Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu nần nghệ

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một đất nước có nền Y học cổ truyền từ lâu đời cùng với nguồn tài nguyên cây thuốc vô cùng phong phú. Trong thời kì hiện đại cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật với rất nhiều thành tựu mới trong các lĩnh vực hóa dược đã có nhiều thuốc tân dược được tổng hợp và đưa vào sử dụng. Tuy nhiên, tận dụng lợi thế về nguồn tài nguyên cây thuốc của mình, Việt Nam luôn chủ trương “Dược liệu là nền tảng của ngành Dược”. Trên thực tế, qua các thời kì, dược liệu vẫn luôn khẳng định được vai trò của nó trong nền Y học nước nhà. Nhưng đi kèm với sự phát triển của thị trường dược liệu lại là tình trạng giả mạo, nhầm lẫn dược liệu. Để đảm bảo lợi ích cho người sử dụng đồng thời hạn chế khó khăn cho các nhà quản lí cần phải xây dựng được tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho các dược liệu được sử dụng. Nần nghệ (Dioscorea collettii Hook. f.) là một dược liệu gần đây đang được quan tâm sử dụng rất nhiều bởi công dụng của nó. Tại Việt Nam, Nần nghệ được đánh giá là nguồn nguyên liệu triển vọng để chiết xuất diosgenin 10một nguyên liệu quan trọng để tổng hợp ra các chế phẩm steroid 20. Ngoài ra saponin toàn phần từ dịch chiết Nần nghệ còn có rất nhiều tác dụng khác như làm hạ lipid máu, hạ huyết áp, chống viêm…13, 14. Vài năm trở lại đây trên thị trường đã có nhiều chế phẩm có nguồn gốc từ Nần nghệ như Diosgin, Nần Vàng Tiên Thảo… Tuy nhiên lại chưa có một tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu này. Các nghiên cứu trước đây về Nần nghệ chủ yếu tập trung vào phương pháp chiết xuất, xác định độc tính, tác dụng dược lí của dược liệu mà chưa xây dựng được một tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu. Vì vậy, đề tài “XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NẦN NGHỆ” được thực hiện nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm soát tốt chất lượng của dược liệu này. Đề tài được thực hiện với mục tiêu : Khảo sát xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu Nần nghệ tiến tới đưa dược liệu này vào trong Dược điển Việt Nam V. Để thực hiện mục tiêu trên đề tài gồm các nội dung như sau : 1. Mô tả dược liệu

NGÔ THỊ THANH THẢO

XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

NẦN NGHỆ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

NGÔ THỊ THANH THẢO

XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

1 Bộ môn Dược liệu

2 Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn

Viện Dược liệu

HÀ NỘI – 2014

Tuấn, Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội là người đã trực tiếp hướng

dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

Các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược liệu, các cán bộ khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ để

em có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Các thầy cô trong ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, 13 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Ngô Thị Thanh Thảo

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tên gọi 3

1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.3 Phân bố 4

1.4 Sinh thái 4

1.5 Thu hái 4

1.6 Thành phần hóa học 5

1.7 Tác dụng sinh học 8

1.7.1 Tác dụng hạ huyết áp: 8

1.7.2 Tác dụng hạ Cholesterol 9

1.7.3 Tác dụng chống viêm 9

1.7.4 Tác dụng gây giãn cơ trơn 10

1.7.5 Ảnh hưởng đến hoạt động của tim tại chỗ 10

1.7.6 Tác dụng chống ung thư 10

1.7.7 Tác dụng kháng nấm 12

1.8 Công dụng: 14

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Xác định tên khoa học 15

2.1.3 Hóa chất và dụng cụ 16

2.3.1 Cảm quan 17

2.3.2 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi 17

2.3.3 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học 17

2.3.4 Độ ẩm 18

2.3.5 Tro toàn phần 18

2.3.6 Xử lý số liệu 18

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19

3.1 Khảo sát xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu Nần nghệ 19

3.1.1 Mô tả dược liệu 19

3.1.2 Vi phẫu 19

3.1.3 Soi bột 22

3.1.4 Định tính 24

3.1.5 Định lượng 28

3.1.6 Sắc ký lớp mỏng 31

3.1.7 Độ ẩm 33

3.1.8 Tro toàn phần 33

3.1.9 Xác định các chất chiết được bằng ethanol 34

3.2 Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Nần nghệ 35

BÀN LUẬN 40

KẾT LUẬN 42

ĐỀ XUẤT 42

STT Số thứ tự TLTK Tài liệu tham khảo

LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp HDL Lipoprotein tỉ trọng cao HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao SKLM Sắc ký lớp mỏng

