TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THÍ NGHIỆM VI SINH

Bài 4: Quan sát hình thái tế bào vi sinh vật Bài 5: Định lượng vi khuẩn hiếu khí Kế hoạch thí nghiệm 4 buổi YÊU CẦU THÍ NGHIỆM Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa c

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài 4: Quan sát hình thái tế bào vi sinh vật

Bài 5: Định lượng vi khuẩn hiếu khí

Kế hoạch thí nghiệm (4 buổi) YÊU CẦU THÍ NGHIỆM

Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm

KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM

Buổi 1(Bài 1)

Kiểm tra Chuẩn bị môi trường và bao gói dụng cụ (Bài 1)

Buổi 2 (Bài 2)

- Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất (sv năm được thao tác chuẩn bị mẫu và gieo cấy,

làm quen với tủ cấy)

- Cấy chuyển chủng vi sinh vật thuần khiết , chuẩn bị cho bài 3 và bài 4

Buổi 3: (Bài 3 và Bài 4)

Nhận xét buổi làm đầu tiên, bao gồm kết quả

Thực hành bài 3 và bài 4

Buổi 4:

Thi kết thúc môn học

YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

VI SINH VẬT

1 Quy tắc làm việc trong phóng thí nghiệm vi sinh vật

- Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp và vệ sinh phòng thí nghiệm

- Mỗi người mỗi nhóm có nơi làm việc riêng, chỉ sử dụng những dụng cự thiết bị dành riêng cho mình Thiếu thì phải hỏi cán bộ hướng dẫn Tuyệt đối không lấy của người khác

- Trong phòng thí nghiệm không được ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… luôn mặc

áo Blue khi làm việc

- Không được tự điều chỉnh hoặc sử dụng những thiết bị của phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn

- Sau khi thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm và sắp xếp gọn gàng nơi làm việc

- Trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn Trường hợp cần thiết phải sát trùng bằng cồn

2 Nguyên tắc làm việc với các giống vi sinh vật

Trong điều kiện phóng thí nghiệm, các vi sinh vật được nuôi cấy trên các môi trường

dinh dưỡng đặc hoặc lỏng đựng trong các ống nghiệm, trong các bình thủy tinh hoặc các đĩa Petri Dụng cụ thủy tinh và môi trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng trước khi cấy, phải tiến hành theo những quy tắc nhất định để đảm bảo giữ cho các giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm bẩn bởi vi sinh vật ở môi trường xung quanh

Trước khi cấy cần ghi cẩn thận lên ống nghiệm ( hoặc bình thủy tinh hoặc đĩa Petri):

- Tên môi trường

- Tên giống vi sinh vật

Tiến hành ghi chép thí nghiệm:

Trong sổ phải ghi chép đầy đủ các điều có liên quan đến việc hoàn thành các thí nghiệm Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự nhất định

Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc

2/ Đối tượng nghiên cứu

3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm

4/ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng

5/Kết quả nhận được

Các số liệu phai ghi thành từng bảng Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình vẽ, ghi chép tất cả các số liệu thực nghiệm và các tính toán vào trong sổ

CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG

1.1 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU

Kiến thức lý thuyết: Củng cố các kiến thức sau: Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý,

hóa học đối với sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật

+ Nhân tố vật lý bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH

+ Nhân tố hóa học bao gồm: acid, base, muối kim loại, cồn

- Nguyên nhân gây nhiễm các dụng cụ là do sự tiếp xúc với không khí, các dụng

cụ hay vật phẩm có vi sinh vật

Kỹ năng thực hành: Hình thành và rèn luyện các kỹ năng:

- Bao gói dụng cụ và làm nút bông cho ống nghiệm

- Khử trùng dụng cụ và môi trường bằng nồi hấp áp suất cao và tủ sấy

1.2 MỘT SỐ DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH

1 Các dụng cụ thủy tinh

b Đĩa petri: gồm một nắp lớn và một đáy nhỏ úp

lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm,12cm

c Ống hút (pipette)

- Ống hút có chia độ

- Ống hút Pasteur

d Micropipettes đơn kênh (Pipetman)

Đây là pipet chính xác, cho phép ta hút được một

lượng chất rất chính xác

- Đặc điểm cấu tạo :

a Ống nghiệm: được sử dụng để chứa môi

trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút bằng gòn

không thấm nước hay bằng nhựa chịu nhiệt

Hình 1: Ồng nghiệm

Hình 2: Đĩa petri

Hình 1.1: Cấu tạo pipet, cách cầm pipetman (micropipet) và các tip tương ứng

- Đặc điểm phân loại:

