KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

Đèn UV 365nm quang Vàng đậm phát quang Vàng nhạt phát quang Xanh rêu nhạt T Tím nhạt phát quang Vàng nhạt phát quang Xanh nhạt quang Vàng nhạt phát quang Vàng nhạt phát quang Đỏ nhạt phá

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH BUỔI 6

*****

Bài 7 : DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

I Chiết xuất

- Dược liệu :

+ Hoa hòe Flos Styphnolobii japonici

+ Vỏ Bưởi Pericarpium Citri grandi

+ Diếp cá Herba Houttuyniae

+ Rễ tranh Rhizhoma Imperatae

+ Đậu đen Semen Vignae umguiculatae

H: Hoa hòe

5g bột dược liệu B: Vỏ bưởi

96% T: Rễ tranh

+BM 5’ với 200ml cồn C: Diếp cá

25% Đ: Đậu đen

+Lọc nóng qua bông

Dịch chiết

Định tính trên giấy lọc Định tính trong ống nghiệm dd NaOH 1% + dd NaOH 1% + Phản ứng của phenol và nhân thơm dd AlCl3 1% + dd AlCl3 1% + Phản ứng ở vòng γ- pyron dd FeCl3 1% + dd FeCl3 1% + Phản ứng của nhóm AC

II Định tính

1 Định tính trên giấy lọc

- Bước 1 : dùng bút chì kẻ tờ giấy lọc thành bảng gồm 6 hàng x 5 cột.(mỗi hàng gồm 1 ô ghi chú và 4 ô thử, mỗi cột gồm 1 ô ghi chú và 5 ô thử tương ứng với 5 loại dược liệu Cột số 1 dùng để ghi tên mẫu, cột số 2 được dùng

làm mẫu chứng ( chỉ có dịch chiết, không có thuốc thử)

- Bước 2 : Trong mỗi hàng, dùng pipet Pauter nhỏ thật gọn vào các ô 1 giọt dịch chiết của một loại dược liệu, để khô tự nhiên ( Lập lại 3 lần như vậy)

Vẽ vòng đánh dấu các vết dịch chiết bằng bút chì

- Bước 3 : Nhỏ riêng biệt lên 3 cột còn lại lần lượt 3 loại thuốc thử là dung dịch

thuốc thử này thành vòng bé, nằm gọn trong vết dịch chiết)

Ánh sáng thường

B Hồng nhạt Vàng nhạt Không màu Đỏ nhạt

 Nhận xét

• Trong môi trường kiềm :

+ Hoa hòe, Diếp Cá , Bưởi : vàng nhạt sang vàng đậm : có nhóm isoflavonoid

+ Đậu đen : tím nhạt sang xanh nhạt : có nhóm anthocyanin + Vỏ bưởi : màu vàng cam sang màu hồng nhạt : có nhóm chacon, auron

➢ Nhóm flavonoid co sự tăng màu

• Trong môi trường AlCl3

+ Vỏ bưởi , Đậu đen :mất màu :có chalcon +Hoa hòe, Diếp cá: màu vàng có nhóm isoflavon, isoflavanon

+ Hoa hòe : có nhiều nhóm OH , có các dẫn chất 3’,4’,5’tri -OH + Diếp Cá , Bưởi, Đậu đen: có ít nhóm OH nên màu nhạt hơn

+ Flavon chất kết tinh không màu đến vàng nhạt

+ Flavonol màu vàng nhạt đến vàng

+ Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt đến khi không màu

+ Chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam

+ Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol,

leucoanthocyanidin, flavan 3-ol không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carboxyl nên không màu

Đèn UV 365nm

quang

Vàng đậm

phát quang

Vàng nhạt phát quang

Xanh rêu nhạt

T Tím nhạt phát

quang

Vàng nhạt phát quang

Xanh nhạt

quang

Vàng nhạt phát quang

Vàng nhạt phát quang Đỏ nhạt

phát quang Tím nhạt Cam

 Giải thích :

• Trong môi trường kiềm :

- Đậu đen có dẫn chất nhóm Flavan 3,4-diol không màu ở ánh sáng thường , nhưng có tính phát quang UV 365

- Hoa Hòe : Tác dụng của kiềm flavon và flavonol cho màu vàng sáng Vỏ Bưởi : anthocyanidin màu xanh dương, chalcon và auron màu đỏ da cam