CSB Chỉ số bọt

CSPH Chỉ số phá huyết

dl dược liệu MeOH Methanol Stb Diện tích pic trung bình

TB Trung bình

Rf Hệ số lưu

1.1 Các sapogenin trong thân rễ Nần nghệ 6 1.2 Các hợp chất saponin thu được từ dịch chiết ethanol của Nần

nghệ

7

1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất 1-14 chống lại P oryzae và

tế bào ung thư dòng K562 so sánh với Rhizoxin

13

3.1 Kết quả chỉ số bọt của dược liệu Nần nghệ 25 3.2 Các hỗn hợp để thử sơ bộ, xác định chỉ số phá huyết 26

3.3 Tiến hành xác định chỉ số phá huyết 27 3.4 Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân 30 3.5 Kết quả định lượng mẫu Nần nghệ 31 3.6 Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu 33 3.7 Kết quả xác định tro toàn phần của dược liệu 34 3.8 Kết quả xác định lượng chất chiết được bằng ethanol của dược

liệu

35

2.1 Cây Nần nghệ 15 2.2 Thân rễ Nần nghệ 15 2.3 Thân rễ Nần nghệ thái lát 15 3.1 Ảnh vi phẫu thân rễ Nần nghệ dưới kính hiển vi 21 3.2 Ảnh vi phẫu thân rễ Nần nghệ (bó libe-gỗ) dưới kính hiển vi 22 3.3 Ảnh chụp một số đặc điểm bột thân rễ Nần nghệ dưới kính hiển vi 23 3.4 Đường chuẩn của Diosgenin 30 3.5 Ảnh chụp sắc ký lớp mỏng dịch chiết toàn phần thân rễ Nần nghệ

và Diosgenin đối chiếu

32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một đất nước có nền Y học cổ truyền từ lâu đời cùng với nguồn tài nguyên cây thuốc vô cùng phong phú Trong thời kì hiện đại cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật với rất nhiều thành tựu mới trong các lĩnh vực hóa dược đã

có nhiều thuốc tân dược được tổng hợp và đưa vào sử dụng Tuy nhiên, tận dụng lợi thế về nguồn tài nguyên cây thuốc của mình, Việt Nam luôn chủ trương “Dược liệu

là nền tảng của ngành Dược” Trên thực tế, qua các thời kì, dược liệu vẫn luôn khẳng định được vai trò của nó trong nền Y học nước nhà Nhưng đi kèm với sự phát triển của thị trường dược liệu lại là tình trạng giả mạo, nhầm lẫn dược liệu Để đảm bảo lợi ích cho người sử dụng đồng thời hạn chế khó khăn cho các nhà quản lí cần phải xây dựng được tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho các dược liệu được sử dụng

Nần nghệ (Dioscorea collettii Hook f.) là một dược liệu gần đây đang được

quan tâm sử dụng rất nhiều bởi công dụng của nó Tại Việt Nam, Nần nghệ được đánh giá là nguồn nguyên liệu triển vọng để chiết xuất diosgenin [10]-một nguyên liệu quan trọng để tổng hợp ra các chế phẩm steroid [20] Ngoài ra saponin toàn phần từ dịch chiết Nần nghệ còn có rất nhiều tác dụng khác như làm hạ lipid máu,

hạ huyết áp, chống viêm…[13], [14] Vài năm trở lại đây trên thị trường đã có nhiều chế phẩm có nguồn gốc từ Nần nghệ như Diosgin, Nần Vàng Tiên Thảo… Tuy nhiên lại chưa có một tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu này Các nghiên cứu trước đây về Nần nghệ chủ yếu tập trung vào phương pháp chiết xuất, xác định độc tính, tác dụng dược lí của dược liệu mà chưa xây dựng được một tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu Vì vậy, đề tài “XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NẦN NGHỆ” được thực hiện nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm soát tốt chất lượng của dược liệu này Đề tài được thực hiện với mục tiêu : Khảo sát xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu Nần nghệ tiến tới đưa dược liệu này vào trong Dược điển Việt Nam V

Để thực hiện mục tiêu trên đề tài gồm các nội dung như sau :

1 Mô tả dược liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tên gọi

Tên khoa học của cây thuốc : Dioscorea collettii Hook f Họ củ nâu (Dioscoreaceae) [2], [7], [12]

Tên khoa học của vị thuốc: Rhizoma Dioscoreae [7]

Tên nước ngoài: 叉蕊薯蓣 cha rui shu yu (Trung Quốc) [31], izu-dokoro (Nhật Bản) [29]

Tên đồng nghĩa : Dioscorea collettii var collettii, Dioscorea collettii var hypoglauca (Palib.) S.J.Pei&C.T.Ting, Dioscorea collettii var hypoglauca

(Palib.) C.T.Ting & et al [30]

Tên khác: Nần nghệ, từ collett, râu hùm, nần vàng [7], [12]