Dựa vào thể tích lấy mẫu người ta chia micropipet thành 6 loại:

Bảng 1.1: Các loại pipetman và thể tích tương ứng

Bảng 1.1: Ví dụ sử dụng pipetman mix theo thể tích Chú ý:

- Cắm đúng loại tip của từng pipet (tương ứng với thể tích cần hút)

- Không dốc ngược pipetman khi đang hút hóa chất

- Không được chỉnh quá giới hạn thể tích qui định trên thân pipet

- Cuối buổi thí nghiệm phải điều chỉnh pipet về trạng thái nghỉ (giá trị lớn nhất hoặc nhỏ nhất )

e Các dụng cụ bằng thủy tinh khác: Becher, Bình cầu đáy bằng và đáy tròn, Bình tam giác (Erlen), Bình Roux

- Đầu tăm bông vô trùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi trường rắn

Những loại dây cấy này thường làm bằng kim loại không bị oxy hóa ở nhiệt độ cao

b Tủ ấm: dùng để ủ vi sinh vật hoặc theo dõi sự tăng trưởng của vi sinh vật

c Lò Pasteur (xem phần sau)

d Autoclave (xem phần sau)

e Nồi chưng cách thủy

1.3 BAO GÓI DỤNG CỤ

1 Nguyên tắc

- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô

- Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng

cụ trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

2 Phương pháp bao gói dụng cụ

Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:

- Làm nút bông: cho các ống nghiệm, bình tam giác

- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ khác

a Cách làm nút bông

- Với các ống nghiệm:

+ Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại

+ Ấn vào giữa cuộn bông Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm

+ Yêu cầu: Nút có kích thước và độ chặt vừa phải

Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong

Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng

sử dụng lượng bông nhiều hơn

b Cách bao gói dụng cụ: Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có nút bông bằng giấy báo để khi khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện

vô trùng tốt hơn Cách làm như sau:

- Cắt các đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói

- Quấn quanh phần đầu có nút bông

- Cột lại thật chặt

Yêu cầu: - Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt

Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ Có thể dùng hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ

1 - Khi khử trùng bằng nhiệt: các tế bào sinh dưỡng của VSV bị tiêu diệt dễ dàng

trong khi các bào tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó

Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:

- Tính chất môi trường, Số lượng tế bào, Độ pH của vật cần khử trùng

- Do vậy để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất

và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ VSV và bào tử của chúng

có trong dụng cụ cần khử trùng

- Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt

a Phương pháp nhiệt khô

➢ Khử trùng bằng tủ sấy: Được thực hiện trong tủ sấy

- Điều chỉnh thời gian và nhiệt độ thích hợp (160 °C trong 2h hoặc 180°C trong 30 phút)

Lưu ý: phải để nguội tới 60°C rồi mở tủ lấy dụng cụ ra Tránh mở tủ lấy dụng cụ khi nhiệt độ tủ còn cao sẽ làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ Các dụng cụ sau khi sấy mà giấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt

độ khử trùng cao làm bông và giấy biến thành gondron (hợp chất có tính sát trùng) thì không thể sử dụng dụng này để nuôi cấy VSVđược

➢ Đun sôi trong nước

Phương pháp này được sử dụng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc

Cách tiến hành: - Dùng nước sạch đổ ngập dụng cụ

- Đun sôi từ 10 phút đến 1h

➢ Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur)

Phương pháp này được dùng để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở nhiệt độ cao, chỉ có tác dụng ức chế VSV không có bào tử

Cách tiến hành: Đun nóng môi trường lên 65 – 70°C trong 15 – 30 phút

➢ Hấp cách quãng 100°C (phương pháp Tyndal)

Phương pháp này dùng để khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy men bánh

mì, men gia súc, mốc làm nước chấm

Cách khử trùng: - Hấp trong trường ở 100°C từ 30 – 40 phút

- Lấy ra để tủ ấm 24 giờ để cho bào tử vi khuẩn phát triển

- Hấp môi trường lần thứ hai ở 100°C trong 30 – 40 phút tiêu diệt các bào tử vừa nẩy mầm

- Lặp lại quá trình này 3 – 4 lần

Kết quả: môi trường vừa được khử trùng vừa được đảm bảo không thay đổi chất lượng

➢ Khử trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất cao (Autoclave)

Phương pháp này được thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao Đó là thiết bị làm bằng kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ và thời gian

Nguyên tắc hoạt động:

Làm tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van rất chặt chẽ Mối quan hệ giữa áp suất và nhiệt độ của nồi được biểu hiện qua bảng sau:

Phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến

và hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật

c Khử trùng bằng sự lọc

Sử dụng cho môi trường lỏng, trong, có độ nhầy yếu, không chịu được nhiệt

độ cao hơn 600C Cho môi trường đi qua một màng lọc xốp có đường kính lỗ nhỏ hơn đường kính của vi khuẩn Khi đó, vi khuẩn sẽ bị giữ lại trên màng lọc còn dung dịch đi qua sẽ vô trùng Màng lọc thường là màng cellulose

d Diệt trùng bằng bức xạ

- Tia tử ngoại: Bức xạ thường dùng nhất là tia UV Dòng tia UV diệt trùng không khí phòng bệnh viện, phòng vô trùng Tia UV chỉ khử trùng bề mặt mà không thấm sâu vào bên trong mẫu vật

- Tia âm cực: Diệt trùng các dụng cụ giải phẩu, thuốc, thực phẩm, tia âm cực có thể tiêu diệt các vật đã cho vào bao gói kín

BÀI 1

LÀM MÔI TRƯỜNG ĐỂ GIEO CẤY VI SINH VẬT

Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH

trong môi trường

Dựa vào nguồn gốc, trạng thái lý học, mục đích sử dụng mà người ta có nhiều cách phân loại môi trường:

1 Phân loại theo thành phần và nguồn gốc:

- Môi trường tự nhiên: dùng các sản phẩm tự nhiên để pha chế (sữa, trứng, khoai

tây, dịch chiết nấm men…) thành phần hóa học của các sản phẩm này không được xác định chi tiết và chính xác

- Môi trường bán tổng hợp: Ngoài các sản phẩm tự nhiên còn thêm một số hóa chất

có thành phần nhất định

- Môi trường tổng hợp: dùng hoàn toàn các hóa chất có thành phần xác định để pha chế

2 Phân loại theo trạng thái lý học:

- Môi trường lỏng: là dung dịch các chất dinh dưỡng hòa tan trong nước

- Môi trường đặc: là môi trường lỏng có agar (1,5 – 2,5%) hoặc gelatin (10-20%)

- Môi trường bán lỏng: 0,3 – 0,7% aga

3 Phân loại theo mục đích sử dụng:

- Môi trường cơ bản: thành phần môi trường không có gì đặc biệt, thích hợp cho

nhiều loại vi sinh vật khác nhau

- Môi trường riêng biệt: Chỉ thích hợp cho một số loài vi sinh vật nhất định

- Môi trường phân lập và chẩn đoán: chỉ thích hợp cho từng loài vi sinh vật nhất

định hoặc để nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền của vi sinh vật

& 1.1 LÀM MÔI TRƯỜNG

❖ Chuẩn bị dụng cụ, nguyên vật liệu và hóa chất

Dụng cụ:

- Cốc đong: 250ml, ống đong 250ml

- Bình tam giác 250 đã làm nút bông

- Micropipette 100-1000 µl , đầu típ tương ứng

❖ Tiến hành

1 Pha chế

Tùy theo mục đích phân lập, tiến hành cân đầy đủ các thành phần môi trường được ghi rõ

trong bảng ở bảng 1 vào cốc có thể tích ứng với thể tích cần pha Quá trình cân cần lưu

ý:

- Phải chuẩn bị dụng cụ, và hóa chất tập trung tại vị trí thao tác

- Nếu là môi trường đặc thì bổ sung aga sau khi đã chỉnh pH

Sau khi cân đầy đủ thành phần môi trường, bổ sung nước cất khoảng 4/5 thể tích môi trường Tiến hành điều chỉnh pH (bước 3)

2 Điều chỉnh pH

Mỗi loài vi sinh vật chỉ phát triển được trong một khoản pH nhất định Khi làm môi trường cần xác định pH và điều chỉnh cho thích hợp

+ Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường người ta dùng HCl 10 % hay NaCl 10

% Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3

+ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta nên dùng máy đo pH (pH - metre) Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao

3 Phân phối vào dụng cụ chứa

-Tiến hành đổ dịch môi trường vào cốc đong, bổ sung nước cất định mức lên đúng thể tích môi trường cần pha

- Phân phối dịch môi trường vào bình tam giác, cân và bổ sung 1,5 – 2% aga

Lưu ý khi phân phối môi trường :

- Tránh không cho dính môi trường lên miệng bình tam giác hay miêng ống nghiệm tại vị trí làm nút bông Có thể dùng phểu (Với việc chuẩn bị môi trường đặc phân phối vào ống nghiệm thì bổ sung aga vào cốc chứa dịch môi trường, phải đun chảy và làm tan đều aga, phân phối lâu thì phải dùng phểu lọc nóng để giữ môi trường luôn ở trạng thái lỏng)

- Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại (xoay sâu vào gần hết nút)

+ Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm

+ Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 - 1/3 thể tích của bình

+ Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc

4 Tiệt khuẩn môi trường

Chế độ tiệt khuẩn môi trường cho từng loại môi trường đều có ghi sẵn cùng với cách pha chế Tùy loại môi trường, tùy điều kiện cụ thể mà có thể tiệt khuẩn theo một trong những phương pháp sau:

- Phương pháp Pasto

- Phương pháp Tindal

- Phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa có áp suất nhở nồi hấp (autoclave)

5 Bảo quản và kiểm tra môi trường:

▪ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0 - 5 °C và không để môi trường bị khô

▪ Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37 °C, trong 48 - 72h Sau lấy ra quan sát, loại bỏ các ống

có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu

Bảng 1 Công thức pha môi trường

Tên môi trường Công thức

Thạch thịt pepton

(Vi khuẩn)

Cao thịt: 5g Pepton: 10g NaCl : 5 g Aga: 20g Nước cất: 1000ml, pH = 7-7,2 Hansen

& 1.2 BAO GÓI DỤNG CỤ

❖ Nguyên tắc

- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô

- Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng cụ trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

❖ Phương pháp bao gói dụng cụ

Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:

- Làm nút bông: cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que trang

- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ khác

a Cách làm nút bông

- Với các ống nghiệm:

Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại, ấn vào giữa cuộn bông Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm

Yêu cầu:Nút có kích thước và độ chặt vừa phải Lấy ra vào dễ dàng

Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong

- Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng sử dụng lượng bông nhiều hơn

b Cách bao gói dụng cụ

Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có nút bông bằng giấy báo

để khi khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn Cách làm như sau:

- Cắt các đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói

- Quấn quanh phần đầu có nút bông

- Cột lại thật chặt

Yêu cầu:

- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt

Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ Có thể dùng

hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng

BÀI 2

PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Trong thiên nhiên và trong các vật phẩm dùng để nghiên cứu thường chứa hỗn hợp nhiều loài vi sinh vật khác nhau, ta chỉ có thể nghiên cứu về nhu cầu dinh dưỡng, về trao đổi chất, về di truyền học và các đặc tính khác khi ta có được những vi sinh vật thuần

khiết

Vi sinh vật thuần khiết là giống vi vật phát triển từ một tế bào ban đầu riêng biệt Giống vi sinh vật thuần khiết thường được nhận từ canh trường vi sinh vật tập trung, canh trường này thường có được nhờ việc tạo ra các điều kiện chọn lọc Vì thế muốn có giống thuần khiết ta phải tiến hành làm hai bước:

- Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung

- Sau đó phân lập vi sinh vật thuần khiết

1 – Canh trường tập trung

Canh trường tập trung là canh trường trong số đó một loài (hoặc có khi vài loài) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn các loài khác về số lượng

Phương pháp chủ yếu để nhận được canh trường vi sinh vật tập trung là dùng môi trường chọn lọc hay điều kiện chọn lọc Để có môi trường chọn lọc ta có thể thay đổi thành phần môi trường, pH môi trường hoặc một vài loại nguồn dinh dưỡng chính như nguồn cacbon

và nguồn nitơ

2 – Canh trường thuần khiết

Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả vi sinh vật trong đó đều được sinh ra

từ một tế bào ban đầu Việc phân lập trên canh trường thuần khiết là bước đầu tiên vô cùng quan trọng trong quá trình nghiên cứu vi sinh vật

2.1 GIỚI THIỆU VỀ PHÂN LẬP

Phân lập là khâu quan trọng trọng trong quá trình nghiên cứu vi khuẩn Mục đích của phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clone thuần khiết để khảo sát và định loại Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc mang tính đặc trưng của từng loài vi khuẩn Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn Các nhà vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có

ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc

Hình thái khuẩn lạc

Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng

cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được

vô trùng trước khi sử dụng

❖ Nguyên tắc

- Tách rời các tế bào vi sinh vật

- Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: gồm các bước:

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu

- Phân lập các vi sinh vật thuần khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của vi sinh vật

❖ Các dạng mẫu cho nuôi cấy

- Dạng dịch mẫu đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích

- Dạng trên bề mặt môi trường rắn chứa thạch (1,5-2%) trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri

- Dạng mẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm (0,5-0,7%)

❖ Các thao tác vô trùng

Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng oxy hóa không khí tạo không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa…