BÁO CÁO THỰC TẬP-TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN VI RUT ĐÓM TRẮNG TRÊN TÔM BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR

Các đốm trắng xuất hiện trên vỏ đầu ngực của tôm bệnh 2.4.. Phương pháp chẩn đoán Để phát hiện mầm bệnh WSSV có trên tôm bằng nhiều ph ơng pháp khác nhau như:ƣ phương pháp mô học xác đị

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

VIỆN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH

CHẨN ĐOÁN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM

BẰNG KỸ THUẬT NESTED - PCR

Cán bộ hướng dẫn Huỳnh Đăng Sang

Tháng 9 năm 2012

Bài 1 BỆNH ĐỐM TRẮNG

1 Tình hình dịch bệnh đốm trắng tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây

Theo Chi cục Thủy sản Tiền Giang, năm 2010, số lượng thiệt hại bệnh đốm trắng trên tôm, gây thiệt hại 66.972.000 con/275,82 ha, chiếm tỷ lệ 8,3 % lượng giống thả nuôi và 12,1 % diện tích thả nuôi Năm 2011, diện tích tôm nuôi bị thiệt hại là 951,04 ha, chiếm tỷ lệ 18,3% diện tích thả nuôi Nguyên nhân chính là do hoại tử gan tụy (chiếm khoảng 70% diện tích thiệt hại), còn lại là do bệnh đốm trắng

Tại tỉnh Cà Mau, năm 2011, diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh 538,85 ha (đốm trắng 86,33 ha, hoại tử gan tụy 452,53 ha) Trong 4 tháng đầu năm 2012, toàn tỉnh đã có 555 ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng) bị chết, tập trung nhiều ở các huyện Đầm Dơi (với 234 ha tôm chết), Phú Tân (215 ha), Cái Nước (67 ha) và thành phố Cà Mau (38 ha) Tôm chết chủ yếu bởi các bệnh đốm trắng, hoại tử gan tụy

Trên địa bàn tỉnh Trà Vinh đã có 3.351 ha tôm nuôi, với gần 300 triệu con tôm sú bị chết tại các huyện Trà Cú, Cầu Ngang, Duyên Hải, Châu Thành, ước thiệt hại hơn 300 tỷ đồng Số diện tích này nằm trong tổng diện tích 19.323 ha, với hơn 1,5 tỷ con tôm sú đã thả nuôi đầu vụ đến nay tại các huyện trên Tôm chết trong giai đoạn từ 15 – 45 ngày tuổi, chủ yếu nhiễm bệnh hoại

tử gan tụy, đốm trắng và đầu vàng

Trong 8 tháng đầu năm 2012, mức độ thiệt hại nuôi tôm trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng đến nay

đã chiếm gần 50%, trong đó diện tích thiệt hại do bệnh đốm trắng chiếm trên 40%

2 Vi-rút đốm trắng (white spot disease virus)

2.1 Hình thái vi-rút

Virion có chiều dài dao động từ 210 đến 380 nm, bề dày từ 70 đến 167 nm Phần phụ giống như đuôi nằm ở một đầu của virion Phần vỏ của dày 6-7 nm được cấu tạo từ màng lipit gồm 2 lớp trong suốt được ngăn cách bới 1 lớp đục Phần nhân nằm bên trong có cấu trúc mạch vòng Kích thước của nhân có khác biệt giữa các isolate, chiều dài từ 180 đến

420 nm và bề dày từ 54-85nm

Hình 1 A) Hình thái của virion WSSV B) Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử cho thấy

phần phụ giống như đuôi (thước đo 250 nm) (Duran và ctv, 1996)