1.2 Đặc điểm thực vật

Địa thực vật, thân vặn, quấn trái, không có lông, đôi khi có lông màu vàng, dày

và ngắn [28] Thân rễ mọc ngang, phân nhiều nhánh ngắn hình dạng giống gừng, chiều dài đa dạng, dày khoảng 2 cm; lõi màu vàng; rễ mảnh dạng sợi [28] Lá mọc đơn, so le [2], [7], [28], cuống lá dài từ 4-7cm [28], ở gốc cuống lá có hai gai nhỏ cong (lá kèm biến dạng), có phiến lá hình tim, mỏng, kích thước cỡ 6 -10 x 5 -9cm [2], [7], [12], mép nguyên hoặc lượn sóng, đỉnh nhọn [28]; mặt trên không có lông, mặt dưới có lông ở gân [2], [7], [12]; có 7 gân trong đó có 3 gân gốc vươn tới chóp

lá [2], [7], [12] Cụm hoa thành chùm hay bông ở nách lá, đơn tính [8] Các cụm hoa đực đơn độc hoặc 2 hay 3 cụm mọc cạnh nhau Hoa đực: mọc đơn hay thành cụm hoa xim gồm 2 hay 3 hoa, không cuống; lá bắc hình oval dẹt, lá bắc con hình trứng; bao hoa màu vàng, lúc khô thường màu đen, hình đĩa, nhị 3, gắn trong ống bao hoa, chỉ nhị ngắn, bao phấn hình trứng, thon dài khi hoa nở, hình chữ chi, các nhị lép có dạng sợi mảnh Cụm hoa cái dạng bông đơn độc, dài tới 5 cm Hoa cái:

có nhị lép, bầu hoa hình trụ thon [28] Quả nang quặt lại, có 3 cánh, 3 ô, mỗi ô chứa

2 hạt Hạt có cánh tròn [2]

Loài Dioscorea collettii Hook.f gồm hai thứ:

+D.collettii var collettii: Mép lá không trong suốt, bao phấn rộng bằng hoặc

gấp đôi khi hoa nở, quả nang hình trứng ngược, đỉnh cụt hay tròn

+D collettii var hypoglauca: Mép lá trong suốt, bao phấn hẹp lại khoảng một

nửa khi hhoa nở, quả nang hình bầu dục, đỉnh tròn [28]

1.3 Phân bố

Nần nghệ phân bố ở nam Trung Quốc, Ấn Độ, Mianma, bắc Việt Nam, Sơn La (Mộc Châu) [2], [7] Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” cây chỉ gặp trong rừng núi cao một số nơi thuộc bắc bộ, ở độ cao 1000-3200m [7] “Thực vật chí Trung Quốc” cho biết cây mọc ở rừng hỗn hợp, rừng sồi cấp hai, rừng rậm núi dốc, ở độ cao 200-3200m [28]

1.4 Sinh thái

Nần nghệ mọc tập trung ở những nơi có đất tơi xốp, pha lẫn nhiều đá sỏi hoặc

đá vôi, đặc biệt những nơi có nhiều ánh sáng như các sườn đồi cỏ tranh, các nương rẫy mới bỏ hoang thường có lửa cháy hàng năm Tại những nơi này Nần nghệ thường mọc thành từng đám một, mỗi đám rộng vài trăm mét vuông, thường tập trung nhiều nhất ở những nơi gần bìa rừng hoặc những nơi có lác đác một vài cây

to Dưới thung lũng, nhất là dọc các chân đồi cỏ tranh chúng tương đối phát triển, thường có thân rễ khá to Đặc biệt những cây mọc gần tảng đá vôi hoặc gần gốc cây

to có thể thấy thân rễ của chúng to hơn rất nhiều so với cây bình thường Càng lên đỉnh đồi thân rễ càng nhỏ đi [1] “Sách Đỏ Việt Nam” cũng cho biết cây mọc rải rác ven rừng, trong rừng tre nứa, tráng cây bụi, ven sông ven suối, sườn núi [2]

Thân rễ nằm dưới đất đến tháng hai mới mọc thân khí sinh, tháng 5-6 ra hoa và kết quả, cây tàn lụi vào tháng 11-12 [2]

1.5 Thu hái

Hàm lượng diosgenin đạt cao nhất trong thời kỳ ra hoa, tháng 5-6 [2], [10], vì thế để đạt hiệu quả cao nhất nên khai thác vào thời kỳ cây ra hoa

Nần nghệ có đặc điểm mọc thành từng đám, khá dày, đôi khi có thể gặp 4-5 gốc mọc sát nhau, thường chỉ mọc cách nhau vài mét, vì thế khai thác loài này tương đối đơn giản và dễ dàng (trong khoảng thời gian 3 giờ, có thể khai thác được 25-30 kg Nần nghệ trên một diện tích khoảng 500 m2) [1]

