Nghiên cứu giải mã một phần hệ gen ty thể của loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini (mẫu Việt Nam) và so sánh với các chủng của thế giới bằng các phương pháp sinh học phân tử

Nghiên cứu giải mã một phần hệ gen ty thể của loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini (mẫu Việt Nam) và so sánh với các chủng của thế giới bằng các phương pháp sinh học phân tử

luËn ¸n ®−îc hoμn thμnh t¹i viÖn c«ng nghÖ sinh häc

Ng−êi h−íng dÉn khoa häc:

PGS.TS Lª Thanh Hßa

TS TriÖu Nguyªn Trung

GS.TSKH Vò ThÞ Minh Thôc

Ph¶n biÖn 1: PGS.TS Nguyễn Nghiêm Luật

Trường Đại học Y Hà Nội Ph¶n biÖn 2: PGS.TS Nguyễn Văn Mùi

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Ph¶n biÖn 3: GS.TS Lê Bách Quang

Học Viện Quân y

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước, họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội

vào hồi 14 giờ ngày 25 tháng 09 năm 2008

Cã thÓ t×m hiÓu luËn ¸n t¹i:

- Th− viÖn Quèc gia

- Th− viÖn ViÖn C«ng nghệ sinh häc

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ký sinh trùng (KST) là tập hợp sinh vật rất đa dạng, nên việc phân loại về nhóm, loài, chủng trước đây đã có phần thiếu chính xác, đặc biệt đối với một số loài đồng hình (sibling species), đôi khi đã gộp nhầm những

cá thể hoặc quần thể ký sinh trùng mà thực chất chúng có những đặc tính

di truyền học hoàn toàn khác biệt nhau Hiện nay các phương pháp sinh học phân tử (SHPT) đã bước đầu được ứng dụng trong chẩn đoán phân loại và lập phả hệ sinh vật Trong đó, các chỉ thị di truyền hệ gen ty thể

(cox1, nad1, nad3, atp6…) đã được sử dụng phổ biến trong phương pháp

phân loại sinh học phân tử Ưu điểm của gen ty thể là ở thể đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ và có tỷ lệ biến đổi nucleotide cao Do

có kích thước nhỏ, lại chứa các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào, nên ADN hệ gen ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể

Bệnh sán lá gan nhỏ do Opisthorchis viverrini gây nên

(opisthorchiasis), là bệnh ký sinh trùng truyền qua đường thức ăn, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng ở các nước Đông Nam Á bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam Bệnh này đã được nghiên

cứu rộng rãi ở Thái Lan, nơi được coi là trung tâm về dịch tễ của O

viverrini, có khoảng 6 triệu người bị nhiễm sán lá gan Sự nhiễm bệnh có

liên quan đến một số bệnh về gan mật như bệnh đường mật, vàng da tắc

mật, to gan, viêm túi mật, bệnh sỏi mật và O viverrini được coi là tác nhân

góp phần gây bệnh ung thư đường mật

Sán lá gan nhỏ O viverrini đã được xác định là có mặt ở một số tỉnh

miền Trung, bước đầu đã khảo sát dịch tễ học và chẩn đoán, song cho đến nay, các dữ liệu toàn diện về hệ gen ty thể của loài sán nguy hiểm này ở Việt Nam vẫn chưa có hoặc chưa đầy đủ Do vậy, việc phân tích một phần

hệ gen ty thể và thành phần gen của O viverrini gây bệnh ở người từ các

vùng địa lý khác nhau sẽ góp phần vào nghiên cứu ký sinh trùng phân tử ở Việt Nam và thế giới Trên cơ sở những kết quả đó cho phép ứng dụng lập bản đồ phân bố dịch tễ học phân tử, tìm hiểu cơ chế sinh bệnh, xây dựng các phương pháp và bộ sinh phẩm (kit) chẩn đoán nhanh nhằm nghiên cứu các loại thuốc, vacxin để giúp cho việc phát hiện và điều trị bệnh này một cách hiệu quả Xuất phát từ những vấn đề thiết thực về nghiên cứu gen học

hệ gen ty thể đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu giải mã một phần hệ gen ty thể của loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini (mẫu Việt Nam) và so sánh với các chủng của thế giới bằng các phương pháp sinh học phân tử”

