KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID

Để định tính alkaloid trong dịch chiết dược liệu, các thuốc thử chung, thuốc thử tạo màu và sắc ký lớp mỏng là những phương pháp thường dùng.. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA

ALKALOID

I CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG

Các alkaloid (alcaloid) là những base hữu cơ thường dễ tan trong các dung môi hữu cơ (như ether, benzen, cloroform, aceton, methanol, và ethanol…)

Đa số các alkaloid base thực tế không tan trong nước

Một vài alkloid không có oxy tồn tại dưới trạng thái lỏng có thể tan ít trong nước

Một số alkaloid dạng lỏng có thể bay hơi và lôi cuốn được theo hơi nước

Một số alkaloid không có oxy ở dạng rắn có thể thăng hoa được ở áp suất thường

Một số alkaloid có –OH phenol có thể tan một phần trong dung dịch kiềm mạnh

Dưới dạng muối, các alkaloid thường tan được trong nước, cồn (ethanol, methanol) hay hỗn hợp cồn nước; chúng không tan hoặc rất kém tan trong các dung môi hữu cơ kém phân cực (ether, benzen, chloroform…)

II TÍNH CHẤT CHUNG CỦA ALKALOID

Alkaloid thường là những base yếu, tan trong các dung môi hữu cơ, không tan trong nước Khi cho alkaloid tác dụng với acid sẽ thu được alkaloid dạng muối

Các muối của alkaloid thường dễ tan trong nước Các muối này dễ bị các chất kiềm vô cơ (NH4OH, NaOH) thậm chí cả cá muối khác (Na2CO3, đôi khi cả NaHCO3) đẩy ra khỏi muối cho lại alkaloid ban đầu

Alkaloid phản ứng với các thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo thành các muối khó tan

(dạng kết tinh hay vô định hình) được ứng dụng trong định tính alkaloid

Một số alkaloid hay nhóm alkaloid có thể cho màu sắc đặc trưng với một số thuốc thử được

gọi là thuốc thử đặc hiệu của alkaloid (thuốc thử tạo màu) ứng dụng trong định tính hoặc

làm thuốc thử phát hiện trong sắc ký

III KIỂM ĐỊNH CÁC ALKALOID

Trong kiểm định các dược liệu chứa alkaloid, ngoài các chỉ tiêu kiểm định chung cho mọi dược liệu, người ta phải tiến hành định tính và định lượng các alkaloid trong dược liệu đó

Có thể định tính alkaloid trực tiếp trong các mô thực vật hay trên dịch chiết dược liệu Để định tính alkaloid trong vi phẫu thực vật, người ta quan sát tủa của alkaloid với thuốc thử Bouchardat dưới kính hiển vi

Đôi khi có thể định tính trực tiếp alkaloid trên mặt cắt dược liệu bằng thuốc thử đặc hiệu

Để định tính alkaloid trong dịch chiết dược liệu, các thuốc thử chung, thuốc thử tạo màu

và sắc ký lớp mỏng là những phương pháp thường dùng

Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid trong dược liệu như phương pháp cân, phương pháp thể tích, phương pháp quang phổ Tùy trường hợp mà lựa chọn phương pháp thích hợp Cũng có thể kết hợp các phương pháp phân tách (thường là các phương pháp sắc ký) với việc định lượng (thường là các phương pháp quang phổ) để định lượng riêng một hay một vài alkaloid nào đó trong hỗn hợp alkaloid toàn phần

Kết quả có thể được biểu thị bằng:

- % của alkaloid toàn phần có trong dược liệu (phương pháp cân trực tiếp)

- % cuả alkaloid toàn phần có trong dược liệu quy theo một alkaloid chính (phương pháp cân gián tiếp, phương pháp chuẩn độ acid-base, phương pháp quang phổ)

- % của một alkaloid nào đó có trong dược liệu (phương pháp kết hợp sắc ký- quang phổ)

IV CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID

Trong cây, alkaloid thường tồn tại dưới dạng muối hòa tan với acid hữu cơ hoặc vô cơ hay dạng kết hợp với tanin Người ta có thể chiết alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật bằng nhiều cách nhưng nhìn chung có thể quy về 2 cách chính là:

- Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng alkaloid base bằng dung môi hữu cơ

- Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng muối bằng dung môi phân cực (nước, cồn, hỗn hợp cồn nước đã được acid hóa)