1.6 Thành phần hóa học

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Nần nghệ (D

collettii) Các nghiên cứu đã chỉ ra trong Nần nghệ có rất nhiều saponin, trong đó có

2 sapogenin chính là diosgenin và yamogenin Hàm lượng diosgenin lên tới 3,8 – 4,2 % [15]

Thân rễ của Nần nghệ (D collettii) thu được từ tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc sau

khi chiết bằng ether dầu hỏa (60-90⁰), được xử lý bằng acid, tập trung dịch chiết, từ

đó thu được tinh thể màu trắng Các chất phân lập được gồm diosgenin (1), yamogenin (2) , một lượng nhỏ β-sitosterol (3 ) và một dihydroxysterol (4), ∆3,5 - deoxyneotigogenin (6), ∆3,5

- deoxytigogenin (5), diosgenin palmitat (7) và yamogenin palmitat (8), isonarthogenin (9) và yamogenin - D- glucosid (10) [25] Đáng lưu ý là ba cặp đồng phân C25 được phân lập : 1 và 2, 5 và 6, 7 và 8 Cấu trúc của dihydroxysterol (4 ) vẫn chưa được xác định [26]

Một nghiên cứu khác đã xác định được 14 hợp chất saponin từ dịch chiết

ethanol của Nần nghệ (D collettii var hypoglauca bao gồm: prosapogenin A của

dioscin (1), dioscin (2), gracillin (3), protoneodioscin (4), protodioscin (5), protoneogracillin (6), protogracillin (7), methyl protoneodioscin (8), methyl protodioscin (9), methyl protoneogracillin (10), methyl protogracillin (11),

hypoglaucin F (12), hypoglaucin G (13), hypoglaucin H (14) [25]

Các sapogenin và các saponin được tìm thấy trong thân rễ Nần nghệ được trình bày ở 2 bảng sau:

Bảng 1.1 Các sapogenin trong thân rễ Nần nghệ

STT Tên chất Công thức cấu tạo TLTK

1 Diosgenin

1: R1=R2=H, R3= CH32: R1=R3=H, R2= CH3

5: R1=H, R2= CH3 6: R1= CH3, R2= H

Bảng 1.2 Các hợp chất saponin thu được từ dịch chiết ethanol của Nần nghệ

STT Tên chất Công thức cấu tạo TLTK

1 Prosapogenin A

của dioscin

1: R1 =α-L-Rha, R2=R3= H 2: R1=R3=α-L-Rha, R2= H 3: R1= α-L-Rha, R2=β-D-Glc, R3= H

RO

4 : 25R 5: 25S

12 Hypoglaucin F

O

O Glc OH

Sử dụng cao nước Nần nghệ (D collettii) đã được lọc trong trên thỏ ở cả hai

giống có cân nặng 2,5-3kg, được gây mê bằng pentotal cho kết quả:

- Ở liều 2-4 mg/kg thể trọng huyết áp dao động không đáng kể

- Ở liều 10 mg/kg thể trọng gây hạ khoảng 20-30% huyết áp Tác dụng xuất hiện nhanh sau khi đưa thuốc và kéo dài khoảng 7-10 phút

- Ở liều 25mg/kg thể trọng gây hạ 40% huyết áp so với mức ban đầu, kéo dài 10-15 phút [13]

Chế phẩm Diosgin từ Nần nghệ có tác dụng hạ huyết áp trên hầu hết bệnh nhân

có huyết áp cao [11]

1.7.2 Tác dụng hạ Cholesterol

Cao Nần nghệ có tác dụng hạ cholesterol khá rõ rệt trên mô hình gây tăng cholesterol thực nghiệm Tất cả các chỉ số lipid máu đều trở về trị số bình thường Điều đáng lưu ý là Nần nghệ hạ cholesterol, đặc biệt hạ rất mạnh LDL, trong đó lại

có xu hướng tăng HDL (40 ± 2,1 ÷ 36 ± 2,5 với p < 0,05), do đó hạ được chỉ số cholesterol/HDL (4,3 ÷ 3,2) [14]

Thử nghiệm 3 vạn viên Diosgin cho khoảng 200 người bệnh, kết quả xét nghiệm sinh hóa trên 5 chỉ tiêu về lipoprotein trong máu (triglycerid, cholesterol toàn phần, LDL, HDL và Cholesterol toàn phần/HDL) cho thấy Diosgin cho tác dụng tốt, trong quá trình điều trị không thấy có tai biến, tác dụng phụ nào [11]

1.7.3 Tác dụng chống viêm

1.7.3.1 Khả năng giảm sưng phù chân chuột trên mô hình gây viêm bằng dextran

Cao Nần nghệ với liều 300mg/kg cho chuột bị gây viêm bằng dextran uống 3 lần (24giờ, 3 giờ, 30 phút trước khi gây viêm) có tác dụng giảm viêm rõ rệt (p<0,05) Tác dụng này tương đương với prednisolon liều 70mg/kg uống 1 lần 30 phút trước khi gây viêm [14]

1.7.3.2 Khả năng giảm tiết dịch rỉ viêm trên mô hình gây rỉ dịch màng phổi bằng tinh dầu thông

Gây viêm bằng tinh dầu thông 0,05ml tiêm vào màng phổi, 3 giờ sau khi tiêm giết chuột bằng cách cắt động mạch cổ Bộc lộ khoang ngực, hút toàn bộ dịch rỉ có trong khoang ngực và đo thể tích dịch rỉ đó Cao Nần nghệ với liều 300 mg/kg cho chuột uống 3 lần (21 giờ, 2 giờ, và 15 phút trước khi gây viêm) có tác dụng giảm rõ rệt lượng dịch rỉ tiết ra Tác dụng này mạnh hơn prednisolon ở liều 70 mg/kg uống một lần 15 phút trước khi gây viêm [14]

Nần nghệ cũng được sử dụng để chống viêm trong đau do viêm khớp, được khuyến cáo như 1 biện pháp khắc phục để chống viêm khớp, tăng lưu thông máu,

giãn cơ; rất hữu dụng trong đau do thấp khớp và tê chân tay Ngoài ra nó còn được

sử dụng như 1 chất chống viêm cho các tổn thương ngoài da, bao gồm cả eczema [27]

1.7.4 Tác dụng gây giãn cơ trơn

Cao Nần nghệ gây giãn cơ trơn của mạch và ruột [13]

Trên ruột thỏ cô lập:

- Liều 0,1; 0,2; 0,3ml dung dịch cao Nần nghệ 5% nhỏ vào 50ml dịch nuôi ruột gây giãn rõ rệt Tác dụng hết sau 10-15 phút

- Liều 0,5 ml trở lên gây giãn không hồi phục

Trên mạch tai thỏ cô lập

- Liều 0,1-0,2ml dung dịch cao Nần nghệ 5% (được truyền lẫn vào dòng chảy của dung dịch nuôi tai) gây tăng rõ rệt số giọt chảy (gấp 3-4 lần) Tác dụng hết sau 10-15 phút

- Liều 0,5 ml trở lên gây giãn mạch, nhiều trường hợp giãn không hồi phục [13]

1.7.5 Ảnh hưởng đến hoạt động của tim tại chỗ

Thí nghiệm trên tim ếch (ếch khoảng 50g), thuốc được tiêm vào túi bạch huyết với thể tích không quá 0,5 ml

Kết quả:

Trên tim bình thường:

- Liều 20-30-40mg/ kg cân nặng, hoạt động của tim hầu như không thay đổi

- Liều 100mg/kg cân nặng gây rối loạn nhịp tim ở đa số ếch thử, tim đập chậm lại, biên độ co tăng gấp 2-3 lần so với bình thường [13]

Trên tim suy

- 70% số ếch thử có tim được hồi phục, nhịp tim đều trở lại, biên độ tăng cao, thậm chí có trường hợp đập mạnh hơn lúc bình thường, ở mức liều 30-40mg/kg cân nặng [13]

1.7.6 Tác dụng chống ung thư

- Các hợp chất chiết được từ dịch chiết saponin toàn phần của Dioscorea

collettii var hypoglauca đã được đánh giá có độc tính chống lại tế bào ung thư dòng

K562 in vitro [25]:

Tám hợp chất: protoneodioscin, protodioscin, protoneogracillin, protogracillin

và methyl protoneodioscin, methyl protodioscin, methyl protoneogracillin, và

methyl protogracillin, được chiết từ thân rễ của Dioscorea collettii var hypoglauca

cho thấy các tác dụng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư K562 trong ống nghiệm [24]

- Các nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư của saponin steroid từ thân rễ của

Dioscorea collettii var hypoglauca (Dioscoreaceae) đã cho thấy methyl

protoneogracillin (NSC- 698.793) và gracillin (NSC- 698.787) có khả năng gây độc

tế bào đối với các dòng tế bào ung thư ở người bị bệnh bạch cầu và tám loại bệnh khối u rắn Kết quả là, methyl protoneogracillin gây độc tế bào đối với tất cả các dòng tế bào thử nghiệm, đặc biệt là chọn lọc chống lại hai dòng bạch cầu (CCRF -CEM và RPMT - 8226), một dòng ung thư ruột kết (KM12 ), hai dòng ung thư hệ thống thần kinh trung ương (CNS) (SF- 539 và U251), một dòng khối u ác tính (M14), một dòng ung thư thận (786-0), một dòng ung thư tuyến tiền liệt (DU -145)

và một dòng ung thư vú (MDA- MB- 435) Trong đó bệnh bạch cầu, ung thư thần kinh trung ương, và ung thư tuyến tiền liệt nhạy cảm nhất, còn ung thư buồng trứng

ít nhạy cảm hơn Gracillin gây độc tế bào đối với hầu hết các dòng tế bào, nhưng không có hoạt tính chống lại EKVX (ung thư phổi tế bào không nhỏ), HT29 (ung thư ruột kết), OVCAR -5 (ung thư buồng trứng), và SN12C (ung thư thận) [22]

- Gần đây, một nghiên cứu hệ thống cho biết methyl protogracillin (NSC- 698.792) đã được sử dụng ở Viện Ung thư Quốc gia Mỹ làm thuốc chống ung thư [21]

- Các nghiên cứu độc tính sơ bộ trên người cho thấy mười một trong số mười

bốn saponin steroid của Dioscorea collettii có khả năng chống lại bệnh bạch cầu

myeloid cấp tính (AML) dòng tế bào K562 trong ống nghiệm [21] Mười một hợp chất được xác định là prosapogenin A của dioscin (1), dioscin (2), gracillin (3),

protoneodioscin (4), protodioscin (5), protoneogracillin (6), protogracillin (7), methyl protoneodioscin (8), methyl protodioscin (9), methyl protoneogracillin (10), methyl protogracillin (11) Tác dụng ức chế tế bào ung thư dòng K562 của saponin furostanol 4-11 tương tự như saponin spirostanol 1-3 [25]

- Protoneodioscin (NSC- 698.789), một saponin furostanol phân lập từ rễ của

Dioscorea collettii var hypoglauca (Dioscoreaceae) được sử dụng trong điều trị

ung thư cổ tử cung, ung thư bàng quang tiết niệu, và khối u thận Nghiên cứu cho thấy protoneodioscin gây độc tế bào đối với hầu hết các dòng tế bào ung thư bạch cầu và khối u rắn [21]

Tác dụng gây độc tế bào rất mạnh của protoneodioscin được quan sát đối với ba dòng bạch cầu (CCRF -CEM, K- 562 và MOLT -4), hai dòng ung thư ruột kết (HCT -15 và KM12), một dòng ung thư thần kinh trung ương (SNB -75), một dòng khối u ác tính (M14), một dòng ung thư thận (CAKI -1), một dòng ung thư tuyến tiền liệt (DU -145), và một dòng ung thư vú (MDAMB -435) Các khả năng gây độc vừa được tìm thấy đối với một dòng NSCLC (EKVX), một dòng ung thư ruột kết (HT29), hai dòng u ác tính (SK- MEL -2 và SK- MEL -5), hai dòng ung thư buồng trứng (OVCAR -4 và OVCAR -5), ba dòng ung thư thận (A498, ACHN và SN12C),

và một dòng ung thư vú (MCF-7) [21]

Bệnh bạch cầu cấp, ung thư thần kinh trung ương và ung thư tuyến tiền liệt là nhạy cảm nhất với protoneodioscin Trong khi đó, khối u ác tính, ung thư buồng trứng và ung thư thận ít nhạy cảm hơn [21]

Trong các nghiên cứu trên động vật, protoneodioscin đã được khẳng định không độc với liều dung nạp tối đa (MTD) hơn 600 mg/kg đối với chuột Thông tin quan

trọng này cũng trùng hợp với thực tế thân rễ của D collettii var hypoglauca đã

được sử dụng một cách an toàn trong điều trị bệnh nhân ung thư ở Trung Quốc [21]

1.7.7 Tác dụng kháng nấm

Mười bốn saponin steroid được phân lập từ thân rễ của D collettii var

hypoglauca: prosapogenin A của dioscin (1), dioscin (2), gracillin (3),

protoneodioscin (4), protodioscin (5), protoneogracillin (6), protogracillin (7),

methyl protoneodioscin (8), methyl protodioscin (9), methyl protoneogracillin (10), methyl protogracillin (11), Hypoglaucin F (12), Hypoglaucin G (13), Hypoglaucin

H (14) cho thấy hoạt tính kháng nấm gây biến dạng hình thái của sợi nấm và bào tử

của Pyricularia oryzae (một loại nấm phytopathogenic gây bệnh đạo ôn) trong đó

có ba saponin spirostanol, chín saponin furostanol, và hai glycosid pregnan [21], [23], [24], [25]

Cường độ tác động của các saponin spirostanol (1-3) mạnh hơn so với các saponin furostanol (4-12) và pregnan glycosid 13 và 14 Các 22-hydroxy furostanol

saponin (4-7) cho thấy tác dụng chống lại Pyricularia oryzae yếu hơn các

22-methoxy furostanol saponin (8-11) 25R- furostanol saponin ( 5,7,9,11) cho thấy sự khác nhau không đáng kể trong hoạt tính sinh học với các đồng phân 25S tương ứng của chúng là 4, 6, 8, 10 trong tính kháng nấm và ức chế tế bào ung thư [25]

Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất 1-14 chống lại P oryzae và tế bào

ung thư dòng K562 so sánh với Rhizoxin [24]

STT Hợp chất Nồng độ tối thiểu gây biến

dạng hình thái P oryzae (µM)

K562(IC50µM)

12 Hypoglaucin F 324 -

13 HypoglaucinG 135 -

14 Hypoglaucin H 236 -

Rhizoxin 0,008 0,003 (“-”: không có hoạt tính chống lại tế bào ung thư dòng K562)

1.8 Công dụng:

Trong đông y, Nần nghệ có vị khổ, tính bình, tác dụng giải độc, tiêu thũng, tán

ứ chỉ thống, khu phong trừ thấp Cây được dùng trị đau khớp xương do phong thấp, đau lưng gối, cảm nhiễm đường tiết niệu, bạch đới, rắn độc cắn [7]

Cao của thân rễ có tác dụng chống viêm và làm giảm cholesterol trong máu [2]

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

so sánh mẫu tiêu bản thực vật với mẫu tiêu bản thực vật số P00275852 của phòng

tiêu bản Herbier Muséum Paris cùng sự giúp đỡ của chuyên gia thực vật xác định

mẫu Nần nghệ mà chúng tôi nghiên cứu có tên khoa học là Dioscorea collettii Hook f., họ Củ nâu – Dioscoreaceae

2.1.3 Hóa chất và dụng cụ

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có:

- Các dung môi: Cồn tuyệt đối, Chloroform, Aceton, Methanol…

- Hóa chất vô cơ: Na2CO3, acid Acetic 5%, acid Sulfuric, dung dịch đệm Phosphat- Natri clorid, Cloramin B …

- Diosgenin đối chiếu của Viện Dược liệu

- Thuốc nhuộm vi phẫu: Xanh methylen, Đỏ son phèn

- Thuốc thử Vanillin trong acid Sulfuric đặc

- Nước cất

Dụng cụ thí nghiệm:

- Pipet, ống nghiệm, bình cầu, cốc có mỏ, bình nón, ống đong, phễu, bình định mức…

- Dao cầu, thuyền tán, cối, chày

- Bộ dụng cụ chiết hồi lưu, bếp cách thủy, bộ dụng cụ chiết soxhlet

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm sau của dược liệu Nần nghệ: 1) Mô tả dược liệu

9) Xác định các chất chiết được bằng ethanol

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Cảm quan

Quan sát mẫu ở ánh sáng thường Mô tả hình dạng, kích thước, màu sắc, mùi vị

và thể chất của dược liệu [3]

2.3.2 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi

Soi bột: Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 100⁰C sau đó dùng thuyền tán và chày cối sứ nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm dung dịch, đặt lam kính lên, di nhẹ lam kính và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột [6]

Đặc điểm vi phẫu: mẫu thân rễ Nần nghệ được cắt vi phẫu bằng máy cắt cầm tay, tẩy bằng cloramin B, nhuộm vi phẫu theo phương pháp nhuộm kép, lên tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm vi phẫu [5], [6]

Mô tả và chụp ảnh đặc điểm bột và vi phẫu bằng máy ảnh Canon

2.3.3 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học

Định tính saponin trong dược liệu Nần nghệ bằng phản ứng tạo bọt, xác định chỉ số bọt, chỉ số phá huyết theo tài liệu [4], [16], [17]

Định lượng diosgenin bằng HPLC, chiết sapogenin theo các tài liệu [18], [19]

SKLM: Định tính dược liệu Nần nghệ bằng SKLM theo phụ lục 5.4 Dược điển Việt Nam IV [6]

Xác định lượng chất chiết được trong dược liệu bằng phương pháp chiết nóng với ethanol tuyệt đối theo phụ lục 12.10 Dược điển Việt Nam IV [6]

2.3.4 Độ ẩm

Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn, quá độ ẩm đó thì dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho dược liệu là xác định giới hạn độ ẩm tối đa cho phép của một dược liệu để nó

có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản [3]

Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô hay phương pháp sấy theo phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam IV [6]

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu Nần nghệ

3.1.1 Mô tả dược liệu

Dược liệu là thân rễ đã được phơi hay sấy khô của cây Nần nghệ (Dioscorea

collettii Hook f Họ củ nâu (Dioscoreaceae)

Mô tả: Thân rễ không có hình dạng nhất định, thường phân nhánh và thắt thành từng đoạn không đều nhau, chiều dài khoảng từ 5-8 cm, dày khoảng 2-3 cm, tạo thành khối Ở tận cùng các nhánh có những lớp bần tụ thành từng đám vẩy màu đen; Vỏ ngoài có màu vàng nâu hoặc xám, xù xì, lồi lõm, mang rất nhiều rễ con dạng sợi cứng, đường kính vài milimet, dài 10-20 cm, phần sát với thân rễ có vết tích của lớp bần bị bong ra, tạo thành những ống ôm lấy rễ con, rễ con chỉ tồn tại ở những phần thân rễ còn non, ở những phần già rễ con tự rụng đi làm cho bề mặt thân rễ thường nhẵn hơn, có màu vàng nâu rõ hơn Mặt cắt màu vàng tươi, chất cứng và dai Dược liệu cứng và dai, mùi thơm nồng đặc biệt, vị đắng chát

- Rửa sạch lát cắt nhiều lần bằng nước cất

- Ngâm lát cắt trong dung dịch acid acetic 5% để tẩy Clorid của Cloramin B còn sót lại

- Ngâm lát cắt vào cloral hydrat khoảng 10 phút

- Rửa sạch lát cắt nhiều lần bằng nước cất

- Nhuộm Xanh methylen (đã pha loãng theo tỷ lệ 1:4) trong 5 phút

- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất

- Nhuộm đỏ son phèn trong 10 phút

- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất

- Đặt vi phẫu vào giọt glycerin trên phiến kính, đậy lamen, soi trên kính hiển vi

Kết quả

- Đặc điểm vi phẫu thân rễ Nần nghệ: từ ngoài vào trong thấy:

+ Phần vỏ: tương đối mỏng so với toàn bộ cấu tạo của thân rễ Gồm:

1 Bần có 2 phần: phần ngoài gồm 5-7 lớp tế bào, có kích thước lớn, sắp xếp một cạch lộn xộn, dễ bị bong ra khỏi thân rễ, các tế bào ở phần này bắt màu xanh với Xanh methylen trong phương pháp nhuộm kép; phần trong là những tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn thành những vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm, các tế bào này cũng bắt màu xanh

2 Mô mềm vỏ gồm 8-10 dãy tế bào hình đa giác hoặc hình trứng dài nằm ngang, bắt màu đỏ nhạt, giữa các tế bào này có các tế bào mô khuyết; đặc biệt sát lớp bần có 2-3 dãy tế bào hình thoi dài, có kích thước nhỏ, chúng đứng sát nhau hầu như không có khoảng gian bào, các tế bào này dần dần hóa bần

+ Phần trụ giữa: chiếm phần lớn trong toàn bộ cấu tạo thân rễ Gồm:

3 Trụ bì gồm 1-2 hàng tế bào thường là hình chữ nhật, xếp thành dãy không đều nhau, các dãy cũng không rõ ràng

4 Libe-gỗ: thường gặp là các bó libe-gỗ có thiết diện tròn, đôi khi có những bó

có thiết diện dài hoặc gấp khúc (những bó này được tạo ra do cắt vát vi phẫu) Đó là những bó chồng, libe ở ngoài bắt màu đỏ, gỗ ở trong bắt màu xanh Những bó này sắp xếp một cách lộn xộn trong mô mềm ruột Ở ngoài

là những bó có thiết diện nhỏ, vào trong các bó libe-gỗ to hơn và nhiều lên

Ở bó gỗ có thể nhìn thấy các mạch điểm hoặc mạch mạng đặc biệt rõ hơn ở các bó hình thoi Ở bó libe là những tế bào mảnh, nhỏ, màng mỏng

5 Mô mềm ruột: gồm 2 lớp tế bào bắt màu đỏ nhạt Lớp ngoài là những tế bào hình đa giác dài, xếp thành dãy dọc và không theo một trật tự nào, đôi chỗ

có thể thấy chúng xếp thành dãy xuyên tâm khá đều đặn, những tế bào này xếp sát nhau, hầu như không có khoảng gian bào, kích thước khá lớn, bên

trong chứa đầy hạt tinh bột Lớp trong gồm những tế bào hình đa giác tròn, sắp xếp lộn xộn, giữa chúng có khoảng gian bào khá nhỏ, các tế bào có màng mỏng và chứa đầy các hạt tinh bột

Ảnh chụp vi phẫu thân rễ dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.1 và 3.2

1: Bần, 2: Mô mềm vỏ, 2a: Tế bào hình thoi

2b: Tế bào mô khuyết 3: Trụ bì 4: Mô mềm ruột , 4a: Bó libe-gỗ

Hình 3.1 : Ảnh chụp vi phẫu thân rễ Nần nghệ dưới kính hiển vi

1

2 2a

2b

3

4

4a