Nghiên cứu sơ bộ thiết lập schisandrin làm chất đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu ngũ vị tử ngọc linh (schisandra sphenathera rehder e h wilson)

Quả Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera đã được nghiên cứu và xác định thành phần hóa học có nhiều hợp chất lignan schisandrin, gomisin, schisandrin A, schisantherin, các hợp chất terpeno

(SCHISANDRA SPHENANTHERA

REHDER & E.H WILSON)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

(SCHISANDRA SPHENANTHERA

REHDER & E.H WILSON)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Bản khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Dược Liệu với sự

hướng dẫn của PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và PGS.TS Phương Thiện Thương

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS

Phương Thiện Thương và PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà đã định hướng nghiên

cứu, hướng dẫn và góp ý giúp em hoàn thành khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dược Liệu và các cán bộ, các anh chị khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu đã tạo điều kiện giúp

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Hồ Ngọc Hoạt

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC CÁC BẢNG 8

DANH MỤC CÁC HÌNH 9

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu sơ lược về họ Ngũ vị (Schisandraceae) 3

1.2 Tổng quan về chi Schisanda 3

1.2.1 Giới thiệu về chi Schisandra 3

1.2.2 Một số loài thuộc chi Schisandra ở Việt Nam 5

1.3 Tổng quan về cây Ngũ vị tử Ngọc Linh 6

1.3.1 Đặc điểm thực vật 6

1.3.2 Phân bố 7

1.3.3 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của NVTNL 7

1.3.4 Các hợp chất lignan 9

1.3.5 Tác dụng dược lý 9

1.4 Tổng quan về schisandrin 10

1.4.1 Công thức cấu tạo 10

1.4.2 Tính chất hóa lý của schisandrin 11

1.4.3 Tác dụng sinh học 11

1.4.4 Một số nghiên cứu định tính, định lượng schisandin trong quả Ngũ vị tử 13

1.5 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc schisandrin 15

1.6 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng 15

1.6.1 Vài nét về phương pháp TLC áp dụng trong nghiên cứu định tính 15

1.6.2 Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương tiện nghiên cứu 20

2.2.1 Thiết bị 20

2.2.2 Dụng cụ 20

2.2.3 Hóa chất 21

2.3 Nội dung nghiên cứu 21

2.3.1 Phân lập chất schisandrin từ quả NVTNL 21

2.3.2 Định tính schisandrin trong quả NVTNL bằng TLC 21

2.3.3 Xây dựng quy trình định lượng schisandrin trong quả NVTNL bằng HPLC 21

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích schisandrin bằng HPLC 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử 22

2.4.2 Phân lập schisandrin từ quả NVTNL 22

2.4.3 Phương pháp định tính schisandrin trong quả NVTNL bằng TLC 23

2.4.4 Xây dựng phương pháp định lượng schisandrin trong quả NVTNL bằng HPLC 24

2.4.5 Thẩm định phương pháp định lượng schisandrin bằng HPLC 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 27

3.1 Phân lập schisandrin 27

3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ quả NVTNL 27

3.1.2 Phân lập schisandrin bằng phương pháp sắc ký cột 27

3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của NVT1 30

3.1.4 Định lượng lại schisandrin phân lập được 31

3.2 Xây dựng phương pháp định tính schisandrin trong quả NVTNL bằng phương pháp TLC 32

3.3 Xây dựng quy trình định lượng schisandrin trong quả NVTNL bằng phương pháp HPLC 35

3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 35

3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 38

3.4 Thẩm định phương pháp 42

3.4.1 Khảo sát tính phù hợp của hệ thống 42

3.4.2 Tính chọn lọc 42

3.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 43

3.4.4 Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính 44

3.4.5 Thẩm định độ lặp lại 45

3.4.6 Thẩm định độ thu hồi 46

3.5 Kết quả định lượng schisandrin trong mẫu dược liệu NVTNL 46

3.6 Bàn luận 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Resonance Spectroscopy)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của 1 số chất đã phân lập được trong cây NVTNL 8

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất NVT1 và schizandrin theo tài liệu tham khảo 30

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chương trình 37

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát dung môi chiết 38

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát nồng độ dung môi 39

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát số lần chiết 30

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống 42

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 44

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 45

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ thu hồi 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Ngũ vị tử Ngọc Linh 6

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của schisandrin 10

Hình 2.1: Dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh 20

Hình 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao quả NVTNL 27

Hình 3.2: Sắc ký đồ trên bản mỏng của schisandrin (1) với các phân đoạn 28

Hình 3.3: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập schisandrin trong cao dichloromethan từ quả NVTNL 29

Hình 3.4: Công thức cấu tạo của schisandin 31

Hình 3.5: Sắc ký đồ schisandrin tách được 32

Hình 3.6: Sắc ký đồ của 4 hệ dung môi 34

Hình 3.7: Phổ UV-VIS của schisandrin 35

Hình 3.8: Sắc ký đồ chương trình gradient 37

Hình 3.9: Biểu đồ sự phụ thuộc của hàm lượng schisandrin vào dung môi chiết 40

Hình 3.10: Tóm tắt quy trình xử lý mẫu 41

Hình 3.11: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thêm chuẩn 43

Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu chuẩn schisandrin ở nồng độ 0,1 µg/mL 43

Hình 3.13: Đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính của schisandrin 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngũ vị tử Ngọc Linh (NVTNL) là một loài ngũ vị tử mới được tìm thấy vào đầu những năm 2007 ở vùng núi Ngọc Linh, Kon Tum và được các nhà thực vật

học xác định tên khoa học là Schisandra sphenanthera Rehder et Wils., thuộc họ

Ngũ vị tử (Schisandraceae) [4] Như vậy, ngũ vị tử Ngọc Linh là loài Ngũ vị tử nam của Trung Quốc [4], [20], [23], [36] Tương tự như Ngũ vị tử nam đã được qui định trong DĐTQ, quả NVTNL được dùng trong y học cổ truyền với nhiều tác dụng chống

co giật, thuốc bổ, an thần, chữa phế hư, ho tức ngực, di tinh Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy quả Ngũ vị tử Ngọc Linh có tác dụng trong điều trị viêm gan siêu vi mạn [4], [25], [32], [33], bảo vệ thận [28], chống oxy hóa [19], và nhiều tác dụng khác [21]

