Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp hóa lý

Độ hấp thụTheo định luật Lambert- Beer, độ hấp thụ ánh sáng của một chất tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môi trường hấp thụ A = lg1/T = lgIo/I = K.C.L • T: độ truyền

Phương pháp hoá lý trong

kiểm nghiệm thuốc

Mục tiêu học tập

1 Trình bày được cấu trúc, cách hiệu chuẩn máy

quang phổ tử ngoại – khả kiến.

2 Trình bày được các phương pháp định lượng

bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến.

3 Trình bày được ứng dụng phổ hồng ngoại trong

kiểm nghiệm

4 Trình bày được phương pháp đo quang phổ

huỳnh quang

Phần 1.

Phương pháp quang phổ phân tử

1 Quang phổ UV-VIS (tiếp)

- Vùng khả kiến màu ánh sáng ứng với chùm tia có bước sóng gần nhau:

Các dải ánh sáng

• Các tia sáng phụ nhau từng đôi một sẽ tạo nguồn sáng không màu

• Màu của vật và màu bị vật hấp thụ là hai màu phụ nhau

1 Quang phổ UV-VIS (tiếp)

Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc của vật (tiếp)

• Những phân tử có điện tử dễ bị kích thích mới hấpthụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ trạng thái cơbản sang trạng thái bị kích thích

• Đó là các phân tử có chứa những nối đôi, nối đôi liên

hợp, nhân thơm hay những dị tố N, S, O

• Mỗi cực đại hấp thụ trên quang phổ đều có nguồngốc là sự chuyển trạng thái của điện tử trong phân tử

1 Quang phổ UV-VIS (tiếp)

Vai trò của các nhóm chức

trong phổ UV-VIS

Các yếu tố ảnh hưởng độ hấp

thụ

• Ảnh hưởng của dung môi

• Ảnh hưởng của sự liên hợp

• Ảnh hưởng của PH dung dịch

Độ hấp thụ

Theo định luật Lambert- Beer, độ hấp thụ ánh sáng

của một chất tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môi trường hấp thụ

A = lg(1/T) = lg(Io/I) = K.C.L

• T: độ truyền qua

• Io: cường độ ánh sáng đơn sắc tới

• I: cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch

• K: là hệ số hấp thụ phụ thuộc bước sóng λ

• L: là chiều dày lớp dung dịch

• C: nồng độ chất tan trong dung dịch

2 Định luật Lambert-Beer

• Trường hợp C tính bằng mol/l, L tính bằng cm thì A tính theo công thức:

A = ε L C

Khi C = 1mol/l và L = 1cm thì A = ε (hệ số hấp thụ phân tử)

• Trường hợp C tính theo % khối lượng trên thể tích (Kl/TT) và bằng 1%, L = 1cm thì E (1%, 1cm) là hệ số hấp thụ riêng, đặc trưng cho mỗi chất

A = E L C → E = A/(L.C) 1%1cm 1%1cm

•  đặc trưng cho bản chất của chất tan trong dung dịch chỉ phụ

thuộc bước sóng ánh sáng đơn sắc

2 Định luật Lambert-Beer

Điều kiện áp dụng định luật Lambert - Beer

• Ánh sáng phải đơn sắc

• Khoảng nồng độ phải thích hợp

• Dung dịch phải trong suốt

• Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của ánh sáng UV-VIS

3 Cấu tạo máy quang phổ

• Nguồn sáng cung cấp các bức xạ điện từ:

UV: đèn deuteri hoặc hydroVIS: đèn halogen tungsten

• Bộ phận tán sắc: chọn 1 bước sóng đặc trưng

• Bộ phận đựng mẫu đo:

2 cuvet chứa dung dịch thử và dung dịch so sánh

• Bộ phận detector: dùng để đo cường độ tia bức xạ

• Vùng hoạt động của máy ở bước sóng 200- 800nm

Nguồn sáng

Nguồn sáng

Nguồn sáng

Thiết bị tạo bức xạ đơn sắc

✓ Thu nhận chùm bức xạ đa sắc phát ra từ đèn, và cho bức xạ đơn sắc đi ra.

✓ Có 2 loại thiết bị phổ biếntạo bức xạ đơn sắc: lăng kính và cách tử

Thiết bị tạo bức xạ đơn sắc

Thiết bị nhận biết (Detector)

Cấu tạo máy UV-VIS

Cấu tạo máy quang phổ một chùm tia

Cấu tạo máy quang phổ hai chùm tia

Thiết bị 2 chùm tia

4 Hiệu chuẩn máy quang phổ UV-VIS

• Kiểm tra độ dài sóng

5 Ứng dụng phổ UV-VIS định tính và

thử tinh khiết

• Mỗi chất có các cực đại hấp thụ đặc trưng, dựa vào đó

để nhận biết và phân biệt các chất

Ví dụ: Trong dung dịch nước:

+ Vitamin B12 có ba cực đại hấp thụ ở các bước sóng:

278 nm ± 1 nm

361 nm ± 1 nm

548 nm ± 2 nm + Cloramphenicol có 1 cực đại hấp thụ ở bước sóng 278nm + Paracetamol có 1 cực đại hấp thụ ở bước sóng 257nm

• Sử dụng hệ số Match: đánh giá sự tương đồng giữa 2

Chọn điều kiện xây đựng qui trình định lượng

• Chọn bước sóng hoặc kính lọc

- Bước sóng ứng với các cực đại hấp thụ

- Tại max, sai số bước sóng ít ảnh hưởng

- Đối với máy dùng kính lọc (quang kế): màu kính lọc và màu của dung dịch phải phụ nhau

6 Ứng dụng phổ UV-VIS trong định

lượng

Chọn điều kiện xây đựng qui trình định lượng (tiếp)

• Chọn khoảng nồng độ thích hợp

- Khoảng nồng độ có quan hệ tuyến tính với độ hấp thụ

- Nồng độ phải được chọn sao cho độ hấp thụ rơi vào

khoảng vùng tối ưu là 0,2 – 0,8 và càng gần 0,43 càng tốt

6 Ứng dụng phổ UV-VIS định lượng (tiếp)

Chọn điều kiện xây đựng qui trình định lượng (tiếp)

• Chọn các điều kiện khác

- Loại trừ ảnh hưởng của chất lạ

- Chiết chất cần định lượng khỏi các tá dược, các chất phối hợp trong công thức (viên nén B1, viên nén bisepton)

- Chọn pH và dung môi thích hợp

- Thực hiện phản ứng màu: nhiều chất hấp thụ ánh sáng

ở cùng một cực đại hấp thụ, thực hiện phản ứng màu tạo chất mới có khả năng hấp thụ ánh sáng ở cực đại dễ phân biệt

6 Ứng dụng phổ UV-VIS định lượng (tiếp)

Phương pháp đo phổ trực tiếp

Các phương pháp định lượng:

Phương pháp gián tiếp

Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng

Phương pháp đo phổ trực tiếp

A = E L C → L = 1cm, C = A/ E 1%

1cm 1%

1cm

1 Phương pháp đường chuẩn

2 Phương pháp so sánh

3 Phương pháp thêm đường chuẩn

Phương pháp gián tiếp

Đặc điểm của phương pháp gián tiếp:

+ Phải có chất chuẩn để so sánh+ Không cần phải chuẩn máy

1.Phương pháp đường chuẩn

• Chuẩn bị một dãy chuẩn khoảng 5 dung dịch có các nồng độ chất chuẩn Cs khác nhau

• Đo độ hấp thụ As của dãy chuẩn và lập đồ thị của A theo C

• Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch mẫu thử và dựa vào đường

chuẩn ta xác định được nồng độ mẫu thử Cx

Chú ý: Khi xây dựng đường chuẩn nên khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ với độ hấp thụ

Phương pháp gián tiếp (tiếp)

2.Phương pháp so sánh

Theo định luật Lambert- Beer:

As = K L Cs

Ax = K L Cx

As là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ Cs

Ax là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử nồng độ Cx

Ax/As = Cx/Cs → Cx = Cs (Ax/As)

Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và dung dịch chuẩn Cs không được chênh lệch nhau quá nhiều

Các nồng độ này càng gần nhau, kết quả càng chính xác

Phương pháp gián tiếp (tiếp)

3 Phương pháp thêm chuẩn so sánh

• Lấy hai lượng giống nhau của một mẫu thử.

• Thêm một lượng chất chuẩn đã biết vào một mẫu

• Đo độ hấp thụ của cả hai dung dịch với:

Ax: độ hấp thụ của dung dịch thử A'x: độ hấp thụ của dung dịch thử đã thêm chuẩn Với Cs là nồng độ của dung dịch chuẩn, ta tính được nồng

độ Cx theo phương trình:

Ax/A'x = Cx/(Cs + Cx) → Cx = Cs [Ax/(A'x - Ax) ]

Ưu điểm: loại trừ các yếu tố gây sai số: xử lý mẫu (chiết xuất), sai

lệch do thiết bị và hoá chất thuốc thử…

Phương pháp gián tiếp (tiếp)

Một số điều cần lưu ý

• Bật máy trước khi đo15 phút cho máy ổn định

• Mẫu đem đo phải trong

• Cốc đo phải tốt, thường cho phép sai số về độ dày của cốc là  0,01 mm

• Mẫu chuẩn và mẫu thử sử dụng cùng loại cốc đo

• Cốc đo đặt thẳng đứng trong khoang đo mẫu, nên luôn luôn hướng cùng một mặt của cốc đo về phía ánh sáng

• Cốc đo phải tráng rửa ít nhất 3 lần bằng dung dịch đo

• Cốc phải được dùng cẩn thận để tránh xước, tránh để lại vết tay trên bề mặt của cốc đo

• Khi đo mẫu được chuẩn bị trong dung môi dễ bay hơi thì phải dùng nắp đậy trong quá trình đo mẫu, để tránh sai số về nồng độ

• Đối với những mẫu yêu cầu nghiêm ngặt về nhiệt độ thì phải

có bộ phận điều nhiệt trong suốt quá trình đo

Một số điều cần lưu ý

PHẦN 2

Quang phổ hồng ngoại (IR)

Bức xạ hồng ngoại bắt đầu từ vùng nhìn thấy đến vùng vi sóng, được chia làm 3 vùng:

2 Quang phổ hồng ngoại (IR) (tiếp)

• Chiếu một nguồn sáng vào phân tử, phân tử hấp thụ

năng lượng bức xạ hồng ngoại làm thay đổi trạng thái dao động của phân tử

• Phổ hồng ngoại gọi là phổ dao động

• Phổ hồng ngoại có nhiều đỉnh, mỗi đỉnh là một thông tin

về cấu trúc của phân tử

• Nhiều nhóm chức có dải phổ hồng ngoại đặc trưng, ứng dụng trong định tính

Cấu tạo máy đo quang phổ hồng ngoại

Máy 2 chùm tia gồm có các bộ phận chính:

+ Nguồn bức xạ hồng ngoại+ Ngăn đựng mẫu đo

+ Bộ phận đơn sắc hóa (sử dụng các cách tử hoặc lăng kính)

+ Hệ thống quang học+ Bộ phận phát hiện

2 Quang phổ hồng ngoại (IR) (tiếp)

Cấu tạo máy đo quang phổ hồng ngoại

Nguồn sáng Khe sáng

Mẫu đo

Bộ phận phát hiện

Ứng dụng phổ hồng ngoại trong định tính

Ứng dụng trong định tính các chất hữu cơ

Nguyên tắc:

+ So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ chuẩn cho sẵn trong sách tra cứu hoặc trong thư viện phổ lưu trữ trong máy tính

+ So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ hoá chất chuẩn được ghi trong cùng điều kiện

2 Quang phổ hồng ngoại (IR) (tiếp)

Ví dụ: phổ hồng ngoại của collagen trong dd acid

Phổ hồng ngoại được chia làm hai vùng:

+ Từ 1350 - 750 cm-1, được gọi là vùng vân tay

(fingerprint region): dựa vào tín hiệu phổ trong vùng này

để kết luận sự không có mặt của một nhóm chức nào đó

+ Từ 4000 - 2500 cm-1: đây là vùng xuất hiện dao động hóa trị của liên kết - dị tố và vùng dao động của

các liên kết bội như là anken, carbonyl

2 Quang phổ hồng ngoại (IR) (tiếp)

Ứng dụng phổ hồng ngoại trong xác định cấu trúc

3 Quang phổ huỳnh quang

• Phổ huỳnh quang là phổ phát xạ phân tử

• Phân tử sau khi hấp thụ năng lượng của bức xạ tử

ngoại, khả kiến hoặc bức xạ điện từ khác, nó ở trạng thái kích thích

• Trạng thái kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức xạ, được gọi là bức

xạ huỳnh quang

3 Quang phổ huỳnh quang (tiếp)

Cường độ huỳnh quang F của một dung dịch loãng

tỷ lệ thuận với nồng độ chất tan C (mol/l)

F = K Io ε Φ C L

K: là hằng số

Io: là cường độ của bức xạ kích thích Φ: là hiệu suất huỳnh quang (Φ = số proton phát xạ/số proton hấp thụ)

ε: là hệ số hấp thụ mol của chất thử ở bước sóng kích thích

Việc đo phổ huỳnh quang tiến hành với dung dịch loãng C<10-4

Cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang

• Nguồn sáng: thường dùng đèn xenon và đèn laser

Cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang

Phương pháp đo quang phổ huỳnh quang

• Kiểm tra máy trước khi đo:

Vùng tuyến tính của cường độ huỳnh quang

Độ nhạy của thiết bị với độ pha loãng thích hợp của dung dịch chuẩn

• Ghi cường độ huỳnh quang của dung dịch thử, dung

dịch chuẩn và các mẫu trắng

Nguyên tắc: so sánh phổ huỳnh quang mẫu thử với mẫu chuẩn

3 Quang phổ huỳnh quang (tiếp)

Phương pháp đo quang phổ huỳnh quang (tiếp)

• Cx: là nồng độ của dung dịch thử

• Cs: là nồng độ của dung dịch chuẩn

• Ix: là trị số cường độ bức xạ đo được của dung dịch thử

• Is: là trị số cường độ bức xạ đo được của dung dịch chuẩn

• Iox và Ios là trị số cường độ bức xạ đo được của các mẫu trắng tương ứng

Cx = Cs [(Ix - Iox)/(Is - Ios) ]

Nồng độ của dung dịch thử được tính theo công thức:

• Vùng trong đó cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với nồng độ của chất thử thường rất hẹp

• Tạp chất trong dung môi ảnh hưởng đáng kể tới

cường độ huỳnh quang

• Tiểu phân keo có thể gây nên sự tán xạ ánh sáng, cần phải loại bỏ chúng bằng cách ly tâm hoặc lọc bằng

màng lọc thuỷ tinh xốp

• Oxy hoà tan trong dung dịch làm giảm cường độ

huỳnh quang rất mạnh, cần phải đuổi oxy ra bằng

cách sục khí trơ qua dung dịch

Chú ý:

Phương pháp đo quang phổ huỳnh quang (tiếp)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High- Performance Liquid Chromatography)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

+ K phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ+ Đối với một chất, K càng lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh nên sẽ di chuyển chậm, và ngược lại

Nếu k' sự tách kém, k' lớn thì pic bị doãng, độ nhạy

kém Trong thực tế k' từ 1 đến 8 là tối ưu

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

 khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng

(  từ 1,5 đến 2,0 là tối ưu)

3 Độ chọn lọc 

Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc

ký, khi hai chất A, B có k' A và k'B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc 

tR là thời gian lưu

0 RA

t t

t

t

−

−

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

Ví dụ: về độ chọn lọc  ảnh hưởng tới khả năng tách 2 chất

02 ,

1 58 , 2

64 , 2

15 , 2

95 , 1



Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

• Bề dầy H của đĩa lý thuyết phụ thuộc các yếu tố:

4 Số đĩa lý thuyết N (tiếp)

+ Đường kính và độ hấp thụ của hạt pha tĩnh+ Tốc độ và độ nhớt của pha động

+ Hệ số khuếch tán của các chất trong cột

• Trong điều kiện xác định, chiều cao H hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột được xác định:

N = 16 x (tR/W )2 hoặc 5,54 x (tR/W0,5 )2

W: chiều rộng đo ở đáy pic

W0,5: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

• Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các

chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho

5 Độ phân giải R

• Nếu các pic cân đối thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu

là R = 1,0 Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp

R = 2 (tRB - tRA)/( WB + WA) hoặc R = 1,18 (tRB - tRA)/( W0,5B + W0,5A)

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

Nếu R nhỏ thì các pic chưa tách hẳn, cần tăng R theo 3cách sau đây:

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký (tiếp)

• Hệ số bất đối xứng T cho

biết mức độ không đối

xứng của pic trên sắc đồ

Sơ đồ cấu tạo máy HPLC

Bình chứa dm

Bơm cao áp Tiêm mẫu

Cột HPLC (pha tĩnh)

Cấu tạo máy HPLC

- Bơm cao áp

Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi

- Bộ phân tiêm mẫu

Dung dịch mẫu được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả

năng hoạt động ở áp suất cao

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy, sử dụng vòng đựng mẫu dung tích 5-500l, thường dùng 20; 50; 100l

Cấu tạo máy HPLC (tiếp)

- Cột tách

• Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký

• Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm được coi là vi cột

• Nhiệt độ của pha động, cột được giữ ổn định trong thời gian phân tích

• Nhiệt độ cột không được vượt quá 60 o C vì khả năng phân huỷ của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra

• Chất nhồi cột là Silicagel hoặc là Silicagel đã được silan hoá hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ, hoặc các hạt khác: nhôm oxyd, polyme xốp, chất trao đổi ion

• Các phương pháp phân tích yêu cầu nhiệt độ cột cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột sẽ được đặt trong bộ phận điều nhiệt

Cấu tạo máy HPLC (tiếp)

Cấu tạo máy HPLC (tiếp)

- Detector

• Tín hiệu detector phát hiện có thể là : độ hấp thụ quang,

cường độ phát xạ, cường độ dòng điện, điện thế, độ dẫn điện,

độ dẫn nhiệt, góc khúc xạ, phổ khối

• Phân loại detector:

+ Detector quang phổ tử ngoại: 200 - 380nm + Detector quang phổ tử ngoại và khả kiến: 190 - 900nm + Detector huỳnh quang: phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang + Detector điện hoá: đo dòng, cực phổ, độ dẫn điện, điện lượng + Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ

+ Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt + Detector tán xạ ánh sáng bay hơi

+ Detector khối phổ

Cấu tạo máy HPLC (tiếp)

- Máy ghi tín hiệu

+ Máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc đồ, ghi thời gian lưu, diện tích pic hoặc chiều cao pic, % diện tích pic

+ Máy vi tính ngoài khả năng ghi còn có khả năng xử lý kết quả, lưu kết quả

Cấu tạo máy HPLC (tiếp)

Cấu tạo máy HPLC (tiếp)

Lựa chọn pha tĩnh

• Silicagel, nhôm oxyd hoặc than hoạt tính dạng xốp: phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp phụ hoặc (và) phân bố khối lượng

• Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức axit hoặc bazơ,

sử dụng trong sắc ký trao đổi ion

• Silicagel xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử,

sự chia tách dựa trên sự khác nhau về thể tích phân tử

• Pha tĩnh loại biến đổi hoá học đặc biệt, ví dụ như dẫn xuất

của cellulose và amylose, protein hay peptid, cyclodextrin

dùng để phân tách các đồng phân đối quang (sắc ký bất đối)

Lựa chọn điều kiện HPLC