Với một vài alkaloid đặc biệt, người ta có thể chiết xuất bằng cách:

- Phương pháp cất kéo lôi cuốn theo hơi nước (chiết xuất nicotin từ Thuốc lá)

- Phương pháp thăng hoa (chiết cafein từ Trà)

Dựa vào tính tan khác nhau của dạng base và dạng muối alkaloid trong các dung môi, người

ta có thể loại phần nào các tạp chất ra khỏi dịch chiết trước khi định tính, định lượng hay phân lập các alkaloid tinh khiết

Các quy trình chiết dưới đây thường được sử dụng trong chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid

Ghi chú: thể tích dung môi chiết, thời gian chiết trong các phương pháp trên có thể thay đổi tùy

thuộc vào dược liệu và phương tiện sử dụng

1 Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm (Phương pháp 1)

Bột dược liệu (5g)

(đun nóng nhẹ/BM 10 phút, lọc hoặc chiết bằng Sohxlet)

Dịch chiết CHCl3

H 2 SO 4 2% (5ml x 2 lần)

Dịch chiết nước acid Định tính bằng thuốc thử chung

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Dịch chiết CHCl3

Chiết bằng CHCl 3 (10ml x 2-3 lần)

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Định tính bằng phương pháp sắc ký

Bốc hơi tới cắn khô

Cắn alkaloid base

2 Chiết bằng nước acid (Phương pháp 2)

Bột dược liệu (5g)

Làm ẩm bột dược liệu 10 phút

20ml dung dịch H 2 SO 4 2%

Đun BM 15 phút, lọc (2 lần x 20ml)

Dịch chiết nước acid

CHCl 3 10ml x 2 lần

Dịch chiết CHCl3 Định tính bằng phương pháp sắc ký

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Dịch chiết nước acid

H 2 SO 4 2% (5ml x 2 lần)

Định tính bằng thuốc thử chung Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

3 Chiết bằng cồn acid (Phương pháp 3)

Bột dược liệu (5g)

Làm ẩm bột dược liệu 10 phút

20-30ml cồn có 5% acid (sulfuric, hydrochlorid, acetic)

Đun hồi lưu/BM 10 phút, lọc

Dịch chiết cồn acid

- Trung hòa đến pH 5-6 (nếu cần)

- Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn

- Hòa tan cắn trong nước nóng (10mlx 2

lần), lọc

Dịch chiết nước acid Định tính bằng thuốc thử chung

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Dịch chiết CHCl3

Chiết bằng CHCl 3 (10ml x 2-3 lần)

Định tính bằng thuốc thử chung

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Định tính bằng phương pháp sắc ký

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Chiết với H 2 SO 4 2% (5ml x 2 lần)

Dịch chiết nước acid

BÀI 1 ĐỊNH TÍNH ALKALOID TRONG DƯỢC LIỆU

BẰNG PHẢN ỨNG HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

Mục tiêu

Sau khi thực hành, sinh viên phải:

- Chiết được alkaloid ra khỏi dược liệu bằng các phương pháp thích hợp

- Xác định được alkaloid trong dịch chiết dược liệu bằng các thuốc thử chung

- Phát hiện được alkaloid trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

I CƠ SỞ LÝ THUYẾT

1 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung

Để phát hiện alkaloid trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học, thông thường người ta chiết alkaloid ra khỏi cơ quan thực vật bằng phương pháp chiết thích hợp rồi dùng các thuốc thử để phát hiện và đánh giá sơ bộ sự có mặt của chúng trong dược liệu Tùy theo phản ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp Các phản ứng với thuốc thử chung thường được thực hiện với muối alkaloid trong môi trường nước acid

Các thuốc thử chung cho với các alkaloid một tủa vô định hình có màu sắc không đặc trưng thay đồi tùy theo thuốc thử Với một số thuốc thử, tủa này có thể tan lại tỏng một lượng thuốc thử thừa

Trong những điều kiện quy định về lượng dược liệu, lượng dung môi, cách chiết và thuốc thử sử dụng có thể dựa vào mức độ tạo tủa, lượng thuốc thử sử dụng để đánh giá sơ bộ hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu

Các thuốc thử thường dùng là Bouchardat,Valse-Mayer, Dragendroff, Bertrand, Hager và acid tanic

2 Định tính alkaloid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)

SKLM được sử dụng như một phương pháp phát hiện sự có mặt, đồng thời đánh giá sơ bộ thành phần alkaloid của dược liệu khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp Tiến hành sắc

ký song song với 1 alkaloid chuẩn còn cho phép nhận định sự có mặt của một alkaloid nào

đó trong dược liệu SKLM còn hữu dụng trong việc xác định 1 dược liệu khi sắc ký so sánh với dược liệu chuẩn

Pha tĩnh: trong định tính alkaloid bằng SKLM thường dùng silicagel G, F254

Dung môi khai triển

Dung môi khai triển cho sắc ký alkaloid thường là hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi hữu cơ; thường từ phân cực yếu tới phân cực trung bình (như hexan, benzen, ether ethylic, cloroform, dicloromethan, ethyl acetat) Có thể sử dụng thêm các dung môi hữu cơ có tính kiềm (pyridin, dimethyl formamid, diethylamin, triethylamin) hoặc một lượng nhỏ các kiềm vô cơ (thường là amoniac đặc) bằng cách pha thẳng vào hệ dung môi hay bằng cách để bão hòa khí quyển trong bình sắc ký

Đôi khi, các dung môi phân cực mạnh hơn như butanol, ethanol, methanol, nước, các acid như acid acetic, acid formic cũng được dùng đối với alkaloid phân cực mạnh

Mẫu thử

Mẫu thử thường là alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base toàn phần, được hòa tan trong các dung môi ít phân cực và dễ bay hơi như cloroform, ether…

Các dung dịch alkaloid muối (pha trong EtOH, MeOH) cũng có thể được sử dụng khi dung môi khai triển là các hệ dung môi phân cực mạnh, thường có thêm acid

Phát hiện vết

Để phát hiện vết alkaloid trên bản sắc ký người ta thường phun (hoặc nhúng) với thuốc thử Dragendroff Các alkaloid sẽ cho các vết màu đỏ cam trên nền màu trắng

Các cách phát hiện thông thường như soi đèn UV (254nm và 365nm) hoặc hơ trong hơi iod cũng được dùng như là phương pháp bổ sung nhưng không đặc hiệu

Ghi nhận kết quả

Ghi nhận số lượng các vết quan sát được trên sắc đồ về màu sắc với các phương pháp phát hiện Rf và tỉ lệ tương đối của các vết alkaloid trong hỗn hợp

Rf của 1 chất A được định nghĩa là tỷ số giữa đoạn đường di chuyển của chất A (l A) và

đoạn đường di chuyển của dung môi (l O) tính từ mức xuất phát của mẫu thử

Trị số Rf luôn < 1,00 và luôn có đúng hai số lẻ (ví dụ 0,08; 0,72…)

Trong những điều kiện sắc ký nhất định, giá trị Rf của 1 chất là một trong những đặc trưng của chất đó trong hệ dung môi đã sử dụng Tuy nhiên, do giá trị Rf phụ thuộc vào khá nhiều yếu tố (bản chất, bề dày và độ hoạt hóa của pha tĩnh, pha động, mức độ bão hòa dung môi, độ ẩm và nhiệt độ của môi trường…) nên người ta còn sử dụng giá trị Rx ổn định hơn

để biểu thị đặc trưng của chất ấy

Rx của một chất A so với chất quy chiếu X được định nghĩa là tỷ số giữa đoạn đường di

chuyển của hóa chất A (l A ) và đoạn đường di chuyển của chất quy chiếu X (l X) trong cùng

1 điều kiện (cùng 1 bản sắc ký)

Khác với Rf, trị số RX có thể > 1,00 và cũng chỉ lấy 2 số lẻ

Chất quy chiếu thường được dùng trong sắc ký alkaloid là quinin, khi đó Rf của một alkaloid so với quinin được ghi là RQ

II THỰC HÀNH

1 Dược liệu

- Bình vôi

- Lá sen

- Tâm sen

2 Chiết xuất alkaloid

Chiết 3 dược liệu thuộc 3 phương pháp dưới đây để thực hiện phản ứng định tính bằng các thuốc thử chung

- Bình vôi: chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ (phương pháp 1) Lấy dịch chiết nước acid

để định tính với thuốc thử chung của alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM

- Lá sen: chiết bằng nước acid (phương pháp 2) Lấy dịch chiết nước acid lần 2 (sau giai đoạn cloroform) để định tính với thuốc thử chung của alkaloid, dịch CHCl3 dùng để SKLM

- Tâm sen: chiết bằng cồn acid (phương pháp 3) Lấy dịch chiết nước acid (trong thực tập, lấy dịch chiết nước acid ở giai đoạn đầu tiên) để định tính với thuốc thử chung của alkaloid,

dịch CHCl3 dùng để SKLM

Ghi chú: các phương pháp chiết, lượng dung môi hóa chất dùng để làm ẩm, để chiết cho từng dược

liệu có thể thay đổi tùy thuộc vào loại dược liệu và điều kiện thực tế

3 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung

Lấy 5 ống nghiệm nhỏ, cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dịch chiết nước acid

Cho riêng rẽ vào mỗi ống nghiệm 3 giọt thuốc thử lần lượt là Bouchardat, Valse-Mayer, Dragendroff và Hager, một ống giữ làm ống chứng Lắc đều, quan sát và nhận định kết quả Nếu cần có thể cho thêm 1-2 giọt thuốc thử nữa

(-) Dung dịch vẫn trong

(+) Dung dịch đục mờ nhưng không lắng xuống

(++) Dung dịch đục, có tủa lắng xuống sau vài phút

(+++) Có tủa lắng xuống ngay Dung dịch đục sau khi thêm giọt thuốc thử thứ 2

(++++) Có tủa nhiều

4 Định tính alkaloid bằng phương pháp SKLM

Chuẩn bị bản mỏng

Có hai loại: bản mỏng tự tráng và bản mỏng tráng sẵn Hiện nay, bản mỏng tráng sẵn được

sử dụng phổ biến

Với bản mỏng tráng sẵn, dùng bàn cắt hoặc kéo cắt thành những miếng có kích thước thích hợp (2,5 x 10cm), không cần sấy hoạt hóa

Chuẩn bị dung môi và bình sắc ký

Bình sắc ký được rửa sạch và sấy nhẹ đến khô Lót lòng trong bình bằng giấy lọc

Nhỏ lên trên miếng giấy lọc này 3-4 giọt NH4OH đậm đặc rồi lót dung môi sắc ký vào bình (lớp dung môi này cao khoảng 0,5cm)

Đậy nắp kín (nếu cần, có thể thoa 1 ít vaseline trên miệng bình), đặt ở nơi phẳng, để yên trong ít nhất 30 phút trước khi triển khai

Các hệ dung môi sử dụng

S1 = benzen : aceton (1:4)

S2 = CHCl3 : MeOH : NH4OH (50:9:1)

Đưa mẫu lên bản mỏng, triển khai và phát hiện

Dùng mao quản chấm lên mỗi bản sắc ký 2 vết, tuần tự từ trái sang phải là 2 dung dịch alkaloid base toàn phần trong cloroform của Bình vôi và Tâm sen

Các vết chấm này phải nhỏ, gọn (nên chấm thành vạch 1mm x 3mm), thẳng hàng và cách đều nhau, vết nọ cách vết kia ≥ 0,5cm;cách 2 mép bên ≥ 0,5cm và cách mép dưới khoảng 1,5cm Tùy theo nồng độ dịch thử mà chấm với số lần thích hợp, sao cho sau khi triển khai và phun thuốc thử các vết không quá mờ, khó phát hiện và cũng không quá đậm, làm các vết to, chồng lấn lên nhau

Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, đậy kín nắp và để yên (các vết chấm phải nằm cao hơn lớp dung môi) Khi dung môi chạy còn cách mép trên khoảng 0,5cm, lấy bản mỏng ra, dùng bút chì đánh dấu mức dung môi, để khô tự nhiên hay sấy nhẹ cho hết dung môi

Phát hiện các vết trên sắc đồ lần lượt bằng cách:

- Soi dưới đèn UV 254nm và 365nm

- Phun (hoặc nhúng nhanh) thuốc thử Dragendroff (trong tủ hốt!)

Vẽ sắc ký đồ khi phát hiện bằng UV 245nm và thuốc thử Dragendroff

Ghi nhận lại màu sắc của các vết trong UV 365nm và sau khi phun thuốc thử Dragendroff Tính Rf của các vết màu với thuốc thử Dragendroff Ghi nhận xét