- flavan 3-ol, flavanon, isoflavon màu không đổi

2 Định tính trong ống nghiệm

Với mỗi dược liệu, lấy 6 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1%

- Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 1%

- Phản ứng tạo phức với dung dịch chì axetat trung tính :

 Cách thực hiện: 1 ml dịch chiết + 3 giọt thuốc thử, lắc đều, quan sát màu, tủa và so sánh với mẫu chứng (riêng mẫu B, phản ứng với NaOH 1%: quan sát màu của ống nghiệm trước và sau khi nhúng vào nồi cách thủy 2-3 phút)

- Phản ứng với thuốc thử diazonium

+ Thực hiện: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, kiềm hóa bằng vài giọt dung dịch NaOH 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử diazonium lạnh Lắc đều và quan sát màu của dung dịch

diazonium

diazonium để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ

Bố trí ống nghiệm :

❖ Kết quả thí nghiệm :

▪ Theo cột :

- Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% : : flavan 3-ol cho màu vì dễ bị oxy hóa , flavanon dễ bị isomer hóa thành chalcon màu vàng đậm đến đỏ ,

o Phản ứng tạo phức với dung dịch AlCl3 1% trong MeOH:

phân tử Càng nhiều nhóm OH ( đặc biệt là nhóm o-di-OH) màu càng đậm ( Hoa Hòe > Vỏ Bưởi > Diếp Cá > Rễ Tranh )

o Phản ứng tạo phức với dung dịch chì axetat trung tính: tủa từ vàng nhạt đến sậm , các flavonoid có ortho-di-OH phenol

▪ Theo hàng :

- Hoa Hòe : Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% ,tạo phức với dung dịch AlCl3 1% trong MeOH, tạo phức với dung dịch FeCl3 1%,tạo phức với dung dịch chì axetat trung tính, Phản ứng với thuốc thử diazonium

- Vỏ Bưởi : Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% ,tạo phức với dung dịch AlCl3 1% trong MeOH, tạo phức với dung dịch FeCl3 1%,tạo phức với dung dịch chì axetat trung tính, Phản ứng với thuốc thử diazonium

- Diếp Cá: Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% ,tạo phức với dung dịch AlCl3 1% trong MeOH, tạo phức với dung dịch FeCl3 1%,tạo phức với dung dịch chì axetat trung tính, Phản ứng với thuốc thử diazonium

- Rễ Tranh: Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% ,tạo phức với dung dịch AlCl3 1% trong MeOH, tạo phức với dung dịch FeCl3 1%,tạo phức với dung dịch chì axetat trung tính, Phản ứng với thuốc thử diazonium

- Đậu Đen: Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% ,tạo phức với dung dịch AlCl3 1% trong MeOH, tạo phức với dung dịch FeCl3 1%,tạo phức với dung dịch chì axetat trung tính, Phản ứng với thuốc thử diazonium

b Phản ứng của vòng γ-pyron (Phản ứng Cyanidin)

Cho 1 ml dịch chiết của 3 mẫu H, B và T vào 3 ống nghiệm lớn riêng biệt đã có sẳn 1

ít bột Mg kim loại Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 0,5-1 ml HCl đậm đặc ( làm trên giá ống nghiệm đặt trong tủ hốt Chú ý tránh dịch axit trào ra khỏi ống nghiệm)

 - Màu đỏ cam (Ống B),đỏ tươi( Ống H) với các dẫn chất flavon, flavonol,

flavanonol, flavanon, chalcon Các anthocyanidi kết hợp với ion kim loại Mg ++ dưới dạng phức càng cua (chelat) gọi là các chất metalloanthocyanin

- Ống T: màu trắng có Các dẫn chất methoxy flavon âm tính

c Phản ứng của nhóm anthocyanidin

- Cho vào 3 ống nghiệm riêng biệt mỗi ống 2 ml dịch chiết đậu đen ( Đ )

+ Ống 1: thêm 1 giọt HCl 1%,

+ Ống 2 : thêm 2 giọt NaOH 1%

+ Ống 3 : giữ nguyên

➔ Trong môi trường HCl (Ống 1) : phần đường trong phân tử (thường nối vào

OH ở C-3) bị cắt và cho phần aglycon được gọi là anthocyanidi Anthocyanidi là các dẫn chất của 2-phenyl benzopyrilium ( = flavilium) là các cation, tạo muối oxonium có màu đỏ

- Trong môi trường NaCl (Ống 2) : các anion quinoid màu xanh tạo thành vị trí 4’( hoặc 2’) có nhóm hydroxyl