Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm vi hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

Nội dung tài liệu được viết nhằm củng có phân lý thuyết của hai môn học: - Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường - Ví sinh ứng dụng trong công nghệ mồi trường dong thời cung cấp c

NGUYÊN THỊ SƠN - TRẦN LỆ MINH

TAI LIEU HUONG DAN THi NGHIEM

VI - HOA SINH UNG DUNG

TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG

|

PGS TS NGUYEN THI SON - THS TRAN LE MINH

TAI LIEU THi NGHIEM

VI - HOA SINH UNG DUNG

TRONG CONG NGHE MOI TRUONG

NHÀ XUAT BAN BACH KHOA - HA NOI

Mã số: 285-2008/CXB/03-57/BKHN

L Tài liệu được biên soạn gồm 4 phần cơ bản

2 Thí nghiệm Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

3 Thí nghiệm Vì sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

4 Thí nghiệm chuyền đề Xử lý sinh học nước thải

Phụ lục giới thiện một số dụng cụ, thiết bị cần thiết phục vụ cho các thí nghiệm trên (hiện có tại Viện Khoa học và công nghệ môi trường ~ Trường Đại học Bách khoa Hà Nội)

Nội dung tài liệu được viết nhằm củng có phân lý thuyết của hai môn học:

- Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

- Ví sinh ứng dụng trong công nghệ mồi trường dong thời cung cấp cho sinh viên một số kỹ năng thực hành trong nghiên cứu vẻ ví sinh vật cũng như

phương pháp phân tích một số chỉ tiêu sinh học quan trọng trong xử lý và đánh

giá chất lượng môi trường

Phần thí nghiệm chuyên đề giúp sinh viên bước đầu làm quen với các phương pháp xử lý sinh hợc Trên cơ sở vận hành, phân tích và tính toán các thông

số kỹ thuật thu được, sinh viên có thể đánh giá cũng như xử lý các sự cô phát sình

trong quá trình vận hành hệ thống xử lý sinh học nước thải

Chúng tôi hy vọng cuỗn sách này cũng có thể dùng làm tài liệu tham

khảo bô ích cho công tác đào tạo và nghiền cứu trong lĩnh vực công nghệ sình

học môi trường cũng như cho các cán bộ kỹ thuật các ngành liên quan

Do được biên soạn lần đầu, cuốn tải liệu không tránh khỏi còn những

thiều sót Chúng tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của bạn đọc và đồng

nghiệp để bổ sung và chính sửa khi tài liệu được tái bản

Các tác giá

Té bao vi sinh vật tuy nho bé nhưng trao đôi chất không ngừng Sự sống

của vi sinh vật được đặc trưng bởi hàng loạt các phản ứng chuyên hoá vật chất,

trong đó có những phan ứng thực tế không xảy ra trong ống nghiệm o điêu kiện

bình thường nhưng trong tế bảo ví sinh vật các phan ứng này xảy ra với tộc đô nhanh gấp hàng triệu lần nhờ những chất xúc tác đặc biệt: chất xúc tác sinh học

hay còn gọt là Enzym

I.1.1, Đặc trưng và một số Enzym được ứng dụng trong công nghệ

môi trường

1⁄ Những đặc trưng của Envm tr vi sink vật

Hệ Enzym của vi sinh vật rất đa dạng, phong phú Từ vì sinh vật có thẻ

thu nhiều Enzym khác nhau trong đó có những Enzym chi co 6 vi sinh vat như zenlulaza, razema7a

- Enzym tử ví sinh vật có hoạt lực cao hơn các Enzym tương tự ở động vật

và thực vật

- Vị sinh vật nhạy căm với môi trường nên khi thay đổi điều kiện sòng hoặc tác động bằng các yêu tố khác nhau có thê thay đổi hệ Enzvm và huạt lực Enzvm của chúng Nhờ vậy có thể tạo được các Enzym theo yêu cầu vơi hoạt lực cao

- So với các sinh vật khác, vi sinh vật phát triền nhanh hơn, tuy kích thước nhỏ nhưng hiệu suất sinh tòng hợp Enzym và tý lệ Enzvm trong tế bào

tương đối lớn nên hiệu suất thu hỏi Enzym cao quy trình sản xuất đơn gian

- Nguyên liệu sử dụng nuôi cấy ví sinh vật để thu Enzym rất rẻ tiền dễ

kiểm thường là các loại phụ phâm, nhé liệu Do đó giá thành Enzym từ vi sinh

vat thập hơn nhiều so với Enzym nguồn gốc động thực vật

3⁄/Một số Enzym được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ môi trường u⁄ Enaym Amyla:za

- Enzym Amylaza là Enzym có ửng dụng rộng rãi nhất Amylaza là tén chung chỉ một nhọm gỏm các Enzym có khả năng xúc tác thuy phân tỉnh bột thanh dextrin duong maltoza va ghicoza nhu œ - amylaza, B - amvlaza, elucoams laza, dextrinaza

- Amylaza c6 trong mot sé nam méc:

+ Aspergillus: 43p oryzae dsp san, Asp niger, Asp awamori

‘Rhizopus: RA delemar Rb paponium

© Mucor Af rout

Nam men cé kha nang tng hop Amylaza:

| Endomycopsis: F fthuliger, E species

1 Endomyces: Endonyces spe

Vi khuân có kha năng tông hợp Amylaza;

+ Bacillus: Bacthius wihnlis, Buc macerans

+ Vikhuan wa nhiét co hoat luc amylaza manh: Bac diastilicus, Bac cHCHhINS

Lrzvm Army laza con cé trong thue vat (hat nay mam, théc mam, hat malt khoai lang) trong dang sat (nude bot)

b/ Enzym proteaza

Proteaza co nhiều ö động thực vật và vi sinh vat Proteaza ở vị sinh vật t6n tại dưới dạng nội bào và ngoại bảo phần hu\ các liên kết peptit

Proteaza có ở vi khuân, xạ khuản và nam méc:

-Vi khuan tong hop Proteaza:

+ Bacillus: Bac subtilis, Bac thermophilus

+ Clostridium: Clost perfringen Clost, histolyticum

-NẤm mộc:

~ Aspergillus: Asp oryzae Asp fumigatus, Asp flavus

+ Penicillum: Pen janthinellum

Proteaza có trong thục val (promelin o qua dura, papain 6 qua du du xanh ), trong d6ng vat (tuy, tang da day )

Œ⁄ Enzym Pectinaza

Pectin là thành phân chính của lớp gian bào có chức năng kết dính các tế bào tạo thành mô thực vật

Pectin thực chất là axit Polygalacturonic được tạo thành nhờ liên kết œ - 1.4

— glycozit của axit D — Galacturonic, trong đó gốc cacboxyl ở vị trí C6 eó thể được metyl hóa Khi số lượng các gốc cacboxyl được metyl hỏa vượt quá 75%, pectin trở nên bên, không tan được gọi là Protopectin

Enzym thuy phan pectin thue chat gm 2 nhóm: Enzym thúy phân liên kết este (Esteraza) chuyên Pectin không tan thành pectin tan và Enzym thủy phân liên kết œ 1.4 — glycozit (Depolymeraza) thủy phân pectin tan thành axit

D - Galacturome

Enzym Pectinaza co y nghia rat lớn trong công nghệ môi trường đặc biệt trong xư lý chất thai răn (sinh hoạt và công nghiệp) có nguồn goc thực vật như vo qua, cudng rau chat thai nông nghiệp (thân lá vỏ hạt ) chúng phân hủy pectin giải phóng Xenllulo giúp quá trình chuyển hóa Xenllulo và quá trình vô cơ hóa xác thực vật xáy ra nhanh hơn,

Pectinaza chỉ có ở ví sinh vật nhất là Protopectinaza Hoạt lực Enzym

Pectinaza có thê được xác định băng phương pháp đồng (Cu) pectat

Vi sinh vật có khả năng tổng họp Peetinaza gồm nhiều loài nấm sợi và vi

khuẩn Một s6 loai ky sinh ở thực vật chúng phân giải pectin, phá hủy mô thực vật

và gây hư hỏng sản phẩm chúng có nhiều trong đất (10° té bao/g đất) Cac vi sinh vật có thé xâm nhập vào khối rác thải thực vật trong quả trình thu gom, vận chuyển làm thay đỏi tính chất cơ lý của rác gây khó khăn cho phần loại và xử lý rác

Một sỐ chung điên hình có hoạt lực PectinazZa:

- Mat sé loai nam da bao nhu Borytis cinerea, Fusarium oxysporum ky sinh

trén hau hét thao moc Envinia carotovora gay hu héng rau xa lách, carot cần

tay Enzym Pectinaza có thể được sản xuất nho Asp niger, Penicillum, Fusarium solani

- Một số vi khuẩn có hoạt lực Pectinaza mạnh như Bacillus macerams

Bacillus polymvxa mbt sé chung Pseudomonas (Pseud fluorescens), nhiéu vi

khuân dạ cỏ một số vĩ khuẩn ta nhiệt thuộc nhóm Clostridum (Clost pectinovorun

Clost felsmeun)

thuy phan zenluloza thành đường glucoza

Zenlulaza có trong xạ khuân nắm mốc và vì khuẩn:

Nấm mốc: Trichoderma reesei Tri lignoran Fusarium lini, Fus solani

Xa khuan: Streptomyces flagrogrisens

Vi khuan: Clost thennicillum, Cellulomonas sp Bacillus thermmospoza spe Các Enzym nói trên có vai trỏ rất lớn trong công nghệ xử lý nước thải và chất thải răn giàu các chât hữu cơ

Nhờ có hệ Enzym rất phong phú của vi sinh vật, các chất hữu cơ dưới dạng protein gluxit pecfin và ca zenlulo được chuyên hoá góp phần ôn định chu trình

tuần hoàn vat chat trong tu nhiên đồng thời góp phân làm sạch mồi trường

Các Enzym nói trên có vai trỏ rat lớn trong xử ly yếm - hiểu khí các chất

thải răn nước thải giàu chât hữu cơ

1.1.2 Phương pháp nuôi cây thu chế phẩm Enzym

Các vì sinh vật được sử dụng đẻ thu Enzym gồm nhiều loại nắm mốc, nắm

men vì khuân và xạ khuân bằng phương pháp nuôi bê mặt hoặc nuôi chìm

Như trên đã trình bảy, nhiều ví sinh vật có khả năng tổng hợp Enzym,

thậm chí có những ví sinh vật có kha năng tông hợp các Enzym khác nhau

trong các môi trường cỏ cơ chất khác nhau

Đề thu được Enzym từ vi sinh vật cần tiễn hành nuôi cấy chúng Hầu hết các vt sinh vật sinh tông hợp Enzym trong điều kiện có oxy Vì vậy, về nguyên tắc có hai phương pháp nuôi cấy ví sinh vật thu Enzym là:

- Nuôi cấy bẻ mặt

- Nuôi cây chìm

1⁄ Phương pháp nuôi bê mặt

Phương pháp này sử dụng chú yếu với các loài nắm mốc, xạ khuẩn và

nắm men có khuẩn ty thật hoặc khuân ty giả Enzym tạo thành dưới dạng

Enzym nội bảo

7

a) Nguyên tặc: Tạo môi truờng có hẻ mật riêng lớn (có độ xếp cao) và du dinh dưỡng cho hệ sợi cua nắm phát triên và sinh tông hợp Enzym

b) Nguyên liệu và yêu cầu đôi với môi trường sinh tông hợp Enzym Một trong những yếu tế anh hương quyết định đến sự sinh trưởng phát triển cũng như khả năng sinh tông hợp Enzym cua vi sinh vật chính là thành phần môi trường Môi trường dình duỡng phải đam bao có đu các thanh phản cân thiết có chứa CN, H O các nguyên tổ khoáng đa lượng như P, S Ca Mẹ K và trong một số trường hop còn có ca một số nguyên tố vi lượng hoặc các chất kích thích sinh trưởng và sinh tông hợp enzvm như axit amm., vac bazo pyrin (Adenin Guanin) bazo Pyrimidin (Timin, Xytozin }

Trong thực tế, môi trường nuôi cấy bẻ mặt có thê là môi trường tụ nhiên

hoặc môi trường bán tông hợp

Nguyên liệu co bạn đề phá chế môi trường nuôi bề mặt là cám gạo, cảm lua

mi vi chúng không chi chứa các chất hữu cơ khác nhau là nguồn cung cấp C

N mà còn chứa nhiều nguyên tô khoáng đa vi lượng và các yếu tổ sinh trương can thiết cho sự phát triển và sinh tông hợp Enzym như các axit amin vitamin Trong nuôi cấy ví sinh vật tổng hợp mỗi Enzym cân một tác nhân điều hòa sinh tông họp khác nhau, đặc biệt là các chất cảm ứng ví dụ dé thu Amylaza can tình bội, dextrin, thu Proteaza 14 peptit, protein, Pectinaza la !íx dratnectic

protopectin va Xenllulaza [a Xenllulo, CMC (Cacboxyl Metyl Cenllulo)

Trong thực tế sản xuất để giam gia thanh san phẩm nguyên liệu thường, được sử dụng là bột ngô pelatin bột carol cu cai và bot giay hay CMC Trong những trường hợp cần thiết eó thẻ bộ sung nguồn nitơ dudi dang hữu cơ (bột khô lạc khô đậu tương sữa bột ) hay về có như Amoônsunphat

(NH4)2SO4 NHyNO3 )

Các nguyên tố khoáng, nhất là P và S là những thành phần trong câu trúc

của nhiều hợp chất rất quan trọng trong trao đỏi chất cua vì sình vật như các

Nucleotit, Protein Lipit phức tạp và các Vitamin có thể bộ sung thêm dưới dạng các muối photphat (KHaPO: K›LIPO ) muối sunphat (MgSO:

(N H,)›SO: )

Một nguyên liệu không thể thiếu được trong nuôi cấy bẻ mặt là vật liệu làm tăng độ xốp tăng bể mặt tiếp xúc cho môi trường Nhờ vậy oxy cua không khí khuyếch tán tốt vào môi truờng giúp cho hệ sợi của nấm xạ khuân phát triển tốt đông nhất trong môi trụ ong nang cao hiéu qua sinh tong hop Lnzym

c) Các bước tiến hành lảm môi trường

Phỏi trộn nguyên liệu:

Thanh phan môi trường nuôi bề mặt gồm:

- Cam gao: 35 - 40%,

~ Trâu: 40 - S0°„

- Nguyén ligu cam ung: 10°

(bét ngd: 10 %, aeclatin: 10 % khé lac: 5%, CMC: 5 % bat carot: 5°}

- Môi trường dinh dưỡng cân có độ ầm khoang 65% Dé tao do am, co thé sw dung nước cat (rong phòng thí nghiệm), nước máy (trong sản xuất đại trà) bô sung vào mỗi trưởng va trộn déu

- Môi trường cần được khư trùng trong nỗi áp lực ở áp suất l atm trong

thời gian 30 phút

[tương hợp căn bô sung các chất kích thích sinh trương dạng hữu cơ nhụ anit amin vitamin cde nguyén liéu này được khử trùng riêng ở áp suất 0.5 atm treng 45 phat, sau đó bỏ sung vào môi trưởng

- Sau khu trùng môi trưởng được đê nguội dến nhiệt độ thường

đ) Cây và nuôi vì sinh vật

- Canh trường piêng phai là cạnh trường thuận khiết có thẻ o dang ran

hoặc lòng

- Vói nâm mốc và xạ khuẩn cạnh trường thuong dung lạ bao tụ được pha

loãng trong nước vô trùng với ty lệ 1% - 1900

- Sau khi cấy canh trường nuồi được trộn đèu Nếu nuồi quy mô lớn, môi trưởng được phân phối vào các khay hoặc dàn nuôi với lớp dây không quá Š em

- Thời gian nuôi cây thường từ 36 48 gid ty thude thoi gian tau Fozym cua mỗi loài vi sinh vật

- Nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng từ 28 30°C dộ âm: $§ — 6% Irong

LÔ - 14 giờ đâu, bào tú trường nở và này mầm, nhiệt độ môi trường nuôi ít

biến động Từ !§ 30 giờ tiếp theo hệ sợi nấm phát triền mạnh Quá trình hô

hap giai phóng năng lượng và nước làm cho nhiệt độ và độ âm môi trường tăng Nếu lớp môi trường dày cần được đảo trộn và làm thoảng khí đề cụng cấp oxy tá giải nhiệt Quả trình này cũng làm cho độ âm môi trường giảm, canh trường tời, XỐp

Chẻ phẩm Enzym thô thu dược có hệ sọi phát triền mạnh đồng đều tránh đề bào từ phát triển Nều năm mốc quá giả hoạt lực Enzym giảm rõ rệt 9

Chế phẩm thó có thể được sáy khô ơ nhiệt độ 43 - 45°C đến độ âm 8 - 13%

dé bao quan va su dụng

e) Tùnh chế Enzym

Dé thu ché phâm Enzym dạng tình khiết hơn, chẻ phầm Enzym tươi

(hoặc khỏ) duoc nghiên nhỏ để phá võ câu trúc sợi nâm giải phóng Enzym

Enzym được chiết trong môi trường nước với pH xác định băng dung dịch đệm tương ứng với mỗi loại Enzvm tỉnh chế có thê ở dạng lòng hoặc dạng bột sau khi được làm khô

Phương pháp nuôi bể mặt có ưu điểm lớn tà hoạt lực Enzym cao, công nghệ don gian có thẻ tự động hóa đễ trién khai Ỏ quy mô lớn: yêu cầu năng

lượng thập thiết bị đơn giàn, nguyên liệu rẻ tiên dễ kiêm nẻn làm giảm gia

thành san phẩm Sản pham dễ bao quản và vận chuyên phù hợp trong xử lý các chát thai răn giàu chất hữu cơ Tuy nhiên chê phâm Fnzym từ nuối cây bê mat co do tinh khiết thập hơn nuôi cây chím.,

Nuôi cay nam moc thu ché pham Enzm Amylaza va Proteaza bang Phuong phap nudi cay bê mãi

a) Chuẩn bị môi trường

+Can: - 8g cám gạo

- 10g trấu

- 3u bột ngõ (cho môi trường thù chế phâm Enzym Amylaza)

- 2ø gelatin (cho mỗi trường thu chế phảm Enzym Proteaza)

+ Trận đều chuyển hồn hợp vào binh tam giác 250 mÌ, bố sung nước cất

đến độ âm 6Ô — 65%, Nút bông

+ Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ ]1 (°C trong 30 phút

+ Để nguội đến nhiệt độ phòng

h) Cay VSV

Cay 1inl địch chửa bào tủ cua nắm mốc:

- Thu En⁄ym Amylaz2a: 214p "xanh

- Thu Enzym Protea⁄a: Asp.orvzac

c) Nuôi cấy VSV thu Enzvm: ở nhiệt độ 28 — 30°C trong thai gian 36 giờ

2/ Phuong phap andi chim

Phuong phap nuoi chim thuong due su dung voi cac tac nhan như nắm men vì khuẩn tòng họp Enzym ngoại bào Cũng có thê sử dụng nam moc, xa khuân đê thu hệ sợi chứa Enzvm nội bảo

10

a) Nguyên tắc: Vì sinh vật sinh trưởng phát triển và tông hợp Enzym trong môi trường lỏng được cấp khi và trong điều kiện vô trùng

b) Môi trường nuôi cấy

Khác với nuôi cây bề mặt môi trường nuối cấy chim thường là môi trường bán tổng hợp Nguyền liệu cho nuôi cáy chím thường ở dạng hỏa tan hoặc huyền phù

Nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng lá nước chiết ngỏ nước chiết nắm men Nguồn nitơ vô cơ và các nguyên tô khoáng được sử dụng như ở phương pháp nuôi bề mặt Các tác nhân cảm ứng thường được sư dụng ở dạng tỉnh

khiết hơn như tỉnh bột hỏ hóa, tỉnh bột tan pepton, casein CMC,

pH của môi trường được điều chình cho phù hợp vói mỗi loại Enzym và mỗi loâi vị sinh vật

c) Các bước tiền hành

Các cầu tử cúa môi trường được hòa vào nước và được đưa vào thiết bị khử trùng 2 vỏ hoặc dạng ống xoăn ruột gả Môi trường được khử trùng trực

tiếp băng hơi quá nhiệt ö nhiệt độ !18 — 125%°C trong thời gian 30 phút

Sau khư trùng, môi trường được chuyển sang thiết hị nuôi cây Trong nhiều truông hợp để trảnh nhiễm trung người ta thường kết hợp khử trùng trực tiếp trong thiết bị nuôi cấy

d) Cây và nuôi ví sinh vat thu Enzym

Môi trường được làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (28 — 30°C) thì cay vi sinh vat Với nắm mốc và xạ khuản có thê cấy bằng bào tứ nhiệt độ nuôi 28 -

30°C thời gian nuôi 36 — 48 giờ

Không khí được cấp liên tục trong quá trình nuôi cấy Đề tránh tạo bọt thái quá có thể bỗ sung vào môi trường một chút dầu phá bọt hoặc axit oleic đã khử trùng

Thiết bị khuấy làm việc liên tục đê tạo độ động nhất, giúp cho Enzym khuy ếch tán tốt vào mỗi trường,

Trong nuôi cây chìm Enzym tạo thành trong suốt quả trình phát triển của ví sinh vật đạne ngoại hào được khuxéch tản vào môi trường Lượng Enzym trong tế

bào chỉ chiếm 10 - (5% Vì vậy chí cần ly tâm hoặc lọc tách sinh khỏi là thu được

dung dịch chứa Enzym

Cá biệt có một số nắm trrốc sinh tổng hợp Enzym nội bảo (Glucooxydaza

ở nâm móc Asp niger), Enzym tổn tại trong cấu trúc của sợi nấm Trong

trường hợp này chi cần tách lấy sinh khối (sợi nấm), sau đó nghiền phá vỡ tế

bào đẻ chiết Enzvm như đối với canh trường bề mặt,

U1

Phương phán nuồi chỉm có thể áp dụng trọng phòng thí nghiệm với bình tạm piác và máv lắc hoặc với thiết bị nuôi hiểu khí quy mô nho, pilot như thiết

bi Bin stát Ô quy mô công nghiệp có các thiết bị lên men biểu khí với các dung tich Khác nhau,

Phương pháp nuôi chìm hiện đại hơn (để tự động hóa ở quy mô lớn) va cho ché pham Enzyim tinh khiết hơn Phương phản này phai được tiến hành trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt nén tu được chế phẩm tỉnh khiết, hoạt lực cao hơn [uvx nhiên đó cũng là khó khăn Không nhọ trong quá trình nuôi Vì lý đo nào do như thiết bị không thật kín thiết bị không hoàn toàn vô trùng có thể dẫn đến nhiém tạp khuẩn toàn bộ môi truông gua winh bi aging hhoan toan

Nhôi cay nam men thu ché pham placoamylaca hang phương pháp nuôi cay chim

a) Chuân bị môi trường

- Lấy ŠÚ mÌ môi trương long vào binh tam giae 250 mi dé nudi cay Endomxecopsrs., Nút bong

- Thanh trùng ở LIIˆC trong 30 phút

- Lay ra dé ngudi đến nhiệt độ phòng,

b) Cay nam men

Cas S mi canh tudng nam men Endomy copsis,

c) Nudi tren may leo nbiét dé 28 — 30"C trong thời gian 48 giờ

1.1.3 Xác định hoạt lực Enzym

1⁄ Định tính hoạt lực Enzym

a) Nguyên tặc: Định tỉnh hoạt luc Lnzym dựa trên kết quả đánh giá nhanh hiệu lục xúc tác chuyên hóa cơ chất cua En2vm thông qua diện tích vòng thủy phản hoặc phan ứng hóa học (tạo máu) của san phim với chất chỉ thị

b) Phương pháp tiên hành

Đẻ định tính hoạt lực Enzvm ví sinh vật thường được niềi cây trền môi trường thạch với co chật trong ưng, Sau một thời gian nuôi nhất định (24 - 36 gid), thir phan ung voi chat chi thi thích hop

Fnzym Ams taza: vot mat trường chứa tỉnh bột chỉ thị là dung dich Jot hoặc dung địch Lugol (chưa lòU,

[nzym Xenllilaza: vỏi mỗi trường chứa CMC chỉ thị là dụng địch Tot Enzym Proteaza: vôi môi truông chứa Gelatin hoặc sữa bột Hoạt lực Protein là vòng dịch hóa Gclatin hoặc làm mất màu đặc trưng cua sữa bột

12

Hoạt lục của Enzym Ams laza và Xenllulaza the hiện qua d6 lon cua đường kinh vimg mat mau voi lot xung quanh khuẩn lạc € ũng có thẻ định tính hoạt lực Amylaza cua chế phảm thỏ bằng cách thực hiện phản ứng giữa dị :h chiết Enzym với dung địch tỉnh bội tạo 1% rồi thử phản ứng với dung dịch lọt Phan ứng cho trau xanh đen là hoạt lực rat yeu, mau nau do thẻ hiện có hoạt lục ứ - amylaza Phan ứng mắt màu với lọt là có hoại lục Maltaza và Glucoamylaza mất mau

nhanh với tot thẻ hiện hoạt lực Amy laza cao (gồm œ — am laza và Glucoamylaza)

Phương pháp định tính có ưu điểm lớn là có thể phát hiện nhanh sự hiện diện cua [nzym nhưng chua cho phép đánh giá chính xác hoạt lực của Eazym

Chuẩn bị môi trường cho định tinh Enzym

+ Enzvm Amylaza: Mỗi trường Shapcc tỉnh bột

L Enzvm Proteaza: Môi trường gelatin

+ En7vm Zenlulaza: Mỗi trường Hutchison

Gieo cay tà MỐI FSV sinh tiny hợp tbn>\wn

+ Cay VSV có kha năng sinh tông hợp Amylaza Proteaza 2enlulaza

+ Nuôi ở nhiệt độ 28 - 30C trone 18h,

Nhàn xét và đánh giá kết qua

- Đánh giá chất lượng canh trường thu được bằng cảm quan: dịch hóa

tinh bét, gelatin

- Do đường kinh cua khuẩn lạc

- Đo vòng thủy phân và đánh giả kha nang sinh tông hợp FnZym của các ví sinh vật:

t Độ lớn của đường kính vòng thuy phan tinh bot

! Độ lứn của đường kính vòng thuy phan gelatin

+ Độ lồn cua đường kính vòng thuy phần CMC

2/ Định lượng ho tec Enzvm Ghicoamylaza

Amylaza là tên chỉ nhóm enzym có kha nang phan cất các liên kết

l3

+ Glucoamylaza (v- amyiaza) phan cat lién két a -1.4 - glycosit trong mạch amyloza thanh glucoza va thus phan amylopectin thanh glucoza va dextria gici han

+ 0 -1,6 - gÍycosidaza phân cắt liên két a -(.6 glycosit trong dextrin gidi hạn hoặc trong mạch Amhy lopectin

+ a-1.6- glycosidaza cùng với các Enzym khác thủy phân tính bột hoàn toàn thành glucoza

Amylaza nói chung và Ghivoamylaza nói riêng là những Enzym được

ứng dựng rộng rãi trong thực !ẻ, đặc biệt trong công nuhệ thực phâm trong sàn xuất rượu, bía nước giải khát, trong sản xuất dextrin, đường glucoza Trong công nghệ môi trường các vi sinh vật có hoạt lực Am laza được sứ dụng trong

xu ly chât thai răn nước thái chứa tình bột

a) Định nghĩa và nguyễn tắc xác định

- Định nghĩa hoạt độ Glucoamylaza: 7 đơn 9ị hoạt độ Glucoarnylaza là lượng enzym can thiết xúc tác thủy phản tính bội tạo thành | mg Glucoza trong thời gian [ giờ ở điều kiện tiêu chuân (môi trường đệm axctat với pH = 4.7 và

nhiệt độ 30°C)

- Độ hoat động (hoạt lực) cua Enzwm là đại lượng biểu thị khả năng xúc tac chux én hóa có chất của mỗi Enzym

- Nguyên tắc định lượng: Dựa trên khả năng thủy phân tính bột tạo thành

đường glucoza của En7zvrtmn Glucoamylaza Lượng glucoza tạo thành được định

luong bing phuong phap Luft - School câi tiến

b) Các bước tiến hành

* Thu ln:ym từ caHh trường Vĩ sinh vật

Thu Lnzvm tu cạnh trường nuôi cấi: bề mặt nấm mốc Axp avamori hoặc

Asp usant:

- Nghién nho che phẩm Enzym

- Can Sx ché pham đã nghiên nhỏ rồi chuyên vào bình định mức 50 mI

- Thêm Š ml đụng dịch đệm axctat, định mức băng nước cất đến vạch

- Giữ hỗn hợp ở 30°C trong 30 phút

- Lọc lấy dịch chiết băng giay loc băng vàng thu chế phẩm Enzym tính khiết, Thu EH>ym từ canh trường nuôi cấy chìm nám men Endomycopsis:

Lay 10 ml canh trường nudi nam men Endomycopsis ly tam 6 van toc

5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút dé loại sinh khối nắm men

14

Phan dịch thu được có chữa Glucaamylaza ngoai bao cua Endomycopsis

* Kae dink heat luce Encvm

Thuy phan tinh bat bang ché pham Enzym thu duoc:

- Cho vao binh tam giac 100ml:

+ 1 ml dich chiét Enzym

+ 2 ml dung dich dém avetat pH = 4.7

+ 10 ml dung dich tinh bat 1%

- Đặt bình vào thiết bị òn nhiệt Thực hiện qua trình xúc tác thủy phân

tinh bột ở nhiệt độ 30C trong thời gian ( giờ,

- Định tính hoạt lực Amylaza: thừ phản ứng với lột sau 3 phat, 5 phút, 15 phút

- Lay mau sau | gid va định luong duong khu

- Song song tién hanh thi nghiém kiêm chứng trong cũng điều kiện (đun sôi địch chiết để vô hoạt Enzym)

- Định lượng Glucoza tạo thanh bang phuong phap Luff— School cai tiền

* Tinh hoạt lực Enaym

Từ lượng Thiosunfat tiêu tôn trong phân tích tính được lượng Glucoza tạo thành và hoạt độ E.nzvm Glucoam+ laza theo biểu thức:

wih) f 33

mf

Hil dv Harp

trong đó: ae thé tich NasS:O; 0.1N chuan kiêm chứng mỉ

b: thé tich NasS-O; 0.1N chuẩn mẫu thuy phan, ml

3.3: dương lượng đường khử tính theo Na›Sa2› (Ì mì NasS5O› 0.IN~3 3 mg ghicoZq)

# hệ số pha loãng

m lượng Enzym xúc tác phan ứng (tính trơng ứng với màu khí chuân dường khi) gam

(;: thời tiun phan ứng, giờ

3/ Xac dinh hout lac Proteaza theo Ansan

Enzym Proteaza là nhóm Enzym xúc tác cho quá trình phân cát liên kết

peptit trong các mạch peptt hoặc protein (polypeptiÐ nhờ phản ứng thuy phân theo co chê:

1S

su dung trong su lý hoặc hỗ trợ vu Iv phan giai các chất thải răn, nước thải giàu protein như chất thai từ thuộc đa chế hiến thủy san phế liệu hoặc phụ phảm nòng nghiệp giảu protein (Khô lạc khô đậu tương khô bông .)

Mot yo vỉ xiHÍt vật có kha năng tổng hop manh Proteaza

- Các vi khuẩn:

+ Bacillus subtilis, Bac thermophilus, Buc, mesentericus

' Clotridium perfringens Clost, histoltiun

+ Pseudomonas acruginoca

- Cúc Nắm mốc:

+ dypergillus oryzae Asp funticatus, Asp flavus

| Penicillium ganthinellum, Pen Chrysogenum.,

Proteaza từ vi sinh vật tồn tại đưới dạng: Profeaza axit tỉnh trung tỉnh và kiểm tính,

a⁄ Định nghĩa và nguyên tắc xác định HẠP

Hoạt độ Proreaza (HđP) là đại lượng đặc trưng cho khả năng xúc tác phần giaf DrOf€IN tỏi pePLT và axit amin cua cac Enzym

HđP được biểu thị băng số đến vị profeaZa có trong Í g (hoặc Iml) chế phẩm Hoạt độ riêng cua chế phảm đuộc biểu thị bằng số đơn vị proteaZa trên Ime protein cua chế phẩm

Dịnh nghĩa: T đồn vị hoạt độ proteaza là lượng Enzym xúc tác thủy phân

protein thành các sản phẩm hoa tan trong TCA cho phản ứng tạo màu với thuốc

thừ Folin (tường đương với L tunol Tyrozin) trong Í phút ở điều kiện tiêu

chuân (pH = §,§ và nhiệt dd 30°C)

Nguyên tắc xác định hoạt độ Proteaza theo Anson: Enzym Proteaza có

kha nang thus phan Protein (Ciclatin, Casein, Hemoglobin ) tao thanh axit

amin Luong axit amin tao chanh trong phan ứng thủy phân được xác định bằng phan ứng tạo máu với thuốc thu Folin

16

Dựa vào thang chuân của Tyrozin đẻ tỉnh lượng axit amin thu được nhờ phan ung thus phan

b⁄/ Các bước tiễn hanh

1¿ Hoá chất dụng cụ

+ Dung dich NasCO; 0.5M

+ Dung địch đệm vạn năng pH — §,.5

+ Dung dich Gelatin 2%

+ Thuốc thư Folin

- Dung địch Tyrozin chuän 10” (1 nmol/m])

+ TCA (Triclo — axetat) 0.3M

2/ Thu Enzym Proteaza tir ché pham Enzym thé

+ Cân 3g ché pham thu được đã nghiền nhò rồi chuyên vào bình định

mức 50 ml

+ Thêm 5 ml dung dich dém van nang 0.1M pH = 5,5 và định mức đến vạch

+ ]Ac déu giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30°C trong 30 phút

+ l.ọc thu địch chiết Fnzym

3/ [hực hiện phan ứng xúc tác thuy phân Protein

+ Cho vào bình tam giác 100 ml: 2 mí địch chiết Enzym 2 ml dung dịch

velatin 2%

+ Cho con từ vào bình phản ứng và đặt vào thiết bị điều nhiệt có khuấy từ

+ Thực hiện phân ứng xúc tác thủy phân ở nhiệt độ 30°C trong thời gian

LŨ phút

| Dé dinh chi phan ứng thêm 4 ml TCA 0,3M để kết tủa proteìn dư và

các san pham thủy phân phân từ lượng lớn

+ Tiếp tục-giữ hỗn hợp ở 30°C trong 20 phút,

+ Lọc thu dịch thủy phan

Song song tiền hành thí nghiệm kiêm chứng trong cùng điều kiện

+ Cho vào bình tam giác 100 ml:

2 ml dich chiét Enzym

4 ml TCA 0.3M khuay déu trong 10 phút

Thêm 2 mì Gelatin 2%, khuấy đều và để 20 phút

4/ Dựng đường chuân TVr0zin

Từ dung dịch Tyrozin chuân (1 ;ưnol/ml) chuẩn bị dãy mẫu chuân có hàm lượng Tyrozin từ 0 0,3 kmol theo bảng sau:

¡ Chuân bị một dãy ống nghiệm gồm 8 dng:

+ Lay 1ml cua mỗi nồng độ chuẩn và lần lượt cho vào từng ống nghiệm,

~ Thêm vào mỗi ống nghiệm: § ml dung địch NazCO; 0.5M

| ml thudc thir Folin, tắc đều

+ Giữ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ 30°C

+ Đo cường độ màu của hỗn hợp bằng máy so màu quang điện ở bước sóng À = 670 nm véi cuvet day | cm

+ Dựng đường chuẩn từ kết quả đo được với trục hoành là hàm lượng

Tyrozin và trục tung là mật độ quang

5/ Định lượng axit amin có trong mẫu thủy phân và tính hoạt độ Proteaza + Lấy ] m] sản phẩm thúy phân (dịch lọc) cho vào ống nghiệm

+ Thêm vào mỗi ông nghiệm: 5 ml đung dịch NasCO: 0.5M,

1 ml thuốc thư Folin lắc đều

+ Giữ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ 30°C

+ Ðo độ chiết quang bằng máy so màu quang điện ơ bước sóng À = 670nm Hoạt độ Proteaza (HđP) cua chế phẩm duoc tinh bang biéu thúc:

HdP = Đ/, dv/g

im trong đó:

HP: hoạt độ Protedza của chế phâm Enzym don vi/g

D: số mol 1vrozin tương ứng với hiệu sổ hiệu số giá trị mật độ quang do diroc cua mau thi nghiém va mau doi chung

I2 ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO LUFF — SCHOOL CAI TIEN

-Dung dich Fehling |

- Dung dich Fehbling I

- Dung dịch: — tinh bét tan 1%

KI: 30%

H›SO.: 25%

~ Dung dịch Na;S›O; 0.IN

3) Cúc bước tiền hành

- Lây vào bình tam giác 50ml:

+ | ml dung dich Fehting I

+ 1 ml dung dich Fehling II

+ 2 mÏ nước cất

+ ] ml dung dịch mẫu cần phân tích

- Đậy binh tam giác bằng phếu thuỷ tỉnh Đặt bình lên bếp đun sôi nhẹ

tronp 2 phút (tính từ khi xuất hiện bọt khí đâu tiên) Sau khi đun sôi, nhắc bình

ra khỏi bêp để nguội đên nhiệt độ phòng Dung dịch hỗn hợp vẫn còn màu

xanh đặc trưng của Sunphat đông và xuât hiện két tha màu đỏ của oxyt đồng Ï (Cu›©) (nêu mẫu có đường khủ)

- Thêm vào hỗn hợp I ml dung dich H2SO,; 25%, | ml dung dich KI 30%; lắc đều và giữ trong 2 phút, hỗn hợp sẽ có màu vàng nâu

- Chuẩn iôt dư bang dung dich Thiosunfat chudn (Na7$203 0,1N) voi chi

thi hồ tỉnh bột 1%, sao cho hỗn hợp dung dịch chuyển từ mảu đen sang màu trăng sữa

- Làm mẫu đối chứng: tương tự mẫu phân tích nhưng thay vào Im] mẫu cân phân tích là Iml nước cắt

Chú ý:

- Nếu sau khi đun, hỗn hợp dung dịch có màu đỏ, như vậy là sunphat

đồng đã được sử dụng hết do lượng đường khử quá lớn Muốn định lượng

chính xác mẫu cần được pha loãng đến nồng độ thích hợp (< 50 mg/l)

19

- Nếu sau khi đun không thấy kết tủa oxyt đồng [ (Cu;O) màu đó thì cần

tăng lượng mẫu giảm lượng nước cải

4) Tinh ket qua

(ab) f.33

V"

.V= .1000 mg/I trong do:

X: dường khư, mgi

da: thê tích NasSsQOš U.TN chuẩn Điều trăng, mỉ

b: thê tích NaaS3Q; Ú,ÌN chuản mau phan tich, ml L; thẻ tích màu phản tích, nH

F: hệ xó pha loãng (Hẻu có) 3,3; đương lượng đường khư tính theo Na;Š›Öy

I3 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY

Nitơ amin là thảnh phần không thể thiểu được trong cấu trúc cua axit

amin, peptit và protein

Nito amin co trong cac san pham có nguồn gốc từ động vật, thực vật và

vị sinh vật

Nitơ amin trong liên kết peptit là thành phần chậm chuyên hóa và thường chiếm khoảng 16% protein thô

Nitơ amin có frong nước thai giau chat hữu CƠ CÓ nguồn gốc từ quá trình

chế biến thịt cá, trừng sữa, san xuất các loại mắm nước chấm, đồ hộp thịt cá, thuộc da nước thải lò mỏ nước thai chăn nuôi gia súc Trong phần giai vếm khi, nito amin được khư đề tạo thành NH; từ đó hình thành NH trong môi

trường long Trong phân giải hiểu khí xử lý nìtơ amin đòi hỏi lượng oxy cho

quá trình oxy hỏa rất lớn

Qua trinh phan giai nito amin là quá trình rat quan trọng trong vu Iv nude thai chat thai ran gidu axit amin va protein

I/ Neuyén tắc địnH lượng H7 GHÌH bằng phương pháp Lowry

a Nguyen tặc

Hàm lượng nito amin ty lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu phân tích

Nitơ amin được định lượng gián tiếp qua phản Ứng tạo màu giữa pre?ein

và thuốc thir Folin

20

Cưởng độ màu cua hồn hợp phan ứng được đo bằng mật độ quang ớ bước sóng 2 = 750 nm

Hàm lượng nito min được tính dựa vào đường chuan cua protein tinh

khiết với thuốc thir Folin

bh Hod chat

- Dung dịch protein chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml

- Dung dich A: dung dich Na;CO; 2% pha trong NaOH 0,1N

- Dung dịch B: dung dich CuSO, 0.5% pha trong Natrixitrat [34 hoặc hali-natritactrat 1%

- Dung dich C: Hén hop dung dịch A và B theo ty lệ thê tích 50 : 1 (chỉ pha truọc khi dùng)

- Thuốc thư Folin

2/ Củúch tiễn hành

a Dime dione chinin

- Chuan bi day mau chuan (8 mau) voi néng dé tang dan tir 0 + 0.3 mg theo bang sau:

“Luong Protein ang) o | 603 | 003 | a1 | 015 | 02 | 025 | 03

- Thêm vào mỗi ông nghiệm:

+ 2 ml dung dịch C, lắc đều thực hiện phán ứng trong L0 phút,

t Sau 10 phút, thêm 0.2 ml thuốc thir Folin, lắc đều đề yên 30 phút

- Ðo độ chiết quang băng máy so màu ở bước sóng 2= 750 nm

- Dung đồ thị chuẩn từ kết quả đo được:

+ Trục tung biểu thị mật độ quang (ABS)

~ [ruc hoanh biéu thi luong Protein (mg)

Dé thi co dang C=kX +B

b Xác định lượng protein có trong mau cun phan tích

- Pha loãng mẫu phản tích sao cho hàm lượng protein trong khoảng 0.01 + 0,075 mg/ml

- Lay vao ống nghiệm 4 ml dung dịch mẫu cần phân tích

- Thêm vào ông nghiệm:

+ 2 mÌ dung dịch C lắc đêu thực hiện phản ứng trong LŨ phút

+ Sau 10 phút, thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều để yên 30 phút

- Mau vàng của hỗn hợp sẽ chuyên sang màu xanh da trời và đạt cường

độ màu cực đại sau 30 phút

- Đo độ chiết quang của hỗn hợp trên máy so màu ớ bước sóng À = 750 nm

- Lượng Protein cua mẫu phân tích được tra theo đường chuẩn

* Chụ ý Phan ứng xay ra ở nhiệt äo phòng

c Tinh ham lương nito amin

6,25: hé so quy chuẩn nite amin theo Protein

1.4 BINH LUONG TONG NITO BANG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

Nitơ tồn tại trong các hợp chat him co dudi dang Nito amin (- NH) va

imin (- NH - ) duoe goi 14 nito hitu cơ Nitơ hữu cơ gồm nito trong axit amin, amin, amit imit cdc peptit va protein

Phương pháp Kjeldahi được sử dụng để xác định N ở trạng thái oxi hoá - 3

bao gém cà nite hitu co va nito amon.

I.4.1 Nguyên tắc định lượng và các yêu câu

1⁄ Nguyên tắc: Trong môi trường axit dic (H2SO,) và có mặt hỗn hợp

xúc tác (K:SOx CuSO¡ Se) nito hữu cơ và nitơ amoniac dược chuyền hod

thanh nita amon (NH, )

Giải phóng amoniac từ amonsunphat trong môi trường kiệm mạnh va hap

thụ bằng dung dịch axit boric

Lượng mon được định phân bằng axit chuân hoặc bằng phương pháp

trắc quang

2⁄ Lấy mẫu và bảo quan

Mẫu cần được phân tích càng sớm càng tốt Thời gian lưu mẫu tốt nhất không quá một ngày và tránh đẻ mẫu hấp thụ aneoniac từ môi trường Có thê sử dung bình polyetylen hoặc bình thuy tỉnh dé đựng mẫu

Trong trường hợp khong thé phan tích ngay, cần axit hoá mẫu bằng HạSO,

đặc tới pH = 2 và báo quân ở 4”C,

3⁄ Những điều cần lưu ý

Nitrat (NOs): néng độ > 10 mg/l cd thé gay sai số âm do sy oxi hoa amoni trong quá trinh pha mau tao thanh N3O va gay ton that nito amon Nitrat cũng có thê bị khư thành amoni khi mẫu có chứa nhiều chất hữu cơ ở trạng thái oAí hoá thấp và gây sai số duong

Các muỗi vò cơ cũng cỏ thê ảnh hướng tới kết quả do có thê ảnh hưởng

tới nhiệt độ cua quá trình phá mẫu, Quá trỉnh amon hóa xảy ra hoàn toàn và hiệu qua o nhiét dd 380°C

khi mẫu có ham lượng muỗi và chat rin cao, nhiệt độ của dung địch hỗn

hợp có thê lên đến 400°C, gây tôn thất nitơ Đề hạn chế ảnh hưởng này cần bổ

sung HsSQO, dace voi tilé théng thudng khoang | ml/g mudi

I.4.2 Các bước tiền hành

I/ Hod chat

Su dụng hoá chất tỉnh khiết phân tích và nước cất không chứa amoni dé chuẩn bị thuốc thứ

- Dụng dịch H›SO¿ đậm đặc (98%, d = I,84 g/em”)

- Xúc tác: K›SŠOx : CuSO, : Se vai ty té khối lượng J00 : 10: I

Dung dịch NaOH 40%: hoà tan 400 g NaOH phân tích bằng nước cất không amon định mức tới 1 lit

- Chỉ thị Taxiro: trộn 100+nÍ dụng dịch metyl do (0.2 gam metyl do trong 100

ml cén 95") vai 50 ml dung dich metyl xanh (0.1 g metyl xanh trong S0 ml cản 959)

- Dung dich axit boric/chi thi: hoa tan 20 g axit boric H:BO): trong nước,

Thêm 10 ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp rồi pha loãng thành J li

- Dung địch HCI tiêu chuân: 0.1 mol/l Chuẩn bị từ dung dich HCI

dac (d = 1.18 g/cm’) hoặc pha từ ông chuân

- Dung địch HCI tiêu chuẩn 0.02 mol/I Pha loãng từ dung dịch chuẩn 0.! mol/l va dinh chudn bang phương pháp thông thường

Chuân bị nước cất không amoni: có thê sử dụng ] trong 2 phương pháp sau:

- Cho nước đã cất (2 lân) chảy qua cột nhựa cationit axit mạnh và chứa

nước thu được trong bình thuy tỉnh có nút nhám Thêm vào bình 10 g cationit cùng loại cho mỗi lít nước

- Phương pháp chưng cất: thêm 0.10 + 0.01 m1 H;ạSO¿ đặc vào 1 lít nước cất và cát lại trong máy hoàn toàn băng thuy tỉnh Bỏ §0 mÍ nước hứng đầu tiên

và chứa nước vào bình thuỷ tính có nút nhám Thêm khoảng TÚ g cationit axit

mạnh cho mỗi lít nước thu được

Vô cơ hỏa mẫu phân tích:

+ Lay thể tích mẫu thích hợp cho vao binh Kjeldahl, thêm 10 ml axit

Thiết bị phá mẫu (DK 6 DK8§S, DK20 ) trong hệ thiết bị phân tích Nitơ tự động hoặc bán tự động VEI.P được trang bị hệ thống tách và hấp thụ khí ô nhiễm

- Chung cat va hap thụ NH::

Chuan bi binh hap thu: Lay 50 ml dung dich axit boric thêm vài giọt chi

thị vào bình hứng của máy chưng cất Í ưu ý; đâu mút của ống dẫn ra từ sinh hàn phai nhúng ngập vào dụng dịch Trone bình hứng váy ra quá trình phân ly

cua H;BO; > HBO- + H-O

Chung cat va hap thụ NH::

+ Thêm cần thận khoảng 250 mÌ nước cất vào bình đã vô cơ hoá cùng vài hạt đá bọt lắp bình vào máy chưng cắt

+ Thém 3 giot chi thi phenoiphtalein

+ Thêm 50 ml dung dich NaOH vao binh chung va khoa phéu nhanh dé tranh NH; thoat ra ngoài Chú ý; Sau khi thêm NaOH dung dich trong binh phải có màu hồng (để đảm bảo dư xút)

| Chay nude làm lạnh và đun nóng bình cất

+ Dừng cất khi đã thu được khoảng 200 ml ở bình hứng Kiểm tra 1 vai giọt cuối cùng băng T - 2 giọt thuốc thư Nessler nếu vẫn có máu vàng thì quá

trình cất chưa kết thúc

Khi cất dam NH; bi kiém day ra khoi (NH4)2SO4 sé phan tng voi HBO:

NH,OH + HBO: > Nifty + BOs + 10

- Dinh phan Nito:

| Chuan dé phan hime dược băng dung dịch chuân HCI hoặc !ạSO, 0.02 N

cho đến khi đụng dịch chuyên từ mâu xanh lá mạ sang máu xanh tím

+ Có thể chuân độ bằng dung địch HC1 0.1N đối với mẫu có nông độ nít0 cao

BOy + H > HBO;

Bộ chưng cất và chuẩn độ tự déng (UDK 126, UDK 132 UDK 142, .)

có hệ thông chưng cất tự động an toàn và độ tin cậy cao Hệ thống cé thé dé dàng kết nỗi với chuân độ tự động và cho kết quả trực tiếp Các thông số cua quá trình chưng cất và chuân độ tự động được cài đặt chương trình

Lap lai quá trình đối với mẫu trắng trong đỏ mẫu thử được thay băng nước cát không chứa amoni

2§

3⁄ Tỉnh kết quả

Nông độ nito K)eldaìh /X mg/1) được tỉnh theo công thức:

VY ry

tò TT =, 14.00.1000 mel trong đó:

V4: thé tich mau lay phan neh, ml

Ly: thẻ tích HCI tiêu chuẩn chàng đẻ chuản dé mau, nil:

E?: thê tích HC tiêu chuẩn chóng đề chuẩn ch) nấu trang, mỉ:

Cnr nong do axu HC) chudn dime dé chuan do, mol/l:

14.01: khoi heong neuven ne cua nite

Lưu ý:

- Trong quả trình vò cơ hoá các khi độc như SOa, Ha§, HCN có thể sinh

ra vì vậy cần tiễn hành vô cơ hoá mẫu tronp tủ hút hoặc phải lắp đặt bộ phận

1.5 ĐỊNH LƯỢNG TỎNG PHOTPHO BÀNG PHƯƠNG PHÁP TRÁC QUANG

I 5.1 Nguyên tắc yêu cầu lấy mẫu

1 Nguyên tặc

Định lượng tông Photpho hãng phương nháp trắc quang dựa trên phản

ứng tạo phức antimonx photphomolipdat giữa octophotphat với molipdat va

anfimony trong mỗi trường axIt

Khu phire antimony photphomolipdat bằng axi ascobic thành phức

molipden có màu xanh đậm Đo độ chiết quang của dung dịch sẽ xác định được nồng độ ocfophorphat

Trước khi phân tích toàn bộ photpho hữu cơ và vô cơ trong mẫu được

chuyên về dạng octophorphat,

26

2⁄ Lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Dụng cụ chứa mẫu:

+ Tốt nhất là chai thuy tỉnh đặc biệt khi hàm lượng photpho thấp nhất

thiết phải dùng chai thuy tinh,

+ Cé thê sử dụng chat PE, PVC

+ Chai chứa mẫu phải được rừa sạch bằng axit HC] 2M (nóng) sau đỏ trắng nhiều lân băng nước cất Tuyệt đôi không sử dụng chât tây giặt chứa

photpho đê rưa chai đựng mẫu

- Xu ly va bao quan mẫu:

Loc mau:

- Mẫu dùng đê xác định photphat hoả tan phải lọc ngay sau khi lắv mẫu

+ Màng lọc có cỡ lỗ 0.45 tưn được rưa băng 200 mÍ nước ẩm để loại bo

photphat trên giấy lọc,

+ Loc mau qua mang da xu ly bo 10 ml mau loc dau tién va thy phan con lại vào lọ thuy tính sạch, khô

Bảo quản mẫu:

+ Mẫu được bảo quân ở 4°C và tốt nhất nên tiến hành phân tích trong

thời gian không quá 4 giờ sau khi lẫy mẫu

+ Đối với mẫu xác định tông P: thêm 1 mI ÍICI đậm đặc/1 lít mẫu, bảo

quản lạnh trước khi phân tịch

I.5.2 Hóa chất và thiết bị

- Dung dich photphat géc 50.0 tự PO,” : hoa tan 219,5 mg KH¿PO¿ bằng

nước cất và định mức tới I Lit

- Dung địch photphat chuẩn: pha loãng 50.0 ml dung dịch photphat pac thanh Lit băng nước cất | mÍ dụng địch này chứa 2,50 ng P

- Tác nhân khư (E)

37

- Dung dich 11:80, 5 N (A}: Pha lodng 70 ml H-SO, dam đặc bang nước

cát và dịnh mức tới S00 mỊ

- Dung dich Amoni molipdat 40 ø/l (H): hoà tan 20 ø (NH:}»Mo;O;¿.4H2O

và dinh muc tdi 500 ml bang nude cat Bao quan dung dich trong chai sam mau

- Dune dich Kali antimon tartrat 2.743 g/l (C): hoa tan 1.3715 g

K(SbOJC HO«.1/2H2O băng nước cất va dinh mirc thanh 500 ml Bao quan

dung dich trong chat sam mau

- Dung dich axit ascorbic 0.1 M (D): hoa tan 1.76 g axit ascorbic trong

100 ml nuée cat Dung dich nay dn dinh khoang | tudn o 4°C,

- Dụng dich hén hop (t:): on SO ml dung dich A, 15 ml dung dich B 5 ml dung dich C va 30 ml dung dịch D Dung dịch này ôn định trong khoang 4 h Lim Ý- Đề các chng dịch trên đạt đến nhiệt độ phòng trước khi trộn Nếu

dụng cụịch hồn hợp đục, lắc đều và đề vên vài phút đến khi trong trước khi dùng 2/ Thiết bị

3/ Chu ÿ

- Asenat phan ứng với molipdat tạo phức màu xanh giống như phức của photphat gây sai số đương Ở nông độ Asen là 0.1 mg/1 bắt đâu có ảnh hưởng

tới việc xác định photphat

- Nông độ Fe`” > I5 ppm sẽ cán trở đến quá trình khử tạo thành màu xanh nêu nôns độ lên đên 30 ppm thì màu xanh không xuât hiện

- NÓ+ Cí”” gây sai số âm: khoang 3% ở nồng độ ! mg/l và giảm tới 15%

Lập dãy mẫu chuân gồm it nhất 6 mẫu theo bảng chỉ dan Lay vao binh

định mức 50 ml lần lượt các dung dịch theo chỉ dẫn ở bảng sau:

28

2⁄/ Tiến hành phan ich

- Lay 100 ml mau da lac déu

- Thêm | mf H2SO, dae va 5 m! HNO; dac Dun nhe mau toi thé tich khoang | ml, sau dé dun tiép dén khi mat mau dé dudi hét HNO3

- Làm lạnh và thêm khoang 20 ml nude cat, | giot phenolphthalein, sau

đó trung hoà băng NaOH |N dén mau héng nhat Dinh mire dén 100 ml, lọc bỏ

can (néu có)

- Hút thê tích mẫu vào bình định mức 50 ml sao cho nồng độ photpho nằm trong đường chuẩn (tôi đa là 40 ml) thêm 8 ml tác nhân khử E Định mức

bang nước cất tới vạch Đề yên 10 phút

- Do độ hấp thụ cua mẫu ở bước song 2 ~ 880 nm

- Song song tiền hành với mẫu trắng trong đó phần mẫu thử được thay

bằng nước cất

Đôi với mẫu có độ đục và độ máu cao, cần hiệu chính bằng cách sử dụng

mẫu trăng thêm tất cá các tác nhân trừ (C) và (Ð) Độ hap thu cua dung dich

nay phai duoc trir di trong phan tinh toán

ye , ne

}

trong đô:

À- hàm lương P có trong máu phản tích, mg/l

mụ lương P cả trong bình tương ứng với thẻ tích đã hút g L2 thẻ tích máu lấi trong phản tích mỈ

1.6 DINH LU'ONG LIPIT BANG SOXHLET

Lipit là thuật ngữ chung đẻ chị dầu mỡ nguồn gốc động thực vật Về cấu trúc hóa học lipit là este của axit bẻo no hoặc không no với rượu đơn hoặc đa chức

Các axI béo nọ có công thức chúng CnHxO; như axit Palmitic C;¢6H320.,

axit Steric C¡sÍ 13C»: "` axit béo không no có công thức chung CaHsn,mO; (m là

số nối đôi trong liên kết) như axit Oleic €¿sH:O› (1 nối đôi) axit Linoleic

€CayH2O› (2 nối đôi), axit Linolénie CịgH:eO» (3 nội đội)

Rượu đơn chức, rượu mạch thăng phân tư lượng lơn mạch vòng nhu Cholesterol Estradiol Testosterol và đa chức như G]yxerin

Lipit tồn tại đưới hai dạng:

- Lipit đơn giản:

+ Cac Triglyxerit: Este cua Glyxerin và 3 axit béo

+ Các Sterit (sáp): liên kết este giữa rượn phân từ lượng lớn với axit béo

+ Các Steroit: liên kết giữa Sterol và axit béo

~ Photpholipit: giữa Glyxerin với 2 axit béo và photpho

- Lipit phire tap: gam Lipoprotein, Glycolipit

Photnholipit và các lipit phức tạp đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc

cua các mô liên kết ö cơ thể động vật

Lipit không tan trong nuộc, chúng có phân tử lượng rất lớn, đặc biệt là

các lpn phức tạp nên rất khó phân huy, kê cả phân húy hiểu khí nhờ các vị

sinh vat co hoạt lực Lipaza

Dầu mỡ động thực vật có trong chất thải răn, nước thải sinh hoạt, một số

loại nước thai công nghiệp nhờ nước thai lò mô chế biến thủy hải sản, chế biến

thịt, sữa các hạt có dấu

Việc nhân tích vác định hàm lượng lipit trong nước thải và chất thai ran

có ý nghĩa quan trọng đẻ quyết định phương án công nghệ trong tiền xử lý và

trong quá trình xư lý các chất thải Phương pháp phô biên để định lượng dau

mở động thục vật lä phương pháp Soxhlet

30

1.6.1 Nguyên tắc

~- Dựa vào khả năng đễ tan của Lipit trong dung môi hữu cơ như etanol, benzen, metanol, elorofooc, toluen, diclometan, axeton, (Dung môi yêu cầu

có nhiệt độ sôi thấp, trọng lượng nhỏ)

- Lipit được định lượng trên cơ sở xác định khói lượng mẫu phân tích

trước và sau khi chiết lipit bằng dung môi hữu cơ,

Một số vitamin và tạp chất tan trong chất béo cũng được chiết cùng với

lipit nhưng trong đa số trường hợp là không đáng kể

1.6.2 Hóa chất và thiết bị

~ Dung môi hữu cơ: Etanol

~ Máy chiết Soxhlet

Hệ thống tự động Soxtherm (S 306 AK/S 306 A) được thể hiện trên hình

II.1 Hệ thống này đơn giản và tiết kiệm thời gian so với máy Soxhlet truyền

1 Van tháo dung méi 6 Vỏ bọc hình trụ có thẻ chịu áp

2 Cốc chiết bằng thủy tỉnh, 54x30 mm 7 Bình ngưng bằng thủy tỉnh

3 Ong chiết đựng mẫu, 33x80 mm 8 Kẹp hình trụ

4 Kẹp giữ cốc chiết 9 Cấp khi nén

5 Công tắc kiểm tra khí nẻn, thu hỗi dung môi 10 Công tắc kiêm tra khí nén, nâng

và đặt cốc xuống

3]

1.6.3 Các bước tiền hành

- Chuân bị cốc chiết Cốc chiết (2)

được sây ở 103°C trong tu say Sau đó được

làm nguộ

đến nhiệt độ phòng trong binh hút

âm và cần trên cân phân tích (mi g)

- Các bước tiền hành:

+ Cân khoảng Š

tích (m g) cho vào ér sam mẫu cân phân chiết, Mẫu có thể

được làm khỏ nếu cần thiết

Da

khoang 140 ml dung mai vào cốc chiết (2)

ống chiết vào cốc chiết và thêm

Đối với hệ thống Soxthcrm quá trình

chiét được cải đặt bởi chương trình và gồm

5 giai đoạn đê đâm bào mầu được chiết

hoản toản Quả trình này được thực hiện tự

động hoản toàn và đặc biệt higu qua dé

phân tích chất béo và phân bã còn lại

Giai đoạn 1 f Giai đoạn2 ' Giai đoạn 3

Hinh 1.3 Qua tinh chiét nhứ hệ thông Soxtherm

Giai đoạn }: Mẫu được đặt ngập hoàn toàn trong dung môi đang sỏi và

chất béo được tách khỏi mẫu (hình II.3.a)

Dung môi bay hơi đi lên, được làm lạnh ngưng tụ lại

Giai đoạn

chảy vào ông chiết Khi mức dung môi bắt dau thập hơn ông chiết đựng mẫu

thì mẫu được chiết (hình II.3.b)

Giai đoạn 3: Chất béo được chiết và gom bởi dụng môi ngưng tụ (hình H1.3.c) Giải đoạn 4: Phần dụng môi thừa được chưng cất và gom trong thùng chứa đê tái sử dụng (hình II.3.đ)

Giải đoạn 5: Cốc chiết được tự động nâng khỏi bếp (hình II.3.€)

Nước làm lạnh và bếp đun nóng được tất sau 5 giai đoạn

Sau khi kết thúc chương trinh cốc chiết được làm khô ở 103°C đến khối

lượng không đôi (ít nhất | gid), gid trong bình hút âm, làm nguội đến nhiệt độ

PHAN If

VI SINH UNG DUNG TRONG CONG NGHE

MỖI TRƯỜNG

11.1 PHAN LAP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẠT

(1.1.4 Méi trường dinh dưỡng

!⁄ Yêu câu đái với môi trường dinh đường

Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự tồn tại và phát trién cua vi sinh vật Đây là yêu tổ đầu tiên quan trọng thậm chí quyết định sự thành công trong nghiên cứu về Vĩ sinh vat

Trong dinh đưỡng, các loài vị sinh vật đều cần một sô nguyên tô hóa học

cơ bản như C.N P và một số nguyễn tổ khoáng khác Tuy nhiên mỗi loài vi

sinh vật có khả năng hấp thụ nhù câu dính dưỡng cũng như cơ chế trao đồi

chất khác nhau Vì vậy, không có môi trường dinh dưỡng nào là vạn năng Tùy

mục đích thỉ nghiệm tùy chúng loại vi sinh vật mà cung cấp một môi trường cần thiết thích hợp đề chúng phát triển

Các vi sinh vật tự dưỡng cacbon có khả năng sử dụng cacbon dưới dạng

vô cơ (CO; hoặc các muỗi cacbonat) làm nguồn Cacbon duy nhất Vì vậy,

chúng được gọi là nhóm vi sinh vật dinh dưỡng vô cơ Chúng gốm các vi sinh

vật có sắc tố như tào vi khuân lưu huỳnh dồng hóa cacbon băng nãng lượng mặt trời (tụ dưỡng quang năng } Một số vì sinh vật khác không có sắc tổ như

vi khuân nitrùt, nữrat hóa thực hiện quá trình đồng hóa cacbon nhở năng lượng

hóa năng tù các quá trình oxy hỏa

Khác với các vi sinh vật tự đưỡng, các vì sinh vật dị dưỡng cacbon cần

môi trường chứa các hợp chất caehon dưới dạng các chất hữu cơ như axit hữu

cơ rượu hydratcacbon hoặc hydrocacbua

Tuy nhiên, các môi trường dinh dưỡng đều phải đáp ứng được những vêu câu sau:

34

- Cung cấp đây đu chất định dưỡng cho ví sinh vật, trong đó chủ yếu là

nguồn C N P các nguyên tỏ khoang đa lượng (Ca K Na, S, Mg ) và vi lượng (Mo Co Zn Cu ) các chất kich thích sinh trưởng (axit amin,

vitamin ) trong trường hợp cần thiết,

- Môi trường dinh dưỡng cân có pH thích hợp (các loại nắm ưa môi trường

axit nhẹ vì khuân ưa kiềm hoặc trung tính tào ưa môi trường kiềm ) Có thê điều

chính pH của mồi trường bang axit (HCI, H2SQa, .), kiém (NaOH, KOH ) hoặc các muỗi có phan ứng kiểm như bicacbonat (NaHCO?) hoặc cacbonat (Na;CO;), Khi khử trùng pH cua môi trường có thê thay đổi Vì vậy, cần kiểm tra lại pH của

môi trường sau khi khử trùng và điều chỉnh lại khi cần thiết

- Môi trường cần có đệ ẫm độ nhớt và áp suất thâm thấu thích hợp

- Môi trường phải đàm bảo tuyệt đối vô trùng Phương pháp khử trùng

thông dụng đói với các loại môi trường định dưỡng là dùng hơi nước bão hòa ö nhiệt độ cao và áp suất lớn hơn áp suất của khí quyên bằng cách sử dụng nỗi báp áp lục (xem phản các thiết bị)

Thiết bị làm việc dựa trên nguyên tắc: nhiệt độ của hơi nước tăng khi áp suất tăng Sụ tương quan giữa áp suất và nhiệt độ của hơi nước được thể hiện trong bảng ]JI.]

Bảng 1I.1 Nhiệt độ cua hơi nước bão hòa ở áp suất khác nhau

€ hú Y-

Thời gian và nhiệt độ khư trùng phụ thuộc vào thành phản môi trường Các chất hữu có dễ bị biến tính do nhiệt như ax(t amin, vitamin các loại đường khư dịch chiết nắm men sữa cần được khư trùng ở 0.5 atm Các chất

kích thích sinh trưởng như avít amin, vitamin nên được khư trùng riêng a

chế độ thích họp và bỏ sung vào môi trường sau khi đã khử trùng

- Khí môi trường có phản ứng kiềm hoặc axit khí khư trùng sẽ xuất hiện kết tủa các sản phẩm caramen hóa và bị biến tỉnh trở nên không hoặc khó hấp

thụ đối với ví sinh vật Đề trảnh hiện tượng nây, môi trường để nuôi cây vi

Sinh vật ưa axit hoặc kiềm nẻn khử trùng ở pH trung tính, sau đó kiếm hỏa hoặc axit hóa môi trường bằng dung địch tương ứng đã vô trùng

- Sau khủ trùng, môi trường được bảo quản ở nhiệt độ 0 — 5°C,

- Truce Khi sur dung cần kiêm tra độ tình khiết của môi trường bằng cách để

trong tủ ám ở nhiệt độ 30 32%C trong 24 siờ, nếu thấy môi trường vân đục có váng hoặc xuât hiện khuân lạc lạ thì cân loại bỏ

2/ Phén logi moi trường

Vĩ sinh vật là nhóm sinh vật gồm nhiều chúng loại vò cùng đa dạng,

phong phú Mỗi loài thậm chí mỗi chúng lại có nhu cầu dinh đưỡng rât khác

nhau, Vị vậy môi trường đề nuôi cảy giữ giống và nghiên cứu chúng cũng rất

đa dạng và khác biệt

Có thể phân biết các loại môi trường theo nhiều cách khác nhau:

4) Phản loại thes thanh phan:

Căn cứ vào nguôn nguyên liệu đề chẻ tạo môi trường người ta phần biệt: Môi trường tự nhiên đuộc chế tạo từ nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc

động thực vật (canh thang thịt nước ép khoai tây carot, nước rnalt nước chiết đât nước suối khoang ) Môi trường tự nhiên có thành nhân không xác định thường đuợc sư dụng nuôi cấy, gift giống và phân lập vi sinh vật

Môi trường tự nhiên thường có một số thanh phần đễ bị biến tính: axit amir vitamin đường khư , Vì vậy, cần khử trùng ở chế độ thích hop

Ví dụ:

+ Mỗi trường canh thang thit - pepton: | atm trong 20 — 30 phút:

+ Moi truong malt: 0.5 atm trong 30 - 30 phút:

x Mỗi trường dịch chiết nắm men: 0.5 atm trong 20 30 phút;

† Môi trường nước ép carolt, khoai tây: 1 atm trong 30 phut

36

- Mói trường tòng họp: được pha chế từ hóa chât thănh phần môi trường

được xâc định cụ thí

Nguyín liệu chứa CN ÐP vă câc khoảng khâc được hòa tan trong nước mây vă khi không cần thiết thì không cần bô sung thím câc nguyín tô ví lượng

- A467 trưởng bân tổng hợp lă loại trung pian giữa 2 loại trín Míi

trường ban tông hợp được chế từ hóa chất (câc loại đường muối chứa nito photpho ) vă câc nguyín liệu tự nhiín chưa biết chính xâc thănh phần như

dịch chiết nắm men dịch thuy phản casein cao ngô chúng được bỏ sung chú

yếu lăm nguồn bô suns vỉ lượng vitamin arinoaxit vă câc chất kích thích sinh trưởng khâc

b) Phđn loại theo mục địch sự dụng môi trường dinh dưỡng gồm

-_ Âöi trường cơ so (đa năng): thích hợp cho nhiều loại vì sinh vật như môi

trường thạch mạch nha thạch thịt pepton, môi trường Shacpec

Mới nướng riíng biệt chỉ thích hợp cho một loăi nhất định không chứa chất ức chế hoặc kim hăm câc vì sinh vật phât triển Tỉnh riẻng biệt thường đuộc đâp ứng qua thănh phđn dinh dưỡng đặc thù (nguồn cacbon nitơ độ nH hoặc câc chất bỏ sung khâc)

-_ Mi trường phản lấp vă Huyễn chọn: chỉ thịch hợp cho mội loăi nhất định đóng thời ức chế sự phât triển của câc loăi khâc như những chất có độc

tinh ma chi vi sinh vat nav chia được,

Ví dụ: Môi trường Endo có chúa Fuchsin kiểm vă Natrisunphit ức chế

mạnh câc vị khuẩn Gram (1) Như vậy có thẻ tâch được câc ví khuẩn

Gram (-) như E coli Shatmonella

- Modi trường xâc dịnh vă chđn đoân: Môi trường được bô sung một số hóa

chđt ch: thị đặc thủ cho phĩp phât hiện một câch khâ chính xâc đặc điểm

cua một loăi năo đó nh phản ứng của môi trường như sự đổi mđu sự tạo thănh câc chất khi đặc trưng Một số chất chỉ thị điển hình như đó trung tinh (5 ppm) da phenol (50 ppm)

- Moi trvong chu thi: duge su dung trong phan lập định tín trong nghiín cứu tính

chât sinh lý sinh hỏa đi truyền vă phđn loại vi sinh vật

cy Phan loai theo tinh chat lý học

Theo tính chất ly học mỗi trường dinh dưỡng được chía thănh 3 loại:

- Mi trường (địch thể: tà môi trường dung dịch đướt dạng lỏng: nguyên liệu được hòa tan trọng nHớc

Môi trường dịch thẻ được sư dụng để nghiên cứu đặc tính sinh lý sinh hóa, đặc tính nuòi cấy, quả trình trao đôi chất của vì sinh vật

- Môi trường đặc: là môi trường lông được bộ sung thêm các tác nhân đông đặc ở nhiệt độ cao như thach (agar agar) gelatin

Môi trường đặc được dùng đề phân lập định lượng xac định đặc tính

nuôi cây giữ giống vi sinh vật

+ Thạch (agar agar) được sản xuất từ tào biên thuộc họ Hồng tảo (chu yếu là Gelidium) Bán chất hóa học của agar là Polysaccarit được tạo thành chu yéu tir D- galactoza và 3.6-anhvdrogalactoza Hâu hết các vi sinh vật không cỏ khả nâng phản giải Agar đồng đặc ở nhiệt độ 40 - 43°C và được sử dụng ở nỏng độ 2-3% Agar có phản ứng trung tỉnh và không làm thay đổi pH của môi trường Đáng chú ý là agar hên trong môi trường trung tính axit nhẹ kiềm nhẹ Tuy

nhiên ở môi trường axit pH < Ấ.5 agar sẽ bị phân hủy một phần trong quá trình khư trùng ở nhiệt độ cao dẫn đến khà năng tạo gel kém Mỗi trường sẽ bị nhão

sau nhiều lần thanh trùng

Đề tránh hiện tượng này, khi cần nuôi cay vi sinh vat trên môi trường có tinh axit agar can duoc khủ trùng riêng sau đó bố sung vào môi trường đã

được khử trùng

+ Gelatin (có bản chất là protein) được san xuất từ đa động vật, Gelatin

nóng chay ở nhiệt độ 23 - 26°C, thấp hơn so voi nhiệt độ nuôi cây các ví sinh

vật ưa ám Mặt khác gelatin con dé bi thay phan boi Enzym Proteaza Vi vay, gelatin được sử dụng chủ yếu để phát hiện hoạt lực Proteaza của vì sình vat

Gelatin thường được bồ sunp với nồng độ 10 — 15%, pH = 6.8 — 7,0 Môi trường có chứa Gelatin được khử trùng ở 0.5 atm trong 15 phút

- Méi trường rấn: là môi trường bán tổng hợp được chế từ một số nguyên

liệu tự nhiên như cám, trâu, bột ngô bột xenllulo khô lạc khô bông có thẻ bố

sung thêm nguồn nitơ photpho va khoảng khác bằng hóa chất khi cần thiết

Môi trường tắn được sử dụng trong phỏng thí nghiệm, trong công nghiệp

đề nuôi cấy vi sinh vat thu chế pham sinh hoc

3⁄/ Một số môi trường thông dung được sử dụng trong công nghệ môi trường

d) Cách chế mội số nghiện hiệu đề pha chế mới trường dinh dưỡng

Canh thang thịt: Dùng nuồi cây các vì khuẩn đị dưỡng,

38

500 g thịt thăn bò tưới nghiền nhỏ thêm vào 1 lít nước giữ ở nhiệt độ

50°C trong thời gian I giờ khuấy thường xuyên sau đó đun sôi trong 3 - 5 phút lọc qua giấy lọc và định mực đến ! lít

Dịch chiết nắm men

Dịch chiết nằm men được sư dụng nuôi cấy nhiều nhóm ví sinh vật khác nhau đặc biết môi trường nuôi cây các loại nấm có nguồn nitợ là địch chiết nắm men sẽ hạn chế đáng ké kha nang bi ahiém khuẩn

Nguyên liệu để thu dịch chiết co thé là nắm men bia dưới dạng men lòng, men ép hoặc nâm men khô

Lấy 100 ø năm men khô (hay 200 ¢ nam men bánh, 400 8 nắm men bía

tươi) trộn vào Í ljt nước đun sôi để nguội đến 60%C Điều chỉnh pH đến 4.5 -

4.7 băng axit sunphuric (ElsSO, IN), Thêm vào 2 — 3 giọt Clorofooc gìữ hỗn hop o nhiét do 48 50°C trong 48 gid Sau đỏ đun sôi, lọc lay dich chiét, phan

phói vào bình và khư trừng ở nhiệt độ LI5°C trong 15 phút Dịch ehiết giàu axit

amin va peptit: có thể cô đặc thành cao nắm rnen hoặc sấy khô thành bột

Có thê kiểm tra bằng cam quan: nước chiết có màu và mùi đặc trưng như

nưoc mắm từ cá,

Nước chiết malt

Căn 250 g đại mạch nảy mầm đã nghiền nhỏ trộn vào | lit nước và đun nóng đến 45 š0°C và duy trì trong Khoảng | gid

Dé tránh vón cục bỗn hợp được khuây liên tục, sau đó nang nhiệt độ lên

SS 58°€ và giữ đến khi đường hóa hoàn toàn (mất máu với iot) Lọc qua giây

lọc thu được dịch chiết malt

\Đjch chiết được sử dụng làm môi trường mạch nha trong nuôi cây giữ

giếng va phân lập hâu hết các loại năm đặc biệt là năm men Kiểm tra nồng đệ

đường bằng ty trọng kế Balling (B) hoặc hàm lượng chất khô bằng khúc xạ kế

cam tav

Nong đệ đường trong nước nha thường đạt i6 - 18°B Hàm lượng chất khô có thể đạt 18 — 20%,

khử trùng nước nha ở 0.5 atm trong 20 - 30 phút trước khí bào quản

hy) Mot so midi trong thong dung

Môi trường canh thang thịt: dùng phân lập nhiều loài vi khuân

+ Pepton: l0

~NaCh 5 g (khuấy cho tan hết)

Điều chnhpH: 74 76

Khư trùng: 20 30 phút ơ J^1“C