- Thẩm định mối quan hệ về loài của O viverrini trong lớp Trematoda

và trong ngành sán dẹt (Platyhelminthes) trên cơ sở phân tích vùng gen ty thể

3 Những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn của đề tài

- Lần đầu tiên trình tự vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các phân lập O

viverrini ở những vùng địa lý khác nhau của Việt Nam là Quảng Nam,

Bình Định và Phú Yên được xác định

- Lần đầu tiên đặc tính gen học vùng gen ty thể dài 4,2 kb của loài

sán lá gan nhỏ O viverrini bao gồm trật tự, cấu trúc, tương đồng, thành

phần kiến tạo, mối quan hệ phả hệ được phân tích, góp phần quan trọng vào phát triển nghiên cứu sinh học phân tử của ngành ký sinh trùng hiện đại

- Lần đầu tiên mối quan hệ về loài và vị trí phân loại của sán lá gan

nhỏ O viverrini được làm sáng tỏ, giúp hiểu biết hơn về các loài trong lớp

sán lá (Trematoda) và ngành sán dẹt Platyhelminth

Các kết quả thu được từ vùng gen 4,2 kb của các phân lập O

viverrini sẽ giúp ích cho việc xây dựng kit chẩn đoán để phòng chống và

điều trị bệnh này có hiệu quả ở Việt Nam và thế giới

4 Bố cục luận án

Luận án gồm 147 trang (không kể phần phụ lục), kết cấu thành 3

chương

- Mở đầu: 3 trang

- Chương 1: Tổng quan tài liệu: 47 trang (13 hình, 1 bảng)

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 20 trang (6 hình)

- Chương 3: Kết quả và thảo luận: 63 trang (23 hình, 18 bảng)

- Kết luận và kiến nghị: 2 trang

- Tài liệu tham khảo: 178 tài liệu (26 tiếng Việt, 152 tiếng Anh)

- Phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ CỦA BỆNH OPISTHORCHIASIS VÀ PHÂN BỐ ĐỊA LÝ

Bệnh sán lá gan nhỏ (opisthorchiasis) do Opisthorchis viverrini gây

nên là bệnh quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng ở các nước Đông Nam

Á bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam Bệnh này đã được

nghiên cứu rộng rãi ở Thái Lan, nơi được coi là trung tâm về dịch tễ của O

viverrini, có khoảng 6 triệu người bị nhiễm sán lá gan Sự nhiễm bệnh có

liên quan đến một số bệnh về gan mật như bệnh đường mật, vàng da tắc mật, to gan, viêm túi mật, bệnh sỏi mật Hơn nữa các bằng chứng về thực nghiệm và dịch tễ học đã chứng minh sán lá gan nhỏ là tác nhân góp phần

gây nên bệnh ung thư đường mật

Ở Việt Nam, sán lá gan nhỏ O viverrini được tìm thấy ở một số tỉnh

phía Nam (Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Huế, Đak Lak…) và đã được giám định phân tử bằng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể

1.2 HỆ GEN TY THỂ VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU KÝ SINH TRÙNG

Hiện nay đã có rất nhiều loài đã có hệ gen ty thể được giải mã toàn bộ hoặc một phần, cung cấp nguyên liệu chuỗi nucleotide và amino acid cho

so sánh giám định các loài cần nghiên cứu Do có kích thước nhỏ, lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào, nên ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể Các gen trong ty thể lại có hệ

số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân tế bào 10-15 lần, nên rất thuận lợi cho nghiên cứu về tiến hoá Các gen của ty thể trong cùng chủng, cùng loài, thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao,

do vậy, bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định

và phân loại

Nghiên cứu hệ gen ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều trị và phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật liên quan đến sự biến đổi ở ty thể Đối với KST, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể, còn có giá trị định hướng trong phòng chống, đặc biệt tìm kiếm hóa chất, hóa dược, hoặc thực nghiệm các loại vacxin thế hệ mới Đã có nhiều hệ

gen ty thể của các loại KST như giun đũa (Ascaris suum), giun chỉ (Onchocerca volvulus), sán máng (Schistosoma mansoni, S japonicum, S

mekongi, S haematobium), sán dây (Taenia solium, T saginata , T

asiatica, T crasiceps ), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F gigantica),

sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), sán lá ruột (Fasciolopsis buski) đã được giải mã và phân tích cung cấp nguồn dữ

liệu cần thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký sinh trùng

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ SÁN LÁ GAN

NHỎ O VIVERRINI Ở VIỆT NAM

Hiện nay đã xác định ít nhất có 8 tỉnh lưu hành Opisthorchis

viverrini đó là các tỉnh, như Phú Yên, Bình Định, Đak Lak, Đà Nẵng,

Quảng Nam, Khánh Hoà và Thừa Thiên Huế

Sán lá gan nhỏ O viverrini lần đầu tiên được giám định phân tử bằng

chỉ thị di truyền hệ gen ty thể vào năm 2003, trên các mẫu sán được thu thập trên người tại Phú Yên, đến năm 2006, kỹ thuật PCR đa năng được

ứng dung để giám định và phân biệt 2 loài sán lá gan nhỏ O viverrini và

C sinensis ở Việt Nam

Hiện nay, trong Ngân hàng gen, theo công bố, chỉ có gen nad3, một

số gen ARN vận chuyển trnN, trnP, trnI và trnK hoàn chỉnh và một phần gen nad1 của O viverrini được giải trình trình tự Chưa có toàn bộ hệ gen

ty thể giải trình một cách hoàn chỉnh nào của O viverrini được đăng ký

vào Ngân hàng gen Như vậy, vấn đề đặt ra là cần có dữ liệu sinh học phân

tử hệ gen ty thể cũng như của hệ gen nhân của sán lá gan nhỏ của Việt Nam nhằm đáp ứng nhu cầu chẩn đoán giám định và nghiên cứu bệnh học

1.4 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN TY THỂ

CỦA LOÀI SÁN LÁ GAN NHỎ O VIVERRINI

Việc sử dụng phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể là ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và phân loại bệnh sán lá gan nhỏ nói riêng và bệnh ký sinh trùng nói chung có một ý nghĩa hết sức to lớn Nhờ phương pháp này mà người ta có thể chẩn đoán từ rất sớm, rất chính xác tác nhân gây bệnh Điều này giúp cho các nhà điều trị học lựa chọn phương pháp điều trị hiệu quả ít tốn kém nhất, góp phần ngăn chặn các hậu quả xấu do bệnh gây ra

Việc xác định các cấu trúc một gen hay nhiều gen đặc trưng của sán

lá gan nhỏ còn giúp cho các nhà sinh học xác định được sản phẩm cụ thể của gen đó Đây sẽ là cơ sở cho việc sản xuất các kháng nguyên đặc hiệu,

sử dụng cho phương pháp chẩn đoán bằng miễn dịch học

Nguồn thông tin thu được sẽ giúp cho việc xác định phân bố phân tử của chúng cũng như giúp cho các nghiên cứu về phòng chống và điều trị

có hiệu quả bệnh này ở Việt Nam và thế giới

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu là mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành có kích thước 1,2 x 0,1 cm, màu vàng nhạt, được xác định là O viverrini về mặt

hình thái học Mẫu sán được thu thập từ bệnh nhân tại các địa điểm sau:

- Xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên Ký hiệu (OvPY3)

- Xã Mỹ Thọ, huyện Phù Mỹ, tỉnh Bình Định Ký hiệu (OvBD1)

- Xã Tam Xuân 1, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam Ký hiệu (OvQN) Đây là những nơi được xác định là vùng lưu hành bệnh sán lá gan nhỏ

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thu nhận được các chuỗi ADN hệ gen ty thể của các phân lập O

viverrini, phương pháp PCR được sử dụng kết hợp, bao gồm PCR thông thường và PCR cực đại (long PCR) Các sản phẩm PCR được dòng hóa,

giải trình trình tự và phân tích theo quy trình tổng quát như sau:

2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu vật: sử dụng bộ

sinh phẩm QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA)

2.2.2 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR: phản ứng PCR cực

đại được thực hiện trên máy MJ Thermal Cycler PCT-100 (MJ Research, USA), sử dụng bộ hóa chất Elongase kit của hãng Invitrogen theo chu trình nhiệt như sau: 94oC/5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ ở 94oC/30 giây,

54oC/1 phút; 68oC/12 phút Phản ứng PCR thông thường được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: 94oC/5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ ở 94oC/30 giây, 52oC/30 giây; 72oC/2 phút và chu kỳ cuối cùng là 72oC/10 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm gel bằng Ethidium Bromide 10 phút và sau đó quan sát sản phẩm trên máy soi gel Wealtech (Mỹ)

2.2.3 Phương pháp tách dòng và giải trình trình tự: sản phẩm

PCR tinh sạch được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (TA-cloning Kit ) của hãng Invitrogen Các đoạn ADN trong plasmid tái tổ hợp được giải trình trình tự trên máy ABI3100 Avant Genetic Analyzer

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu: các chuỗi nucleotide được xử lý

bằng chương trình SeqEdv1.03, sau đó so sánh sử dụng chương trình AsemblyLIGNv1.9c và MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh; các chương trình GENEDOC2.5, MEGA3.1 trên máy tính PC, được sử dụng để phân tích, so sánh về thành phần nucleotide và amino

acid cũng như phân tích mối quan hệ phả hệ

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ THU NHẬN VÙNG GEN TY THỂ DÀI 4,2 KB

CỦA CÁC PHÂN LẬP SÁN LÁ GAN NHỎ O VIVERRINI

Phản ứng PCR thông thường và PCR cực đại (long PCR) được sử dụng kết hợp để thu nhận vùng gen ty thể có kích thước 4,2 kb của các

phân lập O viverrini của Việt Nam (OvQN, OvBD1, OvPY3) và của Thái

Lan (OvKK) theo sơ đồ tổng quát giới thiệu ở Hình 3.1

Hình 3.1 : Sơ đồ tổng quát thu nhận vùng gen dài 4,2 kb của các phân lập OvQN, OvBD1, OvPY3 của.Việt Nam và OvKK của Thái Lan

Các chuỗi gen của các phân lập OvQN, OvBD1, OVPY3 và OvKK sau khi giải trình trình tự được đưa vào phân tích sử dụng các chương trình SeqEd1.03 AsemblyLIGNv1.9c và MacVector8.2 (Accelrys Inc.) để thu nhận toàn bộ trình tự vùng ADN ty thể có độ dài 4,2 kb

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VÙNG GEN TY THỂ DÀI 4,2 KB CỦA

CÁC PHÂN LẬP O VIVERRINI CỦA VIỆT NAM VÀ THÁI LAN

3.2.1 Phân tích sự biến đổi về thành phần nucleotide giữa các

phân lập O viverrini của Việt Nam và Thái Lan trong vùng gen ty thể

dài 4,2 kb

Kết quả cho thấy, vùng ADN giới hạn giữa cặp mồi Ov8F-OvR có độ

dài 4.252 bp ở cả 3 phân lập O viverrini là OvQN, OvPY3 và OvKK

OvQN OvBD1 OvPY3

OvQN OvBD1 OvPY3

OvQN OvBD1 OvPY3

OvQN OvBD1 OvPY3

OvQN OvBD1 OvPY3

Riêng đối với phân lập OvBD1, độ dài là 4253 nucleotide, do phân lập OvBD1 có đột biến thêm vào một nucleotde (T) tại vị trí 816 so với 3 phân lập còn lại, tuy nhiên sự đột biến này xảy ra ở vùng giao gen nên cũng không gây nên sự thay đổi nào về acid amin Đăng ký Ngân hàng gen: OvBD1 (số: EU443831), OvQN (số: EU443832), OvPY3 (số: EU443833)

Có tất cả 58 vị trí sai khác giữa các phân lập O viverrini với nhau,

chiếm tỷ lệ 1,36% (Bảng 3.1A-B-C-D) Đây là tỷ lệ sai khác cho phép giữa các phân lập trong cùng một loài Trong số 58 đột biến, có 9/58 là đột biến

dị hoán (tranversion), chiếm tỷ lệ 15,5%; và 48/58 nucleotide là đột biến đồng hoán (transition), chiếm tỷ lệ 84,5%

3.2.2 Phân tích trật tự các gen trong vùng ADN ty thể dài 4,2 kb

Kết quả cho thấy có 5 gen mã hóa protein đó là các gen nad4, atp6,

nad2, nad1 và nad3; và 10 gen mã hóa cho ARN vận chuyển các amino

acid là trnQ (glutamine), trnF (phenylalanine), trnM (methionine), trnV (valine), trnA (alanine), trnD (aspartate), trnN (asparagine), trnP (proline),

trnI (isoleucine) và trnK (lysine)

Trật tự các gen được sắp xếp như trình bày ở Bảng 3.2

3.2.3 Kết quả phân tích các gen mã hóa protein nằm trong vùng gen ty thể 4,2 kb

a) Kết quả phân tích thành phần nucleotide và amino acid đoạn gen

nad4 của các phân lập O viverrini

Bảng 3.3: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và

amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O viverrini với nhau (một phần gen nad4 dài 807 nucleotide)

99 99

99

OvPY3

99 99

99

OvBD1

99 98

99

OvQN

99 99

99

OvKK

OvPY3 OvBD1

OvQN OvKK

99 99

99

OvPY3

99 99

99

OvBD1

99 98

99

OvQN

99 99

99

OvKK

OvPY3 OvBD1

OvQN OvKK

Bảng 3.1 (A,B,C,D): Bảng phân tích các vị trí có sai khác về nucleotide trong vùng gen ty thể 4,2 kb giữa

các phân lập O viverrini của Việt Nam so với phân lập OvKK của Thái Lan, lần lượt theo trật tự các gen

Ghi chú: Dấu (*) là vùng giao gen

nad2 atp6

trnM

T C

C T

C T

T G

G C

C C

A T

OvPY3

C T

C T

T T

T G

G T

T T

G T

OvBD1

T C

T T

C C

T G

G C

T C

A C

OvQN

T C

C G

C T

C T

C C

T T

A T

OvKK

1678 1616

1587 1439

1407 1354

1258 1247

1246 1242

1207 1141

1069 1019

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

nad2 atp6

trnM

T C

C T

C T

T G

G C

C C

A T

OvPY3

C T

C T

T T

T G

G T

T T

G T

OvBD1

T C

T T

C C

T G

G C

T C

A C

OvQN

T C

C G

C T

C T

C C

T T

A T

OvKK

1678 1616

1587 1439

1407 1354

1258 1247

1246 1242

1207 1141

1069 1019

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

A

-C T

T T

G C

T T

T T

OvPY3

G T

T G

T C

C T

A T

C T

A C

OvBD1

G C

G

-C T

T A

G C

T C

A T

OvQN

C C

G

-C T

T T

G C

T T

A T

OvKK

946 942

816 808

769 729

726 696

516 490

234 209

34 25

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

trnF

*

nad4

G C

A

-C T

T T

G C

T T

T T

OvPY3

G T

T G

T C

C T

A T

C T

A C

OvBD1

G C

G

-C T

T A

G C

T C

A T

OvQN

C C

G

-C T

T T

G C

T T

A T

OvKK

946 942

816 808

769 729

726 696

516 490

234 209

34 25

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

*

trnA nad2

T C

T T

C A

A C

C T

A T

C G

C OvPY3

C G

T C

T G

A T

T T

G T

T G

T OvBD1

T G

T T

C A

C C

T T

A C

C A

T OvQN

C G

G T

T A

A C

T C

A C

C G

C OvKK

3345 3298

3023 3002

2952 2881

2603 2533

2340 2122

2055 2047

1934 1902

T C

T T

C A

A C

C T

A T

C G

C OvPY3

C G

T C

T G

A T

T T

G T

T G

T OvBD1

T G

T T

C A

C C

T T

A C

C A

T OvQN

C G

G T

T A

A C

T C

A C

C G

C OvKK

3345 3298

3023 3002

2952 2881

2603 2533

2340 2122

2055 2047

1934 1902

1695

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

nad3 trnK

*

nad1

T G

G C

C C

A G

C A

T T

T C

T

OvPY3

C A

A C

C T

G A

T G

C T

C T

T

OvBD1

C G

G T

T T

A G

C G

T C

C C

C

OvQN

C G

G C

C T

A G

T G

T T

C C

T

OvKK

4169 4145

4083 4070

4016 4004

3995 3927

3908 3807

3723 3545

3519 3454

3381

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

nad3 trnK

*

nad1

T G

G C

C C

A G

C A

T T

T C

T

OvPY3

C A

A C

C T

G A

T G

C T

C T

T

OvBD1

C G

G T

T T

A G

C G

T C

C C

C

OvQN

C G

G C

C T

A G

T G

T T

C C

T

OvKK

4169 4145

4083 4070

4016 4004

3995 3927

3908 3807

3723 3545

3519 3454

3381

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

(D) (C)

Bảng 3.2: Vị trí các gen mã hoá protein và các trình tự nối các gen (vùng

giao gen) trong vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các phân lập O viverrini

Bảng 3.4: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa

các phân lập O viverrini (một phần gen nad4 dài 807 nucleotide)

Kết quả phân tích thành phần nucleotide và amino acid của đoạn gen

nad4 của các phân lập O viverrini của Việt Nam và Thái Lan, cho thấy

mức độ tương đồng (%) là rất cao, 98-99% (nucleotide) và 99% (aminino acid) (Bảng 3.3) Có 10 vị trí có sự sai khác về nucleotide, dẫn đến thay đổi

3 amino acid ở các vị trí 9, 12 và 70 (Bảng 3.4)

b) Kết quả phân tích thành phần gen atp6 ở các phân lập O viverrini

Bảng 3.5: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và

amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O viverrini với nhau (gen

atp6)

V C

S OvPY3

V S

P OvBD1

A S

S OvQN

V S

S OvKK

70 12

9

Vị trí có sai khác amino acid Chủng

V C

S OvPY3

V S

P OvBD1

A S

S OvQN

V S

S OvKK

70 12

9

Vị trí có sai khác amino acid Chủng

C T T T G C T T T T OvPY3

T C C T A T C T A C OvBD1

C T T A G C T C A T OvQN

C T T T G C T T A T OvKK

769 729 726 696 516 490 234 209 34 25

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

C T T T G C T T T T OvPY3

T C C T A T C T A C OvBD1

C T T A G C T C A T OvQN

C T T T G C T T A T OvKK

769 729 726 696 516 490 234 209 34 25

Các vị trí có thay đổi nucleotide Chủng

99 99

99

OvPY3

99 99

99

OvBD1

99 98

99

OvQN

99 99

99

OvKK

OvPY3 OvBD1

OvQN OvKK

99 99

99

OvPY3

99 99

99

OvBD1

99 98

99

OvQN

99 99

99

OvKK

OvPY3 OvBD1

OvQN OvKK