2.2 Bộ gen

Genome của WSSV là sợi đôi DNA dạng vòng, với lượng A + T chiếm 59% Kích thước genome khác nhau giữa các isolate, Thái Lan 293 kbp, Trung Quốc 305 kbp, Đài Loan kpb Kết quả phân tích trình tự cho thấy genome của WSSV có chứa từ 531 đến 684 khung đọc mở (open reading frame, ORF) với codon bắt đầu là ATG Trong đó, 181 - 184 ORFs mã hóa protein chức năng có kích thước từ 51 đến 6077 amino acid Khoảng 21 - 29 % ORFs mã hóa protein WSSV Các protein này gồm những enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp nucleic acid và nhân bản DNA như DNA polymerase, non-specific nuclease, tiểu phần của ribonucleotide reductase, thymidine kinase, thymidylate kinase Các protein có chức năng giả định gồm collagen - like protein, flagellin, chitinase…

Hình 2 Cấu trúc tổng quát bộ gen vi-rút đốm trắng (dòng Thái Lan)

2.3 Đặc điểm bệnh lý

Tôm bị bệnh có màu hồng đến hồng đỏ, xuất hiện những đốm màu trắng có đường kính từ

0,5-3 mm ở mặt trong lớp vỏ kitin vùng đầu ngực và đốt bụng thứ 5, 6 sau đó lan ra toàn thân Ở ao nuôi, tôm bị bệnh dạt vào bờ và có dấu hiệu bệnh 1 đến 2 ngày trước khi chết Tỉ lệ chết có thể lên đến 100% trong vòng 10 ngày kể từ lúc bắt đầu bệnh

Hình 3 Các đốm trắng xuất hiện trên vỏ đầu

ngực của tôm bệnh

2.4 Các con đường lây truyền

Bệnh đốm trắng do WSSV lây lan rất nhanh qua 2 con đường chính Lây lan theo chiều dọc, từ bố mẹ nhiễm lây cho con Lây lan theo chiều ngang, tôm nhiễm vi-rút từ nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang vi-rút từ ao này sang ao kia, từ dụng cụ sản xuất mang mầm bệnh, từ tôm chết, chim, cò vô tình đưa vào ao

2.5 Vật chủ mang mầm bệnh

WSSV đã được phát hiện cảm nhiễm nhiều loài vật chủ khác nhau Penaeus monodon,

P japonicus, P indicus, P chinensis, P merguensis, P aztecus, P stylirostris, P vannami, P duorarum và P setiferus; tôm càng xanh - Macrobrachium rosenbergii, cua - Calappa lophos, Portunus sanguinolentus, Charybdis granulata và C feriata.

2.6 Phòng bệnh

Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt hại

do bệnh đốm trắng Sự phòng ngừa gồm có các biện pháp sau: chọn tôm bố mẹ, tôm giống

có chất lượng tốt, không nhiễm WSSV, nguồn nứớc cấp cho ao nuôi tôm phải lắng lọc và khử trùng, vớt tôm chết ra khỏi ao, ngăn chặn không cho tôm và giáp xác khác vào ao nuôi, duy trì các yếu tố môi trường thích hợp cũng như chất lượng thức ăn tốt, khẩu phần ăn hợp

lý Nước nuôi tôm bị bệnh WSSV phải xử lý bằng Clorua vôi nồng độ (30 - 50 g/m3), không được xả ra ngoài Khi phát hiện bệnh tốt nhất là thu hoạch ngay

2.7 Phương pháp chẩn đoán

Để phát hiện mầm bệnh WSSV có trên tôm bằng nhiều ph ơng pháp khác nhau như:ƣ phương pháp mô học xác định bệnh dựa trên các thể vùi hiện diện trong tế bào biểu mô;

phương pháp lai tại chỗ (In situ hybridization) dấu hiệu xác định bệnh là kết quả lai giữa

đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong điều kiện nghiêm ngặt; phương pháp PCR xác định bệnh dựa trên là sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân gây bệnh; phương pháp Dot blot và Southern blot đ ợc thực hiệnƣ với sản phẩm của PCR; phương pháp miễn dịch huỳnh quang dấu hiệu định bệnh là kết quả kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, sử dụng kính hiển vi điện tử

Bài 2.LY TRÍCH DNA

1 Tổng quan về phương pháp ly trích

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân Thông thường người ta nghiền tế bào

hoặc mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và protein K Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, thường sử dụng dung dịch

phenol:chloroform

Bước 3: Kết tủa nucleic acid Mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận nucleic

acid dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung môi theo nồng độ mong muốn Hai cách kết tủa thông dụng là dùng ethanol hoặc isopropanol Trong cả hai phương pháp, nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn kết tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại

bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại

2 Thực hành

2.1 Phân nhóm

Sinh viên trong lớp (20 - 30 sinh viên) được chia thành 5 nhóm (4 - 6 sinh viên/nhóm) Mỗi sinh viên ly trích 1 mẫu

2.2 Chuẩn bị mẫu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị

Mẫu: mẫu tôm sú, tôm chân trắng được mua ở trại giống hoặc mua tại chợ (sinh viên tự chuẩn bị mẫu cho thực hành)

Hóa chất: SDS (sodium dodecyl sulphate) và NaOH

Dụng cụ:

 Kẹp, kéo, đèn cồn, khay đựng nước đá, bút ghi mẫu

 Micropipet 100 - 1000 µl

Thiết bị: Máy ly tâm, bếp điện

Vật tư tiêu hao:

 Chày vô trùng dùng nghiền mẫu trong tube ly tâm

 Tube ly tâm 1,5 ml đã hấp khử trùng

 Đầu côn xanh, vàng đã hấp khử trùng

 Găng tay, khẩu trang, khăn giấy

2.3 Pha dung dịch ly trích DNA thô

Dung dịch ly trích DNA thô có nồng độ NaOH 0,025 N, SDS 0,0125% (theo Kiatpathomchai và ctv, 2001) được pha theo các bước sau:

• Pha 100 ml NaOH 1N (MW=40)

 Cân 4 g NaOH hòa trong 100 ml nước cất 2 lần

 Hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

• Pha 100 ml SDS 0,5% (MW=288,38)

 Cân 0,5 g NaOH hòa trong 100 ml nước cất 2 lần

 Hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

• Dung dịch ly trích thô, thành phần như bảng sau

Dung dịch ly trích DNA thô 200 ml Nồng độ cuối

2.4 Ly trích DNA

DNA được tách chiết theo nghiên cứu của Kiatpathomchai và ctv (2001) Quy trình được

tiến hành như sau:

 Dùng kẹp lấy mang tôm cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch đệm ly trích thô DNA (0,025 N NaOH và 0,0125% SDS)

 Dùng chày vô trùng nghiền cho mẫu đồng nhất

 Thêm 300 µl dung dịch ly trích thô DNA, tiếp tục nghiền

 Đun sôi eppendorf ở 100oC trong 20 phút (thấy dung dịch trong mẫu sôi lên)

 Làm lạnh mẫu nhanh: chuyển eppendorf vào nước đá lạnh trong 5 phút

 Ly tâm ở 9.000 vòng/phút trong 5 phút Hút dịch nổi vào eppendorf mới Nên thực hiện phản ứng PCR ngay sau khi tách chiết Tuy nhiên có thể giữ mẫu ở -

20oC trong thời gian ngắn (khoảng 1 - 2 ngày)

Bài 3 CHẨN ĐOÁN WSSV BẰNG NESTED - PCR

1 Tổng quan về PCR

1.1 Nguyên tắc của PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau: biến tính (denature), bắt cặp (annealing), kéo dài (extension)

Hình 4 Các bước trong phản ứng PCR 1.2 Các hạn chế của phương pháp PCR

• Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất

Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước Có thể khắc phục 1 phần của vấn đề bằng các cách sau:

 Thiết lập phản ứng và phân tích sản phẩm khuếch đại được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau

 Dụng cụ để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác Sử dụng đầu típ có lọc khi hút hóa chất

 Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phần tử còn lại từ lần khuếch đại trước

 Chia nhỏ các thành phần phản ứng

 Sử dụng dUTP để thay thế cho dTTP Trước mỗi phản ứng, người ta thêm vào dung dịch phản ứng uracylglycosylase, enzyme này phân hủy tất cả các DNA có mang dUTP nhiễm từ lần trước Đồng thời, enzyme sẽ bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên

• Sự nhân bản không đặc hiệu

Xảy ra khi mồi bắt cặp không đặc hiệu với những trình tự khác vơi trình tự đích Một

số phương pháp để khắc phục

 Phương pháp “hot start” với đặc điểm chủ yếu là tránh sự tiếp xúc của các thành phần quan trọng trong phản ứng trước khi trình tự đích được biến tính hoàn toàn

 Phương pháp nested PCR sử dụng thêm 1 cặp mồi được thiết kế để bắt cặp với sản phẩm khuếch đại của lần thứ nhất

• Sai sót do Taq polymerase gây ra

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide) Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của 1 sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cấn xác định chính xác trình tự nucleotide Không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt bằng cách đảm bảo cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, sử dụng các DNA polymerase chịu nhiệt có độ

trung thực cao như VentTM, Pfu, Ultma DNA polymerase.

2 Thực hành chẩn đoán WSSV

2.1 Giới thiệu đoạn mồi

Năm 1996, Lo và ctv đã thiết kế 2 cặp mồi: 146F1/146R1 và 146F2/146R2, phát hiện sự hiện diện của WSSV bằng kỹ thuật nested - PCR Cặp mồi 146F1/146R1 khuếch đại đoạn bên ngoài với kích thước 1447 bp Cặp mồi 146F2/146R2 khuếch đại đoạn bên trong với kích thước 941 bp Quy trình này được tổ chức thú y thế giới (OIE) công nhận là quy trình chuẩn và khuyến cáo các phòng thí nghiệm sử dụng để chẩn đoán WSSV

Hình 5 Vị trí của primer 146F1/146R1, 146F2/146R2 và kích thước sản phẩm

(Lo và ctv, 1996)

2.2 Phân nhóm

Sinh viên trong lớp (20 - 30 sinh viên) được chia thành 5 nhóm (4 - 6 sinh viên/nhóm) Mỗi mỗi nhóm thực hiện 1 mẫu

2.3 Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ thiết bị

• Hóa chất thực hiện PCR:

 Nước cất

 PCR buffer 10 X

 Taq polymerase 5U/µl

 MgCl2 25mM

 dNTP 10 mM

 Primer146F1/146R1, 146F2/146R2 10µM

 DNA ly trích

• Dụng cụ, thiết bị

 Micropipet 0,5 - 10 µl, 10 - 100 µl, 100 - 1000 µl

 Đầu típ trắng, vàng, xanh

 Tube PCR 0,2 ml

 Máy luân nhiệt, tủ cấy vô trùng

Tên primer Trình tự

Vị trí của primer trên trình tự trên

GenBank AF440570 Kích thước

146F1 5’-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3’ 259206–259229

1447 bp 146R1 5’-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3’ 260629–260653

146F2 5’-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3’ 259457–259479

941 bp 146R2 5’-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’ 260376–260398

 Máy ảnh, găng tay, khẩu trang, khăn giấy

2.4 Thực hiện PCR bước 1 với cặp mồi 146R1/146F1

2.4.1 Tính thể tích các thành phần phản ứng cần hút

Thành phần phản ứng cho 1 phản ứng với tổng thể tích là 25 µl

• Để tính thể tích PCR buffer, MgCl2, dNTP, primer cần hút, chúng ta sử dụng công thức:

C1 x V1 = C2 x V2

C2: nồng độ cuối

V2: tổng thể tích của 1 phản ứng

C1: nồng độ đầu

V1: thể tích cần hút

Ví dụ: Cách tính thể tích primer cần hút

 Nồng độ đầu của primer là 10 µM (C1 = 10 µM)

 Nồng độ cuối của primer trong 1 phản ứng là 0,4 µM (C2 = 0,4 µM)

 Tổng thể tích của 1 phản ứng là 25 µl (V2 = 25 µl)

 Sử dụng công thức trên, suy ra thể tích primer 10 µM cần hút: V1 = 1µl

• Để tính thể tích Taq polymerase cần hút, chúng ta sử dụng tam thức:

