KIỂM NGHIỆM bài sắc kí lớp MỎNG

1/- Mở đầu Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu được phân bố vào hai pha: một pha tĩnh và một pha động.. Khi cho dung môi nguyên chất ethe

Sắc ký lớp mỏng

Biên soạn: PGS TS Võ thị Bạch Huệ

1/- Mở đầu

Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu được phân

bố vào hai pha: một pha tĩnh và một pha động

2

Pha tĩnh có thể là một chất rắn,

cũng có thể là một chất lỏng

được giữ trên một chất rắn hay

một gel Pha tĩnh có thể được

nhồi vào một cột, hoặc trải

thành một lớp, hay phân tán

thành một lớp phim v.v Pha

động có thể là chất khí, chất

lỏng hay chất lưu siêu tới hạn

(còn được gọi là chất lỏng siêu

tới hạn)

http://www.instructables.com/id/EW1YDCYF4REC0IU /

1/- Mở đầu

Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như

- hấp phụ,

- phân bố khối lượng (hay phân chia),

- trao đổi ion,

- hoặc dựa trên sự khác nhau về các tính chất lý

hoá của các phân tử như kích thước, khối lượng, thể tích, v.v…

1/- Mở đầu

Khi cho dung dịch các sắc

tố thực vật trong ether

dầu hỏa lên một cột được

nhồi bởi bột mịn calci

carbonat, ông nhận thấy

sắc tố bị hấp phụ trên

đầu cột Khi cho dung

môi nguyên chất (ether

dầu hỏa) lên cột, các sắc

tố di chuyển trong cột và

tách thành những vòng

màu xếp chồng lên nhau

Phương pháp này sau đó

Các kỹ thuật

1938 Izmailov và Schraiber đã xây dựng và sau đó năm 1958 Stahl đã hoàn thiện phương pháp sắc ký lớp mỏng

6

Các kỹ thuật

Sắc ký tiếp tục phát triển không ngừng nhờ vào

suốt những năm thập niên 40 và 50 của thế kỷ 20 Hai ông đã đưa ra những nguyên tắc và kỹ thuật cơ bản của sắc ký phân bố làm động lực cho sự phát triển của nhiều phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký giấy (PC), sắc ký khí (GC) và sắc ký lỏng cao

áp (HPLC)

3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng:

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách

8

3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng:

Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại

3/- Nguyên tắc sắc ký

lớp mỏng:

Pha động là một hệ dung

môi đơn hoặc đa thành

phần được trộn với nhau

theo tỷ lệ quy định trong

từng chuyên luận Trong

quá trình di chuyển qua

lớp hấp phụ, các cấu tử

trong hỗn hợp mẫu thử

được di chuyển trên lớp

mỏng, theo hướng pha

Hazards* Dipole Elution

Stength ()

Flammable Toxic

Toluene

C 6 H 5 CH 3

C7H8 92.13

110.6 0.867

Flammable Toxic

Diethyl ether

CH 3 CH 2 OCH 2 CH 3

C 4 H 10 O 74.12

34.6 0.713

Flammable Toxic, CNS Depressant

Toxic, Irritant Cancer suspect

Ethyl Acetate

CH 3 CO 2 CH 2 CH 3

C4H8O288.10

77.1 0.901

Flammable Irritant

Acetone

CH 3 COCH 3

C 3 H 6 O 58.08

56.3 0.790

Flammable Irritant

Butanone

CH 3 CH 2 COCH 3

C4H8O 72.10

80.1 0.805

Flammable Irritant

1-Butanol

CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 OH

C 4 H 10 O 74.12

117.7 0.810

Flammable Irritant

Propanol

CH3CH2CH2OH

C 3 H 8 O 60.09

82.3 0.785

Flammable Irritant

Ethanol

CH 3 CH 2 OH

C 2 H 6 O 46.07

78.5 0.789

Flammable Irritant

Methanol

CH3OH

CH 4 O 32.04

64.7 0.791

Flammable Toxic

Water HOH

H 2 O 18.02

100.0 0.998

4/- Cơ chế

của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm

5/- Cách tiến hành

5.1/- Dụng cụ

- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt

có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng

và có nắp đậy kín

12

- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện

- Tủ hút hơi độc

- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích

- Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm

- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng

- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp

- Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát

5.2/- Chuẩn bị bình khai triển:

Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5

mm đến 10 mm ở đáy bình Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 - 25oC

5.2/- Chuẩn bị bình khai triển:

Muốn thu được những kết quả lặp

lại, ta chỉ nên dùng những dung

môi thật tinh khiết, loại dùng cho

sắc ký Những dung môi dễ bịến

đổi về hóa học chỉ nên pha trước

khi dùng Nếu sử dụng những hệ

pha động phức tạp phải chú ý đến

những thành phần dễ bay hơi làm

thay đổi thành phần của hệ pha

động dẫn đến hiện tượng không

lặp lại của trị số Rf

16

5.3/- Chấm chất phân tích lên bản mỏng:

Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có

ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf

Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp

Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do

độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg) Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg

ở dạng dung dịch trong ether, cloroform, nước hay dung môi thích hợp khác

5.3/- Chấm chất phân tích lên bản mỏng:

Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với

trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng

điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng

dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều

chế

Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới

10 - 50 mg Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm

5.3/- Chấm chất phân tích lên bản mỏng:

Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1

cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6

mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách

bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ

20

0.8 cm 3.0 cm

0.8 cm 5.0 cm

3.0 cm 5.0 cm

0.8 cm 5.0 cm D

x

Rf (D) = 4.0 cm = 0.80

5.0 cm

4.0 cm

5.4/- Triển khai sắc ký:

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng

Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng

Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

24

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di

chuyển của chất phân tích là hệ số

di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ

giữa khoảng dịch chuyển của chất

thử và khoảng dịch chuyển của

dung môi:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm

a’ là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu đối chiếu, tính bằng cm

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

5.5/- Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả trong sklm điều chế:

5.5.1/- Phun xịt với thuốc thử đặc trưng :

Giúp biết được vị trí của vết mẫu trên tấm bản

26

5.5/- Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả trong sklm điều chế:

5.5.2/- Soi bản dưới đèn UV :

Nhanh, tiện lợi, nhìn được vết mà

không gây hao hụt mẫu

Tuy nhiên, vết có thể ở vị trí x

trên bản, nhưng mắt lại nhìn

thấy vị trí biểu kiến của nó, nghĩa

là ở một vị trí khác Cần kiểm tra

một vài lần bằng cách che môt

phần bản và phun xịt các thuốc

thử để nhìn rõ vị trí của các vết.

5.5/- Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả trong sklm điều chế:

5.5.3/- Hơ hơi iod :

Đặt bản trong một buồng có hơi iod, khi thấy vết hiện lên trên bản, lấy bản ra khỏi buồng, đánh dấu vị trí của vết, phơi bản ngoài quạt hơi iod sẽ bay đi mất

28

6/- Ưu nhược điểm và khả năng ứng dụng :

6.1/- Ưu điểm

Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, có thể thực hiện ở mọi phòng thí nghiệm

Thời gian thực hiện nhanh, tối đa vài giờ

Do cách thực hiện đơn giản nên có thể dùng SKLM để khảo sát các hệ dung môi cho các phương pháp sắc ký khác

Nhìn chung SKLM là phương pháp có tính ứng dụng rất cao, thông dụng nhất hiện nay

Nhanh, dễ tìm được các dung môi thích hợp để tách các chất

Các vùng có chứa chất cần thiết sẽ tập trung tại 1 vị trí nhất định dễ dàng phát hiện, dễ dàng nhận biết

SKLM tách tốt là nhờ tỷ lệ lớn giữa chất tách : chất hấp thu silicagel từ 1:1000 đến 1:10000 trong khi tỷ lệ này ở sắc ký cột là 1:50 đến 1:100

TLC - Optimizing for column chromatography

Optimum: 0.2 < R f < 0.5

34

Thin-Layer Chromatography: A

Two-Component Mixture

More polar! Less polar!

The R f value is a decimal

fraction, generally only

reported to two decimal

places

Thin-Layer Chromatography:

Qualitative Analysis

A B unknown