai loại hình thử nghiệm

Thử nghiệm trên

động vật

Thử nghiệm trên

vi sinh vật

Kiểm nghiệm thuốc bằng PP thử trên

động vật

Dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm đưa vào cơ thể một liều lượng theo qui định để đánh giá chất lượng của chế phẩm cần thử

Nguyên tắc

Kiểm nghiệm thuốc bằng PP thử trên

Hai loại hình thử nghiệm trên động vật

Thử nghiệm in vivo Thử nghiệm in vitro

• Kiểm tra tính an toàn của vaccin và sinh phẩm

• Xác định hiệu lực của các vaccin và antitoxin

Thử độc tính bất thường

• Độc tính bất thường của thuốc được xác định bằng cách theo dõi số chuột chết trong thời gian 48 giờ sau khi cho chuột một liều thuốc qua đường dùng theo qui định

Thử độc tính bất thường

• Chuẩn bị dung dịch thử:

Hòa tan mẫu thử trong dung dịch natri clorid 0,9% hoặc nước cất tiêm hoặc phân tán đều mẫu thử trong nước cất để thu được dung dịch hoặc hỗn dịch có chứa lượng chất cần thử phù hợp với mức liều qui định

+ Tiêm dưới da ở lưng hoặc bụng

+ Uống bằng một kim cong đầu tù vào thực quản hoặc dạ dày

Thử độc tính bất thường

• Đánh giá kết quả:

Quan sát chuột 48 giờ sau khi dùng thuốc:

- Nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu

- Nếu có chuột chết, lại thử nghiệm với 10 chuột khác

- Nếu sau 48 giờ không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu

Thử chất hạ huyết áp

• Dựa vào tác dụng hạ huyết áp của

thuốc đem thử trên mèo đã được

gây mê so với tác dụng hạ áp của

thuốc Histamin

• Động vật: mèo khỏe mạnh, trưởng

thành, cân nặng từ 1,8kg trở lên

Thử chất hạ huyết áp

• Chuẩn bị thí nghiệm:

- Nước muối heparin chống đông máu: dung dịch chứa

50 đơn vị heparin trong 1ml natri clorid 0,9%

- Dung dịch histamin chuẩn: nồng độ 0,1µg/ml histamin base trong natri clorid 0,9%

- Mẫu thử: pha trong natri clorid 0,9% với nồng độ thích hợp ghi trong từng chuyên luận

Thử chất hạ huyết áp

• Tiến hành thí nghiệm:

- Mèo được gây mê bằng cloralose hoặc phenobarbital

để duy trì huyết áp đều

- Cố định mèo trên bàn mổ, giữ thân nhiệt ổn định bằng đèn hoặc lò sưởi

- Thông khí quản bằng một canun thủy tinh

- Bộc lộ động mạch cảnh, lồng canun có chứa đầy nước muối heparin vào động mạch cảnh

Thử chất hạ huyết áp

• Tiến hành thí nghiệm:

- Xác định độ nhạy của động vật với histamin

- Tiêm 1ml dung dịch histamin chuẩn/kg

- Tiêm lần một liều mẫu thử

- Tiêm lần hai liều mẫu thử

- Tiêm 1 ml dung dịch histamin chuẩn

Nhắc lại chuỗi tiêm một lần nữa

Kết thúc bằng 1,5ml dung dịch histamin chuẩn/kg

Thử chất hạ huyết áp

• Đánh giá kết quả:

- Nếu độ hạ áp của histamin chuẩn 1,5ml/kg ≤ liều 1ml/kg thí nghiệm không có giá trị

- Chế phẩm đạt yêu cầu về chất hạ áp khi:

+ Giá trị trung bình các độ hạ áp mẫu thử ≤ giá trị trung bình các độ hạ áp mẫu chuẩn liều 1ml/kg

+ Mức hạ áp mỗi lần tiêm mẫu thử ≤ mức hạ áp histamin chuẩn liều kết thúc 1,5ml/kg

Thử chất gây sốt

• Phép thử được xác định bằng cách đo sự tăng thân nhiệt thỏ sau khi tiêm tĩnh mạch dung dịch vô khuẩn của chất cần kiểm tra.

• Động vật thí nghiệm:

Thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, trên 1,5 kg

Nuôi bằng thức ăn không chứa kháng sinh và thỏ không bị giảm cân trong quá trình thử nghiệm.

Không dùng với thỏ mới thử chất gây sốt có kết quả âm tính trong vòng 3 ngày trước đó

Không dùng với thỏ dùng thử chất gây sốt có kết quả dương tính trong vòng 3 tuần

Thử chất gây sốt

• Thử nghiệm sơ bộ: không lựa chọn thỏ có nhiệt độ thay đổi quá 0,6 0 C

• Thử nghiệm chính thức: mỗi mẫu thử trên nhóm 3 thỏ

Dung dịch thử được làm ấm 38,5 0 C, tiêm tĩnh mạch chậm rìa tai thỏ không quá 4 phút, thể tích tiêm 0,5 – 10ml/kg

Theo dõi nhiệt độ và xác định đáp ứng: ghi nhiệt độ thỏ 30 phút một lần, ít nhất 90 phút trước khi tiêm và tiếp tục 3 giờ sau khi tiêm

Kiểm nghiệm thuốc bằng PP thử

vi sinh vật

Đặc điểm chung của VSV

• Kích thước nhỏ bé (0,2- 2 µm)

• Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh: E.coli chỉ sau 12-20 phút lại phân cắt 1 lần

• Có năng lực thích ứng mạnh và dễ dàng phát sinh biến

dị Penicillin tăng từ 20 U/ml lên 100000 U/ml

• Phân bố rộng, chủng loại nhiều, có nhiều kiểu dinh dưỡng khác nhau

Sinh trưởng và phát triển của VSV

• Giai đoạn tiềm phát (lag phase): TB tổng hợp các enzym mới, tái tạo AND, tăng thể tích và khối lượng

• Pha chỉ số (log phase)

- Sinh trưởng và phát triển với tốc độ tối đa

- Nhịp độ sinh trưởng không thay đổi

- Quần thể TB có trạng thái hóa học và sinh lý giống nhau

• Pha cân bằng

• Pha tử vong

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

• Môi trường tự nhiên: nguồn gốc từ động vật hay thực vật như: cao thịt, cao men, pepton, tinh bột…

• Môi trường tổng hợp: làm từ những hoá chất thuần khiết đã được quy định và thường hoà tan trong nước

• Môi trường bán tổng hợp: nguyên liệu tổng hợp và tự nhiên

Môi trường thioglycolat lỏng

• L-cystin: 0,5 g

• Natri clorid 2,50 g

• Glucose 5,50 g

• Thạch 0,75 g

• Chiết xuất men 5,00 g

• Casein thủy phân 15,00 g

• Nước cất 1000,0 ml

• Thioglycolat natri 0,50 g

• Resazurin natri 1% 1,00 ml Hấp ở 121o C 20 phút, pH 7,0-7,2

Yêu cầu chất lượng

• Phải vô khuẩn

• Tính chất phát triển: phải đảm bảo cho các chủng Bacillus subtitis ATCC 6633, Micrococcus luteus ATCC

9341, Clostridium sporogenes và Candida albicans phát triển tốt với liều gây nhiễm là 10-100 CFU/0,1 ml

Môi trường thạch casein đậu tương

• Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g

Môi trường lỏng casein đậu tương

• Casein thủy phân bởi pancreatin

Môi trường thạch Sabouraud

Phương pháp pha chế môi trường

• Chuẩn bị dụng cụ hóa chất

• Cân đong nguyên liệu

• Hòa tan nguyên liệu

Bảo quản môi trường

• Môi trường bột khô: 10- 12oC, khô, tránh ánh sáng

• Môi trường đã pha chế: 4- 10oC, 1- 2 tháng

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Các phương pháp tiệt khuẩn

• Tiệt khuẩn bằng nhiệt khô

• Tiệt khuẩn bằng hơi nước

• Phương pháp dùng tia bức xạ

• Phương pháp lọc

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Tiệt khuẩn bằng nhiệt khô

• Tiệt khuẩn các dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt: bông, băng, vải, gạc, dụng cụ thuỷ tinh…

• Nhiệt độ tiệt khuẩn:

180oC/30 phút

170oC/60 phút

160oC/120 phút

Tiệt khuẩn bằng hơi nước

• Tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật

• Môi trường thường được tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở

121oC/15 phút

Tiệt khuẩn bằng hơi nước (tiếp)

Tiệt khuẩn gián đoạn (phương pháp Tyndall )

• Tiệt khuẩn các môi trường dễ bị phân huỷ bởi nhiệt: đường, sữa, bia, máu, albumin…

• Tiến hành:

Hấp 3- 4 lần, nhiệt độ 60-80oC/30- 40 phútGiữa hai lần hấp, ủ ở nhiệt độ 28- 32oC trong vòng 24 giờ

Tiệt khuẩn bằng hơi nước (tiếp)

Khử khuẩn nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur)

• Đun cách thuỷ môi trường 60oC / 30 phút

• Hoặc 73oC / 15 phút

• Làm lạnh đột ngột dưới 10oC

• Không diệt được bào tử

Phương pháp lọc

• Áp dụng tiệt khuẩn môi trường dễ bị phá huỷ bởi nhiệt

• Cho môi trường đi qua màng lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ hơn 0,22μm

Phương pháp dùng tia bức xạ UV

• Tiệt khuẩn phòng pha chế, tủ cấy vi sinh vật

• Đèn tử ngoại được chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm

• Số lượng đèn tử ngoại phụ thuộc vào diện tích tiệt khuẩn, công suất đèn

• Tia tử ngoại có tác dụng diệt nấm kém

Có lắng cặn Thay đổi màu sắc

Nguyên tắc

Điều kiện tiến hành thử vô khuẩn

• Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn như trong buồng thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử không bị ô nhiễm

• Dụng cụ, dung môi, môi trường nuôi cấy phải được tiệt khuẩn trước khi dùng

Thử vô khuẩn (tiếp)

• Môi trường sabouraud lỏng: phát hiện vi nấm

Thử vô khuẩn (tiếp)

Kiểm tra chất lượng môi trường

• Kiểm tra độ vô trùng: không được có vsv phát triển

30- 35 o C/4 ngày (vi khuẩn) 25-28 o C/7 ngày (vi nấm)

Thử vô khuẩn (tiếp)

Kiểm tra chất lượng môi trường (tiếp)

• Kiểm tra dinh dưỡng: 100 vi sinh vật cấy vào môi trường phải phát triển tốt :

Vi khuẩn hiếu khí: staphylococcus aureus, bacillus subtilis, pseudomonas aeruginosa

Vi khuẩn kỵ khí: clostridium sporogenes

Vi nấm: candida albicans, aspergillus niger

Vi khuẩn: 30- 35oC/3 ngày

Vi nấm: 25- 28oC/5 ngày

Thử vô khuẩn (tiếp)

Phương pháp thử vô khuẩn

Phương pháp cấy trực tiếp

• Rẻ tiền

• Kỹ thuật đơn giản

• Khả năng phát hiện giảm

Phương pháp lọc qua màng

• Giữ lại phần lớn vi khuẩn

• Thử được vô trùng thuốc kháng sinh

• Đắt tiền

• Thiết bị kỹ thuật cao

Thử vô khuẩn (tiếp)

Lấy mẫu thử

- Lô < 100 đơn vị, lấy 3 đơn vị thử

- Lô > 100 đơn vị, cứ thêm 50 đơn vị lấy thêm 1 đơn vị để thử, tổng không quá 10 đơn vị

- Ống hoặc lọ, V ≥ 250 ml, số lượng > 500 đơn vị lấy 2 đơn vị để thử

Thử vô khuẩn (tiếp)

Kiểm tra tác dụng ức chế vsv của chất thử

Thử vô khuẩn (tiếp)

Nuôi cấy trong thời gian và điều kiện thích hợp:

- Vsv phát triển giống nhau ở hai ống, chế phẩm không có tác dụng ức chế vsv

- Vsv phát triển yếu hơn trong ống chứa chất thử, chế phẩm có tác

dụng ức chế vsv

- Loại bỏ chất ức chế vsv bằng pha loãng, trung hòa, màng lọc

Chuẩn bị thử

- Phòng thí nghiệm

- Dụng cụ

- Mẫu thử

- Môi trường cấy mẫu

- Thể tích mẫu cấy và thể tích môi trường

Thử vô khuẩn (tiếp)

Thể tích mẫu cấy

STT Số lượng trong 1 đơn vị

đóng gói Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy cho vào mt

1

Chất lỏng (trừ kháng sinh):

- Dưới 1 ml Toàn bộ một đơn vị đóng gói

- Từ 1 đến ít hơn 40 ml 1/2 đơn vị đóng gói nhưng

không dưới 1ml

- Từ 40 đến ít hơn 100 ml 20 ml

- Lớn hơn 100 ml 10% đơn vị đóng gói nhưng

không dưới 20 ml

Chế phẩm không tan, chế phẩm dạng kem, mỡ phải phân tán thành nhũ dịch

Lấy lượng tương ứng với ít

nhất 200mg thuốc

Thể tích mẫu cấy

STT Số lượng trong 1 đơn vị

đóng gói Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy cho vào mt

5

Chất rắn:

- Dưới 50mg Toàn bộ một đơn vị đóng gói

- Từ 50 đến dưới 300mg 1/2 đơn vị đóng gói nhưng

không dưới 50mg

- Từ 300mg đến 5g 150mg

- Lớn hơn 5g 500mg

Thể tích mẫu cấy

STT Số lượng trong 1 đơn vị

đóng gói Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy cho vào mt

6

Dụng cụ:

- Chỉ khâu phẫu thuật 3 sợi, mỗi sợi dài 30cm

- Bông băng, gạc phẫu thuật được đóng gói kín

100mg mỗi gói

- Chỉ khâu phẫu thuật và các dụng cụ khác được đóng gói dùng một lần

Toàn bộ đơn vị đóng gói

- Các dụng cụ y tế khác Toàn bộ dụng cụ, cắt nhỏ

dụng cụ hoặc tháo rời

Phương pháp màng lọc

• Màng lọc được thấm ướt bằng dung dịch thích hợp

• Rót mẫu thử lên màng lọc, dùng máy hút chân không

để rút ngắn thời gian

• Rửa màng lọc 3 lần bằng dung môi thích hợp

• Lấy màng lọc, cắt thành 2 phần, ngâm một phần vào môi trường thioglycolat và ủ 30- 350C/14 ngày

• Một phần ngâm trong môi trường soybean-casein và ủ

ở 20- 250C/14 ngày

Phương pháp cấy trực tiếp

• Lấy lượng mẫu thử theo qui định cấy vào hai loại môi trường thioglycolat và soybean-casein

• Ủ môi trường phát hiện vi khuẩn 30- 350C/14 ngày

• Ủ môi trường phát hiện vi nấm 20- 250C/14 ngày

Không có vi sinh vật phát triển, mẫu vô trùng

Có vi sinh vật mọc, mẫu không vô trùng

Thử vô khuẩn (tiếp)

Thử giới hạn vi sinh vật

Đếm số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men có trong dược phẩm thử, thông qua khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch hoặc trong ống nghiệm

Căn cứ vào các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh

Nguyên tắc

Thử giới hạn vi sinh vật (tiếp)

• Sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật khả năng nhiễm vsv cao

• Tá dược là tinh bột, đường, mật là môi trường nhiễm vsv cao và phát triển tốt gây nhiễm vsv cho chế phẩm

• Quá trình sản xuất không đảm bảo vô khuẩn

• Dạng bào chế có độ ẩm cao như viên hoàn mềm tạo

điều kiện cho vsv phát triển tốt

Nguyên nhân chế phẩm nhiễm vsv

Thử giới hạn VSV

• Thử nghiệm sơ bộ: tìm chất ức chế có trong thuốc

• Môi trường: tiệt khuẩn 121 oC/15 phút

Phương pháp thử giới hạn vi sinh vậtPhương pháp đĩa thạch

Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm

• Pha loãng chất thử trong môi trường lỏng ở 3 nồng độ 100, 10, 1 mg hoặc µl

• 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml môi trường soybean casein, chia 3 lô

• Lô 1, mỗi ống 1ml chất thử 100mg

• Lô 2, mỗi ống 1ml chất thử 10mg

• Lô 3, mỗi ống 1ml chất thử 1mg

• Đối chiếu số ống có vi sinh vật mọc, suy

ra số lượng vi sinh vật có trong 1g hoặc 1ml chế phẩm

Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm

1

0 1 0 0

1

0 0 0 1

0

<3 3 3 7

7 1

2 2

2

2 0 0

1

0 0 1

0

11 9 14

15

3

1 2 0

0

1 0 0

1

20 21 23

38 3

3 3

3

1 1 2

2

0 1 0

1

43 75 93

150

Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm

Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm

3

2 3 3 3

3

2 0 1 2

3

210 240 460 1100

>1100

Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm

Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm

Tiến hành thử giới hạn vi sinh vật

• Tìm các chất ức chế có trong thuốc

• Đếm tổng số vi khuẩn, nấm mốc

• Phân lập các vi khuẩn chỉ điểm y tế nhiễm vào thuốc

• Cấy thêm 1ml canh trùng 24h tuổi (103 vi khuẩn/ml)

• Quan sát sự phát triển của vi sinh vật, đếm số lượng khuẩn lạc

Tiến hành tìm chất ức chế

• Đĩa thử 1: cho 1ml chất thử (A)

• Đĩa thử 2: 1ml chất thử + 1ml nhũ dịch vi sinh vật (B)

• Đĩa thử 3: 1ml nước cất vô trùng + 1ml nhũ dịch vi sinh vật (C)

Đánh giá kết quả: bằng cách đếm số khuẩn lạc vi sinh vật trên đĩa thí nghiệm

Nếu B ≈ A + C, mẫu thử không có chất ức chếNếu B ≈ A hoặc B ≤ A + C , mẫu thử có chất ức chế vi sinh vật

Đếm tổng số vi khuẩn, nấm mốc

• Đối với vi khuẩn

- 1ml chất thử, không quá 300 khuẩn lạc trong 1ml

- Thêm 15- 20ml môi trường thạch soybean casein (thạch thường) để nguội dưới 45oC

- Nuôi cấy 30- 35oC trong 1- 2 ngày

• Đối với vi nấm

- 1ml chất thử, không quá 100 khuẩn lạc trong 1ml

- Thêm 15- 20ml thạch sabouraud có kháng sinh

- Nuôi cấy 25- 28oC trong 4- 5 ngày

Phép thử thực hiện với 2 nồng độ trong đó:

+ A1: số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k1

+ A2: số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k2

Xác định hoạt lực kháng sinh

• Nguyên tắc:

Phương pháp vsv xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so sánh khả năng ức chế sự phát triển của chủng vi sinh vật chỉ thị bởi những nồng độ đã biết của kháng sinh thử (chưa biết hoạt lực) với khả năng ức chế bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu ( kháng sinh chuẩn đã biết rõ hoạt lực)

Xác định hoạt lực kháng sinh (tiếp)

Xác định hoạt lực kháng sinh (tiếp)

• Chủng chỉ thị

Một số chủng chỉ thị hay được sử dụng:

Saccharomyces cerevisiaeMicrococcus luteus

Mycobacterium smegmatisEscherichia coli

Bacillus subtilis

Xác định hoạt lực kháng sinh (tiếp)

• Chất chuẩn

Có độ tinh khiết caoDùng chất chuẩn gốc hoặc chất chuẩn thứ cấp có hoạt lực được xác định theo mẫu chuẩn quốc tế

Chất chuẩn được đóng trong ống thuỷ tinh hàn kín bảo quản khô, tránh ánh sáng, nhiệt độ <0oC

Xác định hoạt lực kháng sinh (tiếp)

Ví dụ: 1U gentamicin là hoạt lực của 0,0056mg

gentamincin

Nguyên tắc : chất kháng sinh khuyếch tán vào môi trường dinh dưỡng đặc đã cấy vi sinh vật chỉ thị, tạo các vùng ức chế vi sinh vật có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ tương ứng

Phương pháp khuyếch tán Xác định hoạt lực kháng sinh (tiếp)

Pha chuẩn:

Pha chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1000UI/ml

Từ chuẩn gốc pha 3 nồng độ cuối cùng theo cấp số nhân hệ số hai là s1, s2, s3 hoặc hai nồng độ s1, s2

Chất thử:

Pha như chất chuẩn với giả định chất thử có hoạt lực tương đương chất chuẩn

Chất thử có 3 nồng độ cuối cùng là t1, t2, t3 hoặc t1, t2Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử

• Tạo đĩa thạch môi trường:

Môi trường 1 lớp đồng nhất dày 2- 5 mm

Môi trường 2 lớp: lớp nền và lớp trên cấy vsv chỉ thị

- Môi trường được cấy chủng chỉ thị có nhiệt độ 45oC, bào

tử có thể ở nhiệt độ 65- 70oC

- Môi trường để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi dùng

Tiến hành phương pháp khuyếch tán

Xác định hoạt lực kháng sinh (tiếp)