1 µl Taq polymerase 5 U ? µl Taq polymerase Cần 1,5 U cho 1 phản ứng

Sau khi tính thể tích cần hút cho 1 phản ứng, chúng ta tính thể tích cần hút cho n phản ứng: lấy thể tích cho 1 phản ứng * n Lưu ý: không tính đối với thể tích DNA ly

trích và phải tính dư thêm 1 hoặc 2 phản ứng để trừ hao hụt trong thao tác

Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích cần hút (µl) Thể tích cần hút cho 6 phản ứng (n=6)

(µl)

-2.4.2 Thực hiện mix mẫu

Sử dụng micropipet để pha master mix chung, bao gồm các thành phần phản ứng trong 1 tube lớn (không hút DNA khuôn) Sau đó chia đều master mix vào n tube PCR 0,2 ml Cuối cùng, hút 1 µl DNA khuôn cho vào tube PCR 0,2 ml để được tổng thể tích 25 µl

Lưu ý khi thực hiện:

- Mix mẫu trong tủ vô trùng, phải vệ sinh tủ trước khi sử dụng

- Khi mix mẫu, đặt các tube hóa chất trên gel đá hoặc đá bào để giữ lạnh các hóa chất

- Các hóa chất như H20, MgCl2, PCR buffer, dNTP, primer đóng đá khi bảo quản ở - 20oC nên phải rã đông và trộn đều trước khi hút

- Taq polymerase rất dễ hỏng nên khi lấy ra khỏi tủ âm nên phải cho ngay vào master mix

và cất lại vào tủ âm

- Để tránh tạp nhiễm vào hóa chất, nên cất hết các hóa chất trước khi mở nắp các tube chứa DNA khuôn

2.4.3 Thực hiện chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt được cài đặt như bảng

2.5 Thực hiện PCR bước 2 (nested PCR) với cặp mồi 146F2/146F2

Sản phẩm PCR của bước 1 trở thành khuôn DNA cho PCR bước 2 khi thực hiện với cặp mồi 146F2/146F2 Cách tính thể tích thành phần phản ứng, thực hiện mix mẫu, chu kì nhiệt giống với bước 1 Sau khi thực hiện xong, sản phẩm PCR được điện di kiểm tra ngay hoặc trữ ở tủ âm

Lưu ý: vì bước 2 sử dụng sản phẩm PCR của bước 1 để làm khuôn nên khả năng bị tạp nhiễm từ mẫu này sang mẫu, từ sản phẩm PCR vào hóa chất là rất cao Khi thực hiện phải cẩn thận, phải cất hết hóa chất, đóng nắp hết các tube chứa master mix trước khi mở nắp tube PCR 0,2 ml

40

Bài 4 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

1 Tổng quan về phương pháp điện di trên gel agarose

Agarose là một trong các dạng của polysaccharide Các nhà sinh học phân tử đã khai thác đặc tính thể gel trong điện di để phân tách DNA Agarose sẽ tạo thành các hạt agarose sau khi tan ở nhiệt độ cao hoặc đun sôi trong vài phút Khi nguội lại, những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau Giữa các hạt có những lỗ rất nhỏ Kích thước của các lỗ này xê dịch chút ít theo nồng độ của agarose gel Trong điện trường, DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dương, vì DNA mang điện tích âm Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tao ra lực kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển của DNA DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, di chuyển càng chậm và ngược lại Nhờ vậy mà chúng ta có thể phân tách được các đoạn DNA trên gel agarose

Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử Chúng ta có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kĩ thuật nhuộm màu DNA với ethidiumbromide và chiếu tia UV

2 Thực hành phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose trong quy trình chẩn đoán WSSV bằng nested PCR

2.1 Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ

 Agarose

 Dung dịch đệm TBE 0,5X

 Loading dye

 Khuôn đổ gel và lược

 Bể điện di

 Bể nhuộm ethidiumbromide

 Micropipet 0,5 - 10 µl

 Đầu côn trắng

 Giấy bạc, găng tay, khẩu trang

 Máy ảnh

 Lò vi sóng

2.2 Tiến hành đổ gel

Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1% Để đổ gel agarose 1%, tiến hành cách bước sau: