KIỂM NGHIỆM bài sắc ký cột

Sắc ký cộtNguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí khác: -một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ thường là silica gel, nhôm oxyt... Một dung môi khai triển

Sắc ký cột

Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí khác:

-một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyt)

2

Sắc ký cột

- Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò

là một pha tĩnh Một dung môi khai triển

(pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ

làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử,

do các cấu tử này có độ phân cực khác

nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh

cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung

môi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc

khác nhau tạo các dải riêng biệt có vị trí

khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm

khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích

định tính và định lượng

1/- Mở đầu

chảy vào dịch thu được) và thêm một lớp

mỏng cát

Nếu không cẩn thận khi nạp mẫu thử vào có

thể dẫn đến làm xáo trộn pha tĩnh và hiệu

suất chiết xuất sẽ thấp vì vậy cần thêm 1 lớp

cát vào phía trên pha tĩnh nữa để ổn định

cột

Điều quan trọng nhất là không được để pha tĩnh ở trạng thái khô

và không được có bọt khí Vì vậy phải luôn giữ cho pha tĩnh được bao phủ bới pha động

Bởi vì silica gel và nhôm oxyt có thể tạo một lớp khá dày, quá trình

2.1/- Pha tĩnh

Loại chất sử dụng làm pha tĩnh là những chất hấp phụ, thay đổi theo độ phân cực của chất cần phân lập

Hiện nay phổ biến là silicagel và nhôm oxyt, là những chất hấp phụ phân cực (chất hấp phụ pha thuận), chúng được

phân cực trung bình

Cỡ hạt hấp phụ: Cỡ hạt nhỏ (15- 40μm), cỡ hạt trung bình (40- 63μm), cỡ hạt thô (63- 200μm)

4

2.2/- Cách thức chuẩn bị cột sắc ký

Cột sắc ký thường là một ống thủy tinh có đường kính từ 50mm trở lên, chiều cao từ 50cm đến 1m với 1 cái vòi ở phía dưới

Chiều cao cột vừa phải, càng cao thì khả năng tách càng hiệu quả nhưng nguy cơ mất mẫu càng lớn Cột được rửa sạch, sấy khô, gắn trên trên một giá vững chắc

1/- Mở đầu

6

3/- PHƯƠNG PHÁP NHỒI CỘT:

3.1/- Phương pháp khô:

Cột đầu tiên được điền đầy với bột

pha tĩnh khô, sau đó bổ sung pha

động từ từ cho đến khi pha tĩnh

hoàn toàn ướt, và kể từ thời điểm

này không được phép để cột khô

1/- Mở đầu

3/- PHƯƠNG PHÁP NHỒI CỘT:

3.2/- Phương pháp ướt:

Một hỗn dịch tương đối loãng, tạo từ chất hấp phụ hòa trong

lớp dung môi nằm trên lớp bông ở đáy cột Mở khóa cột tối

đa Chú ý phải loại trừ bong bóng khí bằng cách cho từ từ

và thường xuyên vỗ nhẹ cột Cố gắng đưa toàn bộ khối hỗn dịch bằng 1 lần rót duy nhất Từ thời điểm này không được

để khối bột khô

4/- ỔN ĐỊNH CỘT:

Cột ở vị trí thẳng đứng, nén cột bằng 2 nút cao su gõ nhẹ đều quanh cột đến khi không còn bọt trong cột, mặt thoáng phẳng và không tụt xuống được nữa Sau khi nén cột cho dung môi chảy qua cột trong một thời gian thích hợp tùy theo kích thước để ổn định cột Cột càng ổn định thì các băng tách sẽ càng phẳng và gọn

8

Các kỹ thuật

5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT

5.1/- Mẫu sắc ký

Cần xác định rõ hợp chất cần chiết xuất Quy trình chiết xuất phải phù hợp với nhóm hợp chất này Mẩu thử trước khi phân tích phải được loại tạp bằng phương pháp thích hợp

Các kỹ thuật

5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN

CộT

5.1/- Mẫu sắc ký

Mẩu thử có thể ở dạng bột khô nhưng

thường ở dạng dung dịch khá đậm đặc

(không được quá đậm đặc) trong 1 dung

môi không quá phân cực so với hệ dung

môi sắp dùng để khai triển cột Lý tưởng

nhất là dung môi nền của hệ dung môi

pha động

10

Các kỹ thuật

5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT

5.1/- Mẫu sắc ký

Nều mẫu khó hòa tan trong dung môi nền, có thể dùng một dung môi khác phân cực hơn dung môi nền để hòa tan mẫu VD: Pha động là Benzen - EtOAc thì tốt nhất hòa tan mẫu

Mẫu dạng bột khô: trộn dung dịch mẫu với giá tơi xốp vừa

5.2/- Đưa mẫu lên cột

Nạp mẫu dạng bột khô (ít được sử dụng)

Rắc đều mẫu lên lớp dung môi vừa đủ trên đỉnh cột

Chú ý: Lớp dung môi chừa lại trên đỉnh cột phải hơi dư so với khả năng hút dung môi của lượng bột mẫu

12

Nạp mẫu dạng dung dịch

bóp hoặc bình lắng gạn có đầu dài đưa nhẹ nhàng dung dịch mẫu vào lớp dung môi chừa trên đỉnh cột

Nạp mẫu xong, mở khóa cột chậm cho toàn bộ dung dịch mẫu thấm đều vào chất hấp phụ

Dùng dung môi hòa tan mẫu rửa lòng cột vài lần đến khi dịch rửa trở nên trong suốt không màu Trong khi rửa vẫn mở

không để nứt cột

6/- DUNG MÔI SẮC KÝ:

thường nhất vẫn là phải dò tìm hệ dung môi này bằng phương pháp SKLM trên cùng chủng loại pha tĩnh

Hệ dung môi này nên gồm tối đa 2 thành phần và sau khi chạy xong trên sắc ký đồ SKLM cho kết quả:

vệt dài

ưu tiên hòa tan chất hấp phụ nhồi cột, hòa tan mẫu nạp cột

6/- DUNG MÔI SẮC KÝ:

Chú ý: Không nên khai triển cột sắc kí ngay với hệ dung môi vừa chọn bằng SKLM mà phải dùng hệ dung môi cùng

Tỷ lệ của dung môi phân cực hơn (B) trong hệ dung môi (A

- B) sẽ được tăng từ từ

Thận trọng trong thay đổi dung môi nhất là dung môi phân cực mạnh

7/- PHÁT HIỆN VÀ THU NHẬN KẾT QUẢ SẮC KÝ

bản silica gel F254 soi UV

lập các chất không màu

Để gộp các phân đoạn: Theo dõi băng SKLM, gộp các ống hứng có sắc ký đồ giống nhau, ghi lai thể tích của phân đoạn mới gộp

Báo cáo kết quả: phải ghi rõ các thông số và các chi tiết

kèm mẫu toàn phần để tiện theo dõi

Các thành phần thu được sau khi sắc ký có thể sử dụng các phương pháp đo UV, huỳnh quang, HPLC, GC,… để tiến

8/- ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM

8.1/- Ưu điểm:

Có thể được sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân tích và điều chế

Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các

để tách và tinh chế những thành phần phân tích

triển khai với một lượng lớn mẫu chất

8.2/- Nhược điểm

Khi chạy cột sắc ký cần đòi hỏi sự chú ý theo dõi liên tục đễ duy trì mức dung môi vì nếu không sẽ dễ gây xuất hiện các bọt khí làm tắc cột, nứt cột, và biến dạng đường đi của dung môi

Chạy cột tốn thời gian và và công việc lặp đi lặp lại, đặc biệt

là khi chạy các mẫu lớn

Quá trình tách chậm và hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao

áp http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm 16

9/- ỨNG DỤNG

Phân lập các hormon tăng trưởng steroid, hormon sinh dục và các hợp chất liên quan

Rửa giải các thuốc trừ sâu

Tách các thuốc trừ sâu gốc clo

Phân lập kháng sinh

Tách các chất lipid

Phân lập alkaloid

Tách các hợp chất chứa nito từ các hydrocarbon Làm tinh khiết dược liệu

Tách hợp chất vòng thơm từ hỗn hợp mạch thẳng-vòng thơm

Phân tích các vitamin

Khử màu dầu, chất béo và sáp bằng phương pháp