Quả Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera đã được nghiên cứu và xác định

thành phần hóa học có nhiều hợp chất lignan (schisandrin, gomisin, schisandrin A,

schisantherin), các hợp chất terpenoid (β-sitosterol, henridilacton, ) và các tinh dầu

dễ bay hơi [10], [12] Một số nghiên cứu gần đây ở nước ta đã phân lập được

schisandrin từ quả NVTNL, một hoạt chất có nhiều tác dụng như: chống oxy hóa,

điều trị viêm gan, hen xuyễn, chống viêm, chống đông máu [4] Theo các nghiên cứu,

schisandrin có hàm lượng rất thấp trong quả các loài Ngũ vị tử nam khác (Schisandra

sphenanthera) nhưng nó lại là thành phần chính của quả loài Ngũ vị tử bắc

(Schisandra chinensis) phân bố chủ yếu ở Đông Bắc Trung Quốc [23], [27], [34],

[36] Trong khảo sát sơ bộ chúng tôi phát hiện thấy schisandrin là một trong các thành phần chính của loài NVTNL Hiện nay ở nước ta chưa có một nghiên cứu nào xác định hàm lượng schisandrin trong quả NVTNL, điều này đã gợi ý cho chúng tôi thực hiện một nghiên cứu để xác định hàm lượng schisandrin trong quả loài NVTNL để tạo thêm những cơ sở khoa học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu NVTNL, xa hơn

là đưa NVTNL vào thay thế các loài Ngũ vị tử (bắc và nam) hiện vẫn phải nhập khẩu

từ Trung Quốc

Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu sơ bộ thiết lập schisandrin

làm chất đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra

sphenanthera Reader & E.H Wilson)” với các mục tiêu sau đây:

1 Phân lập schisandrin từ quả NVTNL làm chất đối chiếu

2 Định tính và định lượng schisandrin trong quả NVTNL bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu sơ lược về họ Ngũ vị (Schisandraceae)

Họ Schisandraceae gồm có 2 chi, là chi Ngũ vị tử (Schisandra) và chi Na rừng (Kadsura) với tổng cộng khoảng 39 loài trên thế giới Được tìm thấy chủ yếu ở Đông và Đông Nam Á, trong đó 1 loài Schisandra đặc hữu được tìm thấy ở đông nam

Hoa Kỳ và dãy núi Madre của Mexico Người ta đã tìm thấy ở Trung Quốc có khoảng

27 loài thuộc cả 2 chi trong đó có 16 loài đặc hữu [20], [37]

Đặc điểm chung về hình thái học họ Schisandraceae:

Cây thân leo hóa gỗ, đơn tính, khác gốc Lá mọc xen kẽ hoặc mọc chùm vòng trên cành Hoa mọc ở nách lá hoặc cuối cành, thường đơn độc nhưng đôi khi mọc thành cặp hoặc cụm lên đến 8 Bộ nhị khác nhau, có 4-80 nhị, rời nhưng chặt chẽ, đôi khi tập hợp thành một khối gần giống hình cầu Nhụy hoa có 12-300 lá noãn, lá noãn gập đôi Quả là tập hợp của các lá noãn rời, vỏ quả nạc Hạt thường 1-5, hiếm khi có nhiều hơn, hạt dẹt và có nhiều nội nhũ [14], [20], [37]

1.2 Tổng quan về chi Schisanda

1.2.1 Giới thiệu về chi Schisandra

Đặc điểm hình thái học chi Schisandra:

Cây thân leo, hóa gỗ, không có lông, đơn tính, khác gốc Lá hình elip hoặc hình trứng rán, thường mọc xen kẽ nhau Hoa mọc ở nách lá, thường mọc đơn độc

Bộ nhị từ 4-60 nhị, rời rạc hoặc tập hợp thành một khối cầu Nhụy hoa có 12-120 noãn, đầu nhụy hình dùi Quả tụ tập lại với nhau trên đế hoa thành chùm, khi chín cho màu đỏ hiếm gặp quả chín cho màu đen Hạt thường 1, 2 hoặc 3, nhẵn hoặc hơi nhăn nheo [20], [37]

Phân bố:

Chi Schisandra hay còn gọi là Ngũ vị tử gồm khoảng 23 loài phân bố chủ yếu

ở Đông Á và Đông Nam Á (1 loài đặc hữu ở Bắc Mỹ), trong đó Trung Quốc phát hiện khoảng 19 loài (12 loài đặc hữu) [20], [37]

Phân bố 1 số loài trên thế giới [37]:

 Schisandra grandiflora: Được tìm thấy nhiều ở dãy Dãy Himalayas (Ấn Độ,

Nepal, Bhutan và Tây Tạng)

 Schisandra rubriflora: Đông bắc Assam, bắc Myanmar (Miến Điện), Trung

Quốc (tây Tứ Xuyên và bắc Vân Nam)

 Schisandra incarnata: Phía tây Hồ Bắc Trung Quốc

 Schisandra sphaerandra: Trung Quốc (nam Tứ Xuyên và bắc Vân Nam)

 Schisandra neglecta: Nepal, đông bắc Ấn Độ, bắc Myanmar (Miến Điện) và

Trung Quốc (Vân Nam)

 Schisandra sphenanthera: Trung Quốc (An Huy, Cam Túc, Quý Châu, Hà

Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tô, Thiểm Tây, Sơn Tây, Tứ Xuyên,Vân Nam,

và Chiết Giang)

 Schisandra arisanensis: Trung Quốc (An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông,

Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Nam và Giang Tây)

 Schisandra glaucescens: Trung Quốc (tây Hồ Bắc và đông Tứ Xuyên)

 Schisandra tomentella: Nam Tứ Xuyên Trung Quốc

 Schisandra pubescens: Trung Quốc (Hồ Bắc và Tứ Xuyên)

 Schisandra pubinervis: Trung Quốc (Hồ Bắc và Tứ Xuyên)

 Schisandra lancifolia: Trung Quốc (Tứ Xuyên và Vân Nam)

 Schisandra micrantha: Bắc Ấn Độ (Manipur), bắc Myanmar (Miến Điện) và

nam Trung Quốc (Vân Nam)

 Schisandra henryi: Trung Quốc (Quảng Tây, Quý Châu, Hà Nam, Hồ Bắc, Hồ

Nam, Giang Tây, Tứ Xuyên và Vân Nam)

 Schisandra longipes: Trung Quốc (bắc Quảng Đông và bắc Quảng Tây)

 Schisandra perulata: Thái Lan và Việt Nam

 Schisandra chinensis: Đông Bắc Trung Quốc và bắc Nhật Bản (Hokkaido)

 Schisandra glabra: Đông nam Hoa Kỳ và Mexico (Sierra Madre)

 Schisandra repanda: Nhật Bản (Hokkaido đến Kyushu) và phía nam Hàn

Quốc

 Schisandra bicolor: Trung Quốc (Quảng Tây, Hồ Nam, Giang Tây, Vân Nam

và Chiết Giang)

 Schisandra propinqua: Himalaya Ấn Độ, Trung Quốc

 Schisandra plena: Đông bắc Ấn Độ (Arunachal Pradesh) và Trung Quốc (Vân

Nam)

1.2.2 Một số loài thuộc chi Schisandra ở Việt Nam

Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, trong hệ thực vật Việt Nam chi Ngũ vị tử

(Schisandra) có 6 loài:

 Ngũ vị bắc (Schisandra chinensis (Turez) baill): Phân bố ở Lai Châu, Lào Cai:

Quả và hạt làm thuốc bổ, có tác dụng cường dương, trị suy nhược, chữa hen xuyễn,

ho lâu ngày, ra mồ hôi trộm, di tinh, ỉa chảy kéo dài, bồn chồn mất ngủ [5], [8], [11],

[15]

 Ngũ vị cuống dài (Schisandra propinqua (Wall.)): Phân bố ở Lào Cai (Sa Pa,

Phan Si Pan) Thân và lá dùng trị kinh nguyệt không đều, bạch đới, lao xương, mụn

nhọt, tổn thương, phổi có mủ Quả dùng thay thế Ngũ vị bắc [5], [8], [11]

 Ngũ vị hoa đỏ (Schisandra rubriflora (Franch) Rehder et E.H.Wilson): Phân

bố ở Lai Châu (Phong Thổ), Lào Cai (Sa Pa), Hòa Bình (Mai Châu) Quả và hạt làm

thuốc bổ, có tác dụng cường dương, trị suy nhược, đau dạ dày [5], [8]

 Ngũ vị sần (Schisandra verrucosa Gagnep.): Phân bố ở Lai Châu (Bình Lư),

Lào Cai (Sa Pa) Toàn dây băm nhỏ, phơi khô, nấu nước uống hằng ngày, chữa sưng

vú, khô sữa [5], [8], [11]

 Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata Gagn): Cây Ngũ vị vảy chồi theo địa

phương còn được gọi là Phân hùng vảy chồi Cây phân bố ở phía bắc Việt Nam như Sapa Đồng bào các dân tộc tỉnh Lào Cai sử dụng loài Ngũ vị vảy chồi để chăm sóc sức khỏe, như lấy thân, lá làm thuốc tắm hay thân còn được ngâm rượu làm thuốc bổ gân cốt, ngoài ra quả của loài này còn được dùng ăn để giải nhiệt khi đi rừng Ở Trung Quốc, loài này được dùng chữa kinh nguyệt không đều, bạch đới, đòn ngã tổn thương,

mụn nhọt, thần kinh suy nhược, đau dạ dày [5], [11]

 Ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera): Cây Ngũ vị tử nam được phát hiện

ở Việt Nam năm 2007, còn có tên gọi khác là Ngũ vị tử, Ngũ vị hoa nam Ở Việt Nam, cây phân bố ở Tây Nguyên, đặc biệt có trữ lượng lớn ở Kon Tum Đồng bào dân tộc tỉnh Quảng Nam và Tây Nguyên dùng cây này trị bệnh gan mật rất tốt [5],

[8]

1.3 Tổng quan về cây Ngũ vị tử Ngọc Linh

Ngũ vị tử Ngọc Linh có tên khoa học là Schisandra sphenanthera Rehder & E.H.Wilson, thuộc chi Ngũ vị tử (Schisandra), họ Ngũ vị (Schisandraceae), bộ Hồi

(Illiciales), phân lớp Hoàng liên (Rancunulidae), lớp Hai lá mầm (Dicotyledones), ngành Hạt kín (Angiospermae)

Hình 1.1: Ngũ vị tử Ngọc Linh

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Ngũ vị tử Ngọc Linh là loại cây thân leo gỗ, dài 3 – 5m Toàn cây không lông, rất ít gặp trên gân, mặt dưới lá non có lông nhỏ mềm thưa thớt Thân cành có nốt sần, cành non hơi có cạnh Lá mọc so le, hình trứng đảo, rộng hơn về phía cuối

lá, gốc hình nêm, đỉnh nhọn, kích thước lá trung bình dài 5-11 cm, rộng 3-7 cm Mép

lá có răng cưa thô về phía cuối lá Lá có gân hình lông chim Hoa đơn tính, khác gốc,

tràng có 69 cánh, màu vàng trắng, có mùi thơm, nhị 5 Hoa mọc ở nách lá, cuống dài 2-4 cm, gốc có phiến bao (vẩy) dài 3-4 mm Cánh hoa 5-9, màu cam, hình trứng đảo dạng tròn dài, kích thước 6-12 x 5-8 mm Hoa đực nhị nhiều, thành bó hình trứng đảo, đường kính 4-5 mm Đế hoa lồi hình trụ tròn, nhị nhiều, ô phấn hướng nội, 2 ô Trục đế hoa tập hợp quả dài 6-17 cm, đường kính 4 mm, cuống quả dài 5-10 cm Quả mọng khi chín có mầu hồng sau đỏ sẫm, hình cầu dạng trứng, đường kính 5-7 mm Hạt tròn màu vàng, hình thận dài 4 mm, rộng 3,8 mm, rốn hạt hình chữ v, vỏ hạt lưng

có vân sần sùi [3]

1.3.2 Phân bố

Cây Ngũ vị tử Ngọc Linh phát hiện năm 2000 tại dãy Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam ở độ cao 1,200 – 1,600 m, tập trung nhiều ở những vùng có sinh thái là rừng cây bụi, rừng thứ sinh và rừng thông đã qua khai thác chọn Ở Kon Tum, Ngũ vị tử phân bố ở các huyện Ngọc Lây, Đak tô, Tu-mơ-rông, Konplông Ở Quảng Nam phân bố chủ yếu ở nam Trà My cây tái sinh tự nhiên bằng hạt [3]

1.3.3 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của NVTNL

Các nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học của NVTNL đã chỉ ra sự có

mặt của các lignan (các gomisin, schisandrin, ) , các terpenoid (β-sitosterol,

henridilacton, ) và các tinh dầu dễ bay hơi là những thành phần hóa học có mặt trong cây [4], [10], [12], [13], [34]

 Thành phần hóa học trong thân cành

Trong một nghiên cứu về thành phần hóa học của thân cành NVTNL, Đỗ Tiến

Lâm đã phân lập được 6 hợp chất: β-sitosterol, β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit,

1-linoleoylglycerol, gomisin M1, gomisin M2 và axit kadsuric [13]

 Thành phần hóa học trong quả Ngũ vị tử Ngọc Linh

Trong nghiên cứu của Nguyễn Bá Hoạt và các cộng sự đã phân lập và xác định

được cấu trúc hóa học của 6 chất: gomisin A,C,J,N; schisandrin và β-sitosterol [4]

Trịnh Thu Thủy và các cộng sự cũng đã phân lập được 3 hợp chất từ quả NVTNL: schisandrin, angeloylgomisin P và 1 hợp chất nortriterpen là henridilacton [12]

Trong 1 nghiên cứu gần đây vào năm 2016 [10], Trần Thanh Hà và các cộng

sự đã phân lập được 4 hợp chất: β-sitosterol, acid coccinic, acid ursolic, daucosterol

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của 1 số chất đã phân lập được trong cây

schisandrin

gomisin C

1.3.4 Các hợp chất lignan

Các loài thực vật họ Schisandraceae có chứa nhiều hợp chất lignan rất phong phú và đa dạng, với cấu trúc lập thể phức tạp và thường được phân thành 5 nhóm: lignans dibenzocyclooctadiene (typeA); spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignans (type B); 4-aryltetralin lignans (type C); 2,3-dimetyl-1,4-diarylbutane lignans (type D) và 2,5-diaryltetrahydrofuran lignans (typeE) [14], [34]

Kể từ khi schizandrin được lập và xác định bởi N.K Kochetkov năm 1961 rất

nhiều dibenzocyclooctadiene lignan đã được phân lập từ quả của Schisandra

chinensis Những dibenzocyclooctadiene lignans có thể được phân loại thành hai

nhóm dựa trên cơ sở cấu trúc phân tử, cấu trúc S hoặc R-biphenyl Một số dimetyl-1,4-diarylbutan lignans, bao gồm pregomisin, axit meso-dihydroguaiaretic

2,3-cũng được phân lập từ quả Schisandra chinensis

Lignans cũng là thành phần chính của quả loài Ngũ vị tử nam Schisandra

sphenanthera Trong số các lignan thu được, chín hợp chất bao gồm epigomisin O,

tigloylgomisin P, angeloylgomisin P, schisantherin A, schisantherin B, schisantherin

D, deoxyschizandrin, schisanthenol, và isoschizandrin được tìm thấy trong cả quả của

cả 2 loài Schisandra chinensis và Schisandra sphenanthera [34]

1.3.5 Tác dụng dược lý

Quả của Schisandra sphenanthera Rehd Et Wils từ lâu đã được sử dụng như

thuốc chống co giật, thuốc bổ và an thần dưới cái tên Wuweizi, chữa phế hư, ho tức ngực, di tinh, Quả NVTNL còn có hiệu quả tốt trong điều trị bệnh viêm gan mạn

tính và xơ gan do làm giảm mức transaminase glutamic-pyruvic trong huyết thanh của bệnh nhân bị viêm gan siêu vi mạn [33] Nhiều nghiên cứu đã nói về hiệu quả chống oxy hóa của quả ngũ vị tử theo cơ chế gốc tự do [19], [21], [25], [33] Ngoài các tác dụng kể trên nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra những tác dụng sinh học mang tính đột phá của quả NVTNL:

 Làm tái tạo gan sau phẫu thuật cắt bỏ 1 phần gan ở chuột

Nghiên cứu được tiến hành trên chuột, sự tăng sinh tế bào gan được đánh giá

bằng chỉ số ghi nhãn Ki-67 Kết quả cho thấy Schisandra sphenanthera làm tăng đáng

kể tỷ lệ cân nặng của gan đối với chuột sau phẫu thuật cắt bỏ 1 phần gan nhưng không

có ảnh hưởng gì cân nặng của gan ở những con chuột được phẫu thuật giả [32]

 Làm giảm độc tính của cisplatin trên thận

Cisplatin là 1 chất chống ung thư theo cơ chế ức chế tổng hợp AND, gây độc

ở thận do tác dụng lên dòng tế bào HK-2 Trong 1 nghiên cứu của Jin J và các cộng

sự cho thấy 1 sản phẩm thuốc của Schisandra sphenanthera làm giảm độc tính của

Cisplatin trên thận do phá hủy cấu trúc của cisplatin và làm giảm sự mất cân bằng oxy hóa [28]

4 5

18 10

11 12

13

14

15

16 schisandrin

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của schisandrin

- Tên khoa học: tetrahydrodibenzo[a,c][8]annulen-6-ol

- Khối lượng phân tử: M= 432

- Tên khác: schizandrin, wuweizi alcohol A

- Schisandrin là 1 lignan thuộc nhóm dibenzocyclooctadiene

1.4.2 Tính chất hóa lý của schisandrin

Schisandrin là dạng tinh thể hình kim, ít tan trong nước, dễ tan trong

dichloromethan, ethanol, methanol

- Độ tan trong nước ở 25 độ C: 0,1593 mg/L

 Schisandrin giúp cải thiện trí nhớ nhờ cơ chế chống oxy hóa

Theo Di Hu và các cộng sự [24]: schisandrin có khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ ở chuột sau khi tiêm amyloid-beta (1-42) nhờ cơ chế chống oxy hóa Nghiên cứu được tiến hành trên chuột, các con chuột được tiêm amyloid-beta (1-42) và sau

đó được điều trị bằng schisandrin hoặc thuốc đối chiếu donepezil (DPZ) trong khoảng

14 ngày Hoạt động của các enzyme chống oxy hóa bao gồm superoxide dismutase (SOD) và peroxidase glutathione (GSH-px) và malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) và oxidase glutathione (GSSG) trong vỏ não và vùng hippocampus của chuột được đo để làm sáng tỏ cơ chế này Kết quả cho thấy schisandrin cải thiện đáng kể khả năng suy giảm trí nhớ do Aβ1-42 gây ra trong ngắn hạn Hơn nữa, trong vỏ não

và vùng hippocampus của chuột, hoạt động của SOD và GSH-px, GSH, và

GSH/GSSG tăng lên, mức MDA và GSSG giảm khi điều trị bằng schisandrin Những kết quả này cho thấy schisandrin là một chất dùng để điều trị bệnh Alzheimer thông qua cơ chế chống oxy hoá

 Schisandrin có tác dụng chống viêm

Theo Lian Yu Guo và các cộng sự [22]: schisandrin tác động lên nồng độ nitrit trong huyết tương chuột được đánh giá thông qua quá trình điều trị tác nhân kích hoạt phản ứng viêm lipopolysaccharide (LPS) Schisandrin cũng ức chế đáng kể carrageenan gây ra phù chân và axit axetic, tác nhân gây tăng tính thấm thành mạch

ở chuột Schisandrin có tác dụng điều trị nhiễm khuẩn huyết gây ra do LPS In vitro,

tác dụng chống viêm của schisandrin là kết quả của việc ức chế sản xuất nitric oxide (NO), giải phóng prostaglandin E2, cyclooxygenase-2 và tổng hợp nitric oxi (iNOS)

 Tác dụng chống xơ gan

Các yếu tố tăng trưởng chuyển đổi (TGF) -β1 đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra EMT ở tế bào gan, 1 nguyên nhân gây ra bệnh xơ gan Sự ức chế TGF-β1 làm ức chế sự tổng hợp EMT giúp ngăn ngừa xơ gan Theo Park JH và các cộng sự, schisandrin ức chế hoạt động tiền xơ hóa (pro-fibrotic) của TGF-β1 trong tế bào AML12 do đó ngăn chặn sự tích tụ của các protein ECM Sự ức chế EMT của schisandrin được đánh giá bằng biểu hiện giảm vimentin và fibronectin, và tăng E-cadherin và ZO-1 trong tế bào AML12 gây ra bởi TGF-β Schisandrin còn làm giảm

sự phosphoryl hóa gây ra bởi TGF-β1 do đó làm giảm nguy cơ gây xơ gan [35]

 Tác dụng chống hen suyễn

Trong 1 nghiên cứu của Mee-Young Lee và các đồng nghiệp tiến hành trên chuột, với tác nhân gây viêm đường hô hấp là ovalbumin (VOA) Việc sử dụng schizandrin có tác dụng ức chế mạnh mẽ sự tích tụ eosinophils vào đường hô hấp và làm giảm mức interleukin-4, interleukin-5, IFN-γ và TNF-α Ngoài ra, schizandrin ngăn chặn sự hình thành các loại oxy phản ứng (ROS) phụ thuộc vào liều dùng, ức chế sự gia tăng tế bào mỡ và sự thâm nhiễm tế bào viêm trong mô phổi Do đó, schizandrin có tác dụng chống hen, nó được xem như một nguyên nhân gián tiếp làm giảm sự mất cân bằng oxy hóa và viêm đường hô hấp [31]

 Tác dụng chống đông máu trong thử nghiệm in vitro

Lignan từ Ngũ vị tử có hoạt tính đối kháng với yếu tố tiểu cầu, yếu tố này có vai trò trong nhiều tác dụng trên người như hạ huyết áp, tăng độ thấm mao mạch, viêm cấp, hen xuyễn, tính quá mẫn của tim, loét dạ dày ruột, sốc do nội độc tố, dị ứng

da và sự loại bỏ bộ phận cấy ghép [6]

1.4.4 Một số nghiên cứu định tính, định lượng schisandin trong quả Ngũ vị tử

Nhiều nghiên cứu gần đây ở Việt Nam đã phân lập được schisandrin trong quả NVTNL [4], [12]; schisandrin cũng là thành phần chính trong quả Ngũ vị tử bắc nhưng lại có hàm lượng rất thấp trong quả các loài Ngũ vị tử nam khác Hiện nay ở nước ta chưa có nghiên cứu nào định tính và định lượng schisandrin trong quả NVTNL Ở nước ngoài, đã có 1 số nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời

schisandrin và một số lignan trong quả Ngũ vị tử bắc (Schisandra chinensis) Các

nghiên cứu đều ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [23], [27], [30], [34], [36] và phương pháp HPLC [23], [26], [27], [34], [36], [39] trong kiểm nghiệm schisandrin Trong đó, Dược điển Hồng Kông và Dược điển Trung Quốc đã trình bày quy trình kiểm nghiệm đồng thời schisandrin, schisandrin B trong Ngũ vị tử bắc và được xem là 2 tài liệu chính thống được nhiều nghiên cứu tham khảo để kiểm nghiệm đồng thời các lignin trong đó có schisandrin

1.4.4.1 Dược điển Hồng Kông [23]

 Định tính bằng TLC:

- Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel F254

- Dung môi pha động: ether dầu hỏa (60- 80°C): ethyl acetat: acid formic

(15:5:1, v/v)

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan 1,0 mg schisandin trong 1,0 mL ethanol

- Dung dich thử: Cân 1 g bột cho vào bình nón 50 mL, thêm 10 mL ethanol, siêu âm khoảng 1 giờ, lọc, bay hơi dịch lọc thu được cắn, hòa tan cắn trong

1 mL ethanol

 Định lượng: Phương pháp HPLC

- Detector UV ở bước sóng 254 nm, cột (4,6 x 250 mm), cỡ hạt 5 µm

- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút

- Pha động: Acetonitril: Nước

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 2,5 mg schisandrin cho vào bình định mức

25 mL, thêm vừa đủ 25,0 mL ethanol

- Dung dịch chuẩn: Cân 0,4 g mẫu bột dược liệu cho vào ống ly tâm 50 mL, sau đó thêm 10 mL ethanol Siêu âm hỗn hợp 30 phút, ly tâm, lọc và chuyển dịch lọc tới bình định mức 25 mL Lặp lại việc chiết xuất một lần nữa, kết hợp dịch lọc Thêm ethanol vừa đủ 25,0 mL, lọc

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan 1,0 g schisandin trong 1,0 mL chloroform

- Dung dich thử: Cân 1 g bột dược liệu, thêm 20 mL chloroform, đun hồi lưu cách thủy khoảng 30 phút, lọc, bay hơi dịch lọc thu được cắn, hòa tan cắn trong 1 mL chloroform

 Định lượng: Phương pháp HPLC

- Pha động: Methanol: Nước (65:35)

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 15 mg schisandrin cho vào bình định mức

50 mL, thêm vừa đủ 50,0 mL methanol

- Dung dịch thử: Cân chính xác 0,25 g bột cho vào bình định mức 20 mL, thêm khoảng 18 mL methanol, siêu âm 20 phút, thêm methanol vừa đủ, lọc

- Detector UV ở bước sóng 250 nm

- Thể tích tiêm mẫu: V = 10 µL

- Yêu cầu: Hàm lượng schisandrin không được thấp hơn 0,4 %

1.5 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc schisandrin

Chất phân lập nghi ngờ là schisandrin được khẳng định cấu trúc bằng phương

 Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng các chất được ghi tại Viện Hóa học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, máy đo LC/MSD Trap Agilent, dung môi nước [18]

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

C-NMR) được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam dùng MeOD làm dung môi [7]

cơ chế: phân bố, hấp thụ, trao đổi ion, Pha động là những hệ dung môi tương tự phương pháp HPLC

Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động ( đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

 Pha tĩnh của TLC

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 - 30 µm được trải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông [1] Pha tĩnh thông dụng nhất hay dùng là silica gel, ngoài ra cũng có thể sử dụng nhôm oxyd, kieselguhr, cellulose, polyamid hay các loại silica gel pha đảo [17]

 Pha động:

Pha động của TLC phụ thuộc vào cơ chế sắc ký, để tăng cường sức rửa giải thường kết hợp 2 hoặc nhiều dung môi với nhau Nguyên lý chi tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2 pha Dưới đây là 1 số gợi ý chung nhất cho dung môi pha động:

- Dung môi cần có độ tinh khiết cao

0,8 đạt độ phân giải cực trị

- Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân

cực như hỗn hợp n-butanol – nước Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào

nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

- Khi dùng silica gel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha

Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi không

 Đánh giá kết quả

- Vết chất cần phân tích trên bản mỏng khi soi đèn UV hoặc phun thuốc thử hiện màu phải được nhìn thấy rõ, tách rời với các vết tạp

1.6.2 Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.6.2.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC

HPLC là một kỹ thuật phân tích trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Tốc

độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này đối với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Các chất sau khi ra khỏi cột

sẽ được phát hiện bởi detector

Có 4 kỹ thuật HPLC cơ bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và rây phân

tử (loại cỡ) Trong phạm vi khóa luận này, tôi xin trình bày cụ thể về kỹ thuật sắc ký phân bố

1.6.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu năng cao

- Pha tĩnh:

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp gồm nhiều thành phần Đó là chất rắn xốp, có kích thước nhỏ, đường kính 3 – 10 µm, có độ phân cực khác nhau Pha tĩnh được cấu tạo từ các nhóm chức khác nhau ghép hóa học trên giá mang, thường là các hạt silica gel Tùy theo bản chất pha tĩnh, người ta phân ra hai loại:

pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực như: n-hexan, toluen, isopropyl

ether Trong sắc kí pha thuận, chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần

ký pha đảo, các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động thời gian lưu tăng lên

- Pha động trong HPLC:

Pha động là dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc kí Pha động

có thể là dung môi hữu cơ, hoặc hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định Trong sắc kí

pha thuận, pha động là các dung môi hữu cơ ít phân cực như: n-hexan, benzen,

chloroform… Trong sắc kí pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như: methanol, acetonitril… hay hỗn hợp của chúng

- Detector trong HPLC

Detector là bộ phận dùng để phát hiện các chất sau khi được tách riêng và rửa giải ra khỏi cột sắc kí Một chất khi đi qua detector sẽ cho tín hiệu đáp ứng khác biệt với nền pha động, qua đó cho phép đánh giá, định tính, định lượng các thành phần trong mẫu phân tích Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của đối tượng chất cần phân tích, detector sẽ được lựa chọn thích hợp để những chất này có đáp ứng với detector Các loại detector thường được sử dụng trong HPLC bao gồm: detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS), detector hiện đại thuộc loại này là detector mảng diod (DAD), detector huỳnh quang, detector độ dẫn, detector khối phổ

1.6.2.3 Các phương pháp định lượng bằng HPLC

Nguyên tắc của các phương pháp định lượng bằng HPLC là nồng độ của chất

tỷ lệ với chiều cao và diện tích pic của chất đó thể hiện trên sắc ký đồ

Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong phạm vi khóa luận này, tôi xin trình bày chi tiết về phương pháp chuẩn ngoại Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả mẫu chuẩn

và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các chất cần phân tích trong mẫu thử

Có 2 phương pháp là chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm

- Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử

Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

Sx Ss

Trong đó: CX là nồng độ mẫu thử

- Chuẩn hóa nhiều điểm: cần tiến hành qua những bước sau:

ứng thu được là các diện tích (hoặc chiều cao) của pic ở mỗi điểm chuẩn

độ của chất chuẩn

Có thể tính toán dựa theo 2 cách:

ra được nồng độ của nó

chiều cao) của pic với nồng độ của chất cần xác định

Trong đó: Y là diện tich pic

a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b là độ dốc của đường chuẩn

cao) của pic mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1], [2], [16]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là quả cây NVTNL được thu hái ở vùng núi Ngọc Linh, Kon Tum vào tháng 8/2016 Mẫu nghiên cứu được gửi về Viện Dược Liệu Quả tươi

Hình 2.1: Dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh 2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thiết bị

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích (Sartorius, BP-221S): độ chính xác 0,0001 g

- Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M)

- Tủ sấy (Memmert, ULM 500)

- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 365 nm (Vilber lourmat, CN – 15 – LC)

- Máy quang phổ UV-1800, SHIMADZU

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – LC 10A (Shimadzu)

- Máy ly tâm (Heraus)

- Máy đồng nhất mẫu HR2118 (Philips)

2.2.2 Dụng cụ

- Micropipet loại 100 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL và đầu côn tương ứng

- Ống ly tâm 2 mL, 50 mL

- Màng lọc 0,2 µm, 0,45 µm

- Vial dung tích 1,8 mL

- Dụng cụ thủy tinh cơ bản của phòng thí nghiệm gồm bình định mức, ống

nghiệm, ống đong, cốc có mỏ, phễu…

2.2.3 Hóa chất

Bio – Technology Co.,Ltd

- n-hexan, ethanol (EtOH), dichloromethan, ethyl acetat (EtOAC), methanol

(Merck)

trong ethanol

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Phân lập chất schisandrin từ quả NVTNL

2.3.2 Định tính schisandrin trong quả NVTNL bằng TLC

2.3.3 Xây dựng quy trình định lượng schisandrin trong quả NVTNL bằng HPLC

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích schisandrin bằng HPLC

- Độ lặp lại (độ chụm), độ thu hồi (độ đúng) của phương pháp

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử

- Thời gian lấu mẫu: tháng 08/2016

- Địa điểm lấy mẫu: núi Ngọc Linh, Kon Tum

- Khối lượng mẫu: 4 kg

- Mẫu sau khi thu thập được rửa sạch, sấy khô ở 65oC, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát

2.4.2 Phân lập schisandrin từ quả NVTNL

2.4.2.1 Phương pháp phân lập schisandrin trong quả NVTNL

 Chiết xuất các cao phân đoạn từ quả NVTNL

Sử dụng ethanol 96 % để chiết xuất dược liệu, thu được cao trong ethanol Cao toàn phần sau đó được hòa tan trong nước rồi tiếp tục chiết lỏng lỏng bằng các dung

môi có độ phân cực khác nhau lần lượt là: dicholoromethan, n- butanol Thu được 3 phân đoạn dịch chiết: phân đoạn dichloromethan, phân đoạn n-butanol và phân đoạn

nước

 Phân lập schisandrin từ cao phân đoạn

Phân lập schisandrin bằng phương pháp sắc ký cột

Cột sắc ký:

Cột sắc ký là một cột thủy tinh có van khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy, kích thước tùy lượng cao phân lập Cột được rửa sạch, sấy khô, gắn trên một giá vững chắc

Pha tĩnh:

Hạt silica gel pha thuận hoặc hạt silica gel pha đảo

Pha động:

Dung môi rửa giải là n-hexan, ethyl acetat, methanol

Phương pháp nhồi ướt:

Cột sắc ký được lót một lớp bông mỏng ở dưới đáy để chất hấp phụ chảy xuống

pha đảo C18 (dùng trong cột sắc ký pha đảo) được hòa tan trong dung môi pha động Luyện cột bằng dung môi pha động để đuổi bọt khí, nén cột, giúp ổn định tốc độ dòng Cột được luyện đến khi không còn bọt khí trong cột, chiều cao lớp chất hấp phụ ổn định

Chuẩn bị mẫu sắc ký:

Phần chất cần phân lập được hòa tan trong 1 lượng tối thiểu dung môi Sau đó trộn với 1 lượng pha tĩnh vừa đủ, rồi làm bay dung môi để được bột mịn tơi xốp như lớp chất hấp phụ bình thường, nhằm tạo sự đồng nhất lớp bột và lớp chất hấp phụ khi lên cột

Đưa mẫu lên cột:

Cột sắc ký sau khi đã ổn định, cho dung môi chảy xuống cách lớp silicagel đủ

để lấp đầy phần chất cho vào Phần mẫu được rắc đầu trên lớp silicagel, gõ để ổn định phần mẫu Sau đó cho dung môi chảy xuống gần sát bề mặt phần mẫu lên cột để các chất đi xuống hết lớp hấp phụ, tránh hiện tượng khuếch tán ngược

nhau

2.4.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc schisandrin

Chất phân lập nghi ngờ là schisandrin được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ bao gồm: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối (MS)

Các phổ được tiến hành đo ở Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST)

2.4.3 Phương pháp định tính schisandrin trong quả NVTNL bằng TLC

Khảo sát hệ dung môi chấm sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng TLC silica gel 60

Hệ dung môi phù hợp là hệ dung môi cho các vết tách biệt nhau trên bản mỏng và

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng

2.4.4 Xây dựng phương pháp định lượng schisandrin trong quả NVTNL bằng HPLC

2.4.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: Qua tham khảo các nghiên cứu chúng tôi lựa chọn cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) của hãng Agilent

- Khảo sát bước sóng phân tích

- Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động

2.4.4.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

- Lựa chọn dung môi chiết: Dựa trên độ tan khác nhau của schisandrin trong các dung môi mà chúng tôi tiến khành khảo sát

- Khảo sát phương pháp chiết: Khảo sát số lần chiết

2.4.5 Thẩm định phương pháp định lượng schisandrin bằng HPLC

2.4.5.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Khái niệm

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể được

phát hiện với mức tin cậy xác định

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu

thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

- Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích (ở trong nghiên cứu này thì khoảng tuyến tính là sự phụ thuộc của diện tích pic và nồng độ chất chuẩn)

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo

được và nồng độ các chất phân tích

- Xác định:

Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

2.4.5.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép

đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

2 𝑁

𝑖=1

𝑁 − 1 Trong đó:

- 𝑥̅: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

- C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (mg/mL)

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

3.1 Phân lập schisandrin

3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ quả NVTNL

Quả NVTNL đã phơi, sấy khô (3 kg) được chiết nóng 5 lần, mỗi lần với 10 lít

được đem cất loại dung môi thu được 1,12 kg cao tổng Hòa tan cao toàn phần trong lượng nước vừa đủ sau đó chiết phân bố với dung môi dichoromethan (tỷ lệ 1:1, mỗi dung môi 3 lần) thu được dịch chiết tương ứng Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cao tương ứng là cao dichloromethan, cao nước Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ sau

Hình 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao quả NVTNL

3.1.2 Phân lập schisandrin bằng phương pháp sắc ký cột

Kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC) của schisandrin và dịch chiết phân đoạn dichloromethan (hình 3.2) cho thấy schisandrin có trong phân đoạn dichloromethan,

do đó lựa chọn phân đoạn dichloromethan phân lập schisandrin

Quá trình sắc ký phân đoạn dichloromethan thu được 7 phân đoạn ký hiệu là: PĐ1, PĐ2, PĐ3, PĐ4, PĐ5, PĐ6, PĐ7 và phần dội cột bằng 100 % methanol Kết quả sắc ký đồ (hình 3.2) cho thấy schisandrin có trong PĐ6

Quả Ngũ vị tử (3 kg)

Cao tổng

Phân đoạn nước

(0,91 kg)

Chiết với EtOH 96%

Thu hồi dung môi

Cao phân đoạn dichloromethan (224g)

Hòa trong nước Lắc với dichloromethan

Thu hồi dung môi

A B C

Hình 3.2: Sắc ký đồ trên bản mỏng của schisandrin (1) với các phân đoạn: PĐ6

(2), phân đoạn dichloromethan (3), cao tổng (4)

Chú thích: hệ dung môi khai triển n-hexan: ethyl acetat (1:1)

A: SKĐ quan sát ở bước sóng λ = 254 nm

B: SKĐ quan sát ở bước sóng λ = 366 nm, sau khi hiện màu bằng thuốc thử

H 2 SO 4 10 % pha trong ethanol

10 % pha trong ethanol

Phân lập schisandrin từ PĐ6:

Phân đoạn PĐ6 (1,1 g) tiếp tục được sắc ký trên cột kích thước 3 cm x 60 cm,

hỗn hợp 2 dung môi methanol : nước (1,2:1, v/v) Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm

10 mL và kiểm tra quá trình sắc ký và so sánh với chất chuẩn schisandrin bằng SKLM Gộp các ống giống nhau và so sánh với thu được PĐ6.1 (101,2 mg) chứa schisandrin

Phân đoạn PĐ6.1 (101,2 mg) được tiếp tục sắc ký trên cột kích thước 3cm x

60 cm, với hạt sephadex Hệ dung môi rửa giải là methanol Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm 5 mL và kiểm tra quá trình sắc ký và so sánh với chất chuẩn schisandrin bằng TLC Gộp các ống sạch giống schisandrin vào với nhau Bay hơi dung môi thu được 80,4 mg tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, ký hiệu là NVT1

Hình 3.3: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập schisandrin trong cao

dichloromethan từ quả NVTNL

Cao dicloromethan (102 g)

Sắc ký cột pha thường

n-hexan : EtOAc

(100:0- 0:100)

Sắc ký cột pha đảo MeOH: H 2 O

Sắc kýcột Sephadex MeOH

PĐ2 (2,89 g)

PĐ3 (3,49 g)

PĐ4 (3,76 g)

PĐ5 (6,44 g)

PĐ6 (8,26 g)

PĐ6.1 (101,2 mg) g)

PĐ7 (10,22 g)

PĐ1

(1,78 g)

NVT1 (80,4 mg)

1,2:1

3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của NVT1

60,5(×2) 60,9(×2) 56,0(×2)

3,59 (3H, s) (×2) 3,90 (3H, s) (×2) 3,92 (3H, s) (×2)

*: Đo trong CD 3 OD; # : Đo trong CDCl 3