Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kí Sắc kí cột Sắc kí lớp mỏng

Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kíSắc kí cộtSắc kí lớp mỏng Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kíSắc kí cộtSắc kí lớp mỏng Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kíSắc kí cộtSắc kí lớp mỏng Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kíSắc kí cộtSắc kí lớp mỏng Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kíSắc kí cộtSắc kí lớp mỏng Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kíSắc kí cộtSắc kí lớp mỏng Phương pháp Phân Tích Công Cụ Lí thuyết chung về sắc kíSắc kí cộtSắc kí lớp mỏng

* Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có

thể được nạp nén vào trong một cột (vd: sắc kí cột hở ở áp suất thường hoặc sắc kí ở áp suất cao), hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa (vd: sắc kí lớp mỏng)

* Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất

mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn (bằng một nối hóa trị) lên trên chất mang rắn Vd: trong sắc kí giấy, pha tĩnh là nước (nước này do sợi cellulose của tờ giấy đã hấp thu); Hoặc trong sắc kí giấy, pha tĩnh là một chất lỏng có tính bền nhiệt, kém bay hơi, được tẩm phủ lên những hạt rắn có lỗ rỗng

+ Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí

* Pha động là chất lỏng:thường dùng trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc

kí cột Trong trường hợp này chất lỏng được gọi là dung môi giải ly

* Pha động là chất khí: thường là trong kĩ thuật sắc kí khí Trong trường hợp

này, chất khí được gọi là khí mang hoặc khí vectơ

2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc

kí

Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

bC

bC n

n

+

1Trong đó: n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞ - lượng cực đại của chất

b – là hằng số

C – là nồng độ của chất bị hấp phụ Theo Langmuir, trên bề mặt của vật rắn có những vị trí có năng lượng bé phân

bố trên toàn bề mặt, ta gọi số vị trí hay n∞ các phân tử chất bị hấp phụ từ dung dịch hay dòng khí có thể bị hấp phụ lên bề mặt vật rắn tại các điểm này

Trong miền nồng độ đủ bé thì hiện tượng hấp phụ có thể trở nên tuyến tính Khi C

đủ bé để cho bC< 1 và 1+ bC ≈ 1thì (1) trở thành:

n = n∞bC = KC (2) Đây là phương trình hấp phụ tuyến tính hay còn gọi là phuong trình henry Miền nồng độ của chất hấp phụ tuân theo định luật hấp phụ tuyến tính (miền Henry)

Cho dù cơ chế của hiện tượng hấp phụ, trao đổi chất giữa hai pha động và tĩnh

có thể khác nhau nhưng hệ quả cuối cùng vẫn là hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ

và sự trao đổi chất nói chung tuân theo định luật hấp phụ langmuir hoặc định luật hấp phụ Henry

3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Có nhiều tiêu chí để phân loại các phương pháp sắc kí, trong đó tiêu chí được

sử dụng nhiều nhất là phân loại theo hệ pha:

(1)

Ngoài ra, còn có các cách phân loại sau:

- Phân loại dựa trên đặc trưng của các pha động, pha tĩnh:

+ Sắc kí cột

+ Sắc kí lỏng

+ Sắc kí giấy + Sắc kí khí

- Phân loại dựa trên bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất:

Sắc đồ là dường biểu diễn sự

phụ thuộc của tính hiệu đo trong

quá trình tách vào thời gian Mỗi

dãy (band) trên sắc đồ được gọi là

pic.Một sắc đồ có thể có nhiều

pic, mỗi peak ứng với một cấu tử

được tách ra.Để tính toán hàm

lượng chất phân tích, tính toán

Trong phương pháp phân tích sắc kí, người ta thường dùng phương pháp rửa giải Trong phương pháp rửa giải, pha động (khí hay lỏng) thoát ra khỏi cột được phân tích liên tục Dựa vào kết quả phân tích, người ta xây dựng đồ thị hệ tọa độ: nồng độ chất nghiên cứu C và thể tích V của pha động chảy qua cột Nếu gọi A’ là lúc đưa dung dịch mẫu (hoặc hỗn hợp mẫu phân tích), A là lúc xuất hiện cấu tử không bị hấp phụ lên cột, còn B là lúc xuất hiện chất phân tích, đường A’AB và phần kéo dài của nó là đường BF được gọi là đường không hay đường chân.Đường cong DBF là pic sắc kí (hay đỉnh sắc kí)

Píc sắc kí được đặc trưng bằng chiều cao, diện tích và vị trí của pic Đường cong pic sắc kí thường có thể mô tả bằng phương trình toán học:

e

Cmax −( − )2/2µ2

(3) Trong đó: v – thể tích pha động

Vo – thể tích pha động ứng với Cmax

µc – độ lệch chuẩn bằng độ rộng nửa pic ứng với: max e1 / 2

C

C

= (4) Chiều cao của pic (tỉ lệ với Cmax) được tính bằng giá trị h hay h’ (hình 23.2).h’

chính là khoảng cách tính từ đường chân đến giao điểm của các tiếp tuyến vẽ từ điểm uốn của đường cong Độ rộng của pic được tính bằng khoảng cách giữa hai điểm trên đường cong ứng với nửa chiều cao h (CE = W0,5 ) Tuy nhiên cũng còn nhiều cách tính

độ rộng của pic khác nhau Người ta có thể chọn độ rộng của pic là khoảng cách của các điểm uốn (µu) hay khoảng cách B’F’ là khoảng cách giữa các giao điểm của các đường tiếp tuyến tại điểm uốn với đường chân (B’F’ = Wh )

Người ta có thể xác định mối liên quan giữa các đại lượng này:

W0,5 = 2.36 µc ; µu = 0.850 µ0,5 - 2 µc

µK = 1.700 µc ;

4.2 Các thông số đặc trưng của phương pháp sắc kí sau

• Các thông số thời gian và thông số pic:

- Thời gian chết (dead tim) to: thời gian cần thiết để pha động (dung môi) chạy qua cột

- Thời gian lưu (Retention time) tR: thời gian cần thiết để cấu tử đưa vào hệ sắc kí được tách ra với nồng độ cực đại

(5)

- Thời gian lưu của cấu tử n (tRn): được xác định dựa trên sắc đồ, được tính từ thời điểm bắt đầu chạy sắc kí đến đỉnh pic tương ứng của cấu tử n

- Thời gian lưu tịnh (Net retention time) t’R: được tính bằng hiệu số giữa thời gian lưu với thời gian chết (t’R = tR - to)

- Độ lệch tiêu chuẩn σt: là nửa bề rộng của pic tại điểm uốn của pic

- Bề rộng nửa pic ứng với nửa chiều cao pic kí hiệu là W0,5: W0,5 = 2.354 σt

U

l

, trong đó : U – vận tốc chuyển động của băng ghi

Thể tích lưu VR tỉ lệ với thời gian lưu tR: VR = tRω, trong đó: ω - vận tốc thể tích của pha động (dung dịch hay khí mang) chạy qua cột

Thể tích lưu thu gọn V’R ứng với đoạn AG được xác định bằng hệ thức:

VR’ = VR – V0trong đó: V0 – tỉ lệ với đoạn A’A có độ dài tương ứng là lo

V0 – đặc trưng cho thể tích lưu của cấu tử không bị hấp phụ hay còn gọi

1)/(.2

3

3 1

2 1

−

−

o

o P P

P P

P1 và Po là áp suất của khí mang khi vào cột và ra khỏi cột

Một đặc trưng quan trọng khác của phương pháp sắc kí khí là thể tích lưu riêng tuyệt đối Vm Vm được tính theo công thức:

Vm =

K

hq T m

V 273.16 (6) trong đó: m – khối lượng của chất hấp phụ

Tk – nhiệt độ của cột

Vm không phụ thuộc các tham số hình học của cột và có thể dùng để đặc trưng cho

hệ thống chất hấp phụ - khí hấp phụ Tuy nhiên đại lượng này cũng thay đổi theo một

số nguyên nhân ngẫu nhiên

Một đại lượng khác ít chịu ảnh hưởng của yếu tố ngẫu nhiên hơn là thể tích lưu tương đối Theo định nghĩa, thể tích lưu tương đối là tỉ số giữa thể tích lưu riêng tuyệt đối với thể tích tương ứng của một chất được chọn làm chất chuẩn:

Vtđ =

mc

mj V

V

(7) trong đó: Vtđ – thể tích lưu tương đối

Vmj – thể tích lưu tuyệt đối của chất nghiên cứu

Vmc – thể tích lưu tuyệt đối của chất chọn làm chuẩn

Giá trị thể tích lưu tương đối có thể tìm được trong các sổ tay

Trong đó: CT là nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

CĐ là nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số k phụ thuộc vào bản chất pha động, pha tĩnh và bản chất chất phân tích

• Khả năng tách (k’):

Khả năng tách (capacity factor) k’ được biểu diễn theo hệ thức:

k’ =

O R

O

O R

O

R

t

t t

t t t

Giá trị k’ nhỏ thì khả năng tách kém, k’ lớn khả năng tách tốt:

k’~ 0, tR~to: chất ra sớm, cột không có khả năng giữ chất lại

k’ càng nhỏ (tR càng nhỏ): các mũi chất ra nhanh, khả năng tách kém

k’ càng lớn (tR càng lớn): chất bị giữ trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng dài nên mũi sắc kí có khả năng bị tù

Khoảng k’ lí tưởng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp thì có thể chấp nhận giá trị k’ từ 1 đến 20

• Độ chọn lọc (α):

Độ chọn lọc (selectivity) α được biểu diễn theo hệ thức:

α =

O R

O R t t

t t k

2

'

Đại lượng (α) nói lên khả năng tách giữa hai cấu tử lân cận nhau trên sắc đồ

Cấu tử 1 tách khỏi cấu tử 2 khi đó phải có k’2 ≠ k’1.Điều đó có nghĩa khi giá trị α ≠

1, cấu tử 1 và 2 tách khỏi nhau trong quá trình sắc kí.Giá trị α càng khác 1 thì 2 cấu tử tách được ra khỏi nhau càng tốt

• Số đĩa lý thuyết N:

Đại lượng đặc trưng cho hệ thống tách là số đĩa lý thuyết N Đĩa lý thuyết được định nghĩa là miền mà cân bằng động của nồng độ cấu tử trong pha tĩnh và pha động được thiết lập Số đĩa lý thuyết được hiểu là nếu tổng độ dài của cột L được chia thành các phần có độ dài H thì số đĩa lý thuyết được tính theo biểu thức N = L/H Dựa trên sắc đồ nếu pic là đường phân bố gauxơ thì số đĩa lý thuyết cho các pic có thời gian lưu

đủ lớn được tính theo biểu thức sau:

5 , 0

2 2

2

16 54

5

h

R R

t

R

W

t W

t t

Dựa vào các thông số hiển thị trên sắc đồ, độ phân giải (R) được tính theo biểu thức:

+

−

= +

−

2

1 0 , 5 5 , 0

1 2 2

1

1

2 1 , 177 ( ) 2

) (

W W

t t W

W

t

h h

R

Giá trị R nhỏ khả năng phân giải của hai cấu tử thấp Thực nghiệm có thể tiến hành tách, xác định với giá trị R thấp nhất bằng 0,5 Giá trị R lý tưởng trong khoảng 1 – 1,5 Với R>1,5 khả năng tách tốt nhưng đòi hỏi nhiều thời gian

Độ phân giải R phụ thuộc vào thông số k’, độ chọn lọc α và số đĩa N của cột tách

R =

2

2

' 1

' 1

k N

+

−

α

Để tăng độ phân giải R, ta có thể:

- Tăng giá trị khả năng tách k’, k’ phụ thuộc vào bản chất pha động, tức là phụ thuộc vào nồng độ, lực ion và bản chất của cột

- Tăng số đĩa lý thuyết, tăng độ phân giải Tuy nhiên thời gian phân tích phải kéo dài vì làm chậm tốc độ dòng

- Tăng độ chọn lọc α Là phương pháp hiệu quả nhất, thực hiện bằng cách chọn cột thích hợp hơn hoặc thay đổi thành phần dung dịch giải hấp phụ

5 Các lực liên kết trong hệ sắc kí

Trong hệ sắc kí có 3 thành phần chủ yếu quyết định sự tồn tài của hệ: chất phân tích, pha tĩnh và pha động Chúng tương tác với nhau, tạo nên sự phân bố cần thiết, giúp cho sự di chuyển các chất phân tích dọc theo chiều dài cột với tốc độ khác nhau Vấn đề là 3 thành phần này tương tác như thế nào, bằng các lực liên kết nào mà kết quả là các chất phân tích phân bố vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau Đó là do bản chất của các thành phần trong hệ sắc kí nói trên Chất phân tích có thể là ion, phân tử trung hòa hay chất phân cực; Đối tượng tác động của nó có thể là ion, phân tử trung hòa hay chất phân cực.Từ đó chúng tương tác với nhau bằng các lực liên kết khác nhau Người

ta chia các lực liên kết đó thành 4 loại:

5.1 Lực liên kết ion

Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion, đó các phân tử có khả năng phân ly tạo thành các ion, tạo nên các trung tâm hoạt động ion Chúng tham gia liên kết với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết ion Để giữ các anion chất phân tích, pha tĩnh cần có các trung tâm cation trên bề mặt, và ngược lại, để giữ các cation chất phân tích thì bề mặt pha tĩnh cần có các trung tâm anion

Tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là ion, chúng tham gia tương tác với pha tĩnh và chất phân tích

5.2 Lực phân cực

Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực Chúng có thể là các lưỡng cực điện cố định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do cảm ứng Chúng tham gia liên kết với các

phân tử phân cực khác bằng lực liên kết phân cực.Sự phân cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ.Tuy nhiên sự chênh lệch này

là yếu tố rất quan trọng để độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để phân chia chúng trong các phép tách sắc kí

Ví dụ: các chất đồng phân o-, m-, p-cresol chỉ khác nhau về vị trí nhóm –CH3 trong phân tử Chính sự khác biệt này làm cho mật độ electron trong phân tử của các cresol khác nhau, tạo nên sự khác biệt về độ phân cực, làm cho lực liên kết với pha tĩnh khác nhau, từ đó có sự chệnh lệch về thời gian lưu trong quá trình sắc kí

5.3 Lực phân tán

Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trog mạng lưới phân tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực cảm ứng hay cố định.Tương tác phân tán điển hình là giữa các mạch hiđrocacbon, nó là tương tác phân tử

Ví dụ: n-heptan là chất lỏng chứ không phải khí vì sự tương tác giữa các phân tử là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng Để tách các hiđrocacbon người ta

6 Các cách tiến hành phân tích sắc kí

Tùy thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc kí cũng như thao tác tiến hành sắc kí, người ta chia cách tiến hành sắc kí thành 3 loại:

6.1 Phương pháp tiền lưu

Đây là phương pháp sắc kí đơn giản nhất Người ta cho hỗn hợp (ví dụ chỉ gồm 2 chất A và B) liên tục chảy qua cột có nạp sẵn chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ tọa độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột Đồ thị này thường gọi sắc đồ (đường cong thoát)

Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi Sau đó trong dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yếu hơn trên cột (ví dụ là cấu tử A), sau

đó đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A + B Do vậy mà phương pháp tiền lưu không

cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên thực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất

6.2 Phương pháp rửa giải

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho v (ml) dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ chỉ gồm 2 chất A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột Các cấu tử A và b trong v (ml) trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột Sau

đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hòa tan các cấu tử và không bị pha tĩnh hấp phụ) chảy qua cột Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa”

và đưa dần xuống phía dưới Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửa thích hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử sẽ tách ra thành từng vùng, các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi Sau quá trình tách có sự giảm nồng độ cấu tử

6.3 Phương pháp rửa đẩy

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ các cấu tử không giảm qua quá trình sắc kí

Một nhược điểm quan trọng của quá trình rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần riên của các cấu tử trong dung dịch thoát, vì ở đây các phần dung dịch thoát chứa các cấu tử riêng không thể tách khỏi nhau bằng các thể tích dung dịch rửa xác định

7 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí

Ngoài cơ chế hóa học xảy ra trong các quá trình sắc kí , còn có nhiều lí thuyết mô

tả một cách hình thức quá trình phân tích sắc kí nhưng người ta chú ý đến phương pháp lí thuyết đĩa và lí thuyết động học Dùng các lí thuyết này người ta có thể giải thích một các tổng quát sự phân bố của các chất trong quá trình sắc kí

7.1 Lí thuyết đĩa

Phương pháp lí thuyết đĩa đầu tiên được dùng để mô tả quá trình xảy ra trên cột chưng cất Đến năm 1942, Martin và Singe đề nghị áp dụng lí thuyết đĩa vào quá trình chưng cất

Theo lí thuyết đĩa, người ta tưởng tượng chia cột sắc kí theo chiều dọc của cột thành nhiều lớp, mỗi lớp được gọi là đĩa Trong mỗi đĩa, cân bằng vật chất được thiết lập rất nhanh giữa pha động và pha tĩnh Mỗi phần pha động mới được chia vào đĩa sẽ làm dịch chuyển cân bằng và do đó có một phần vật chất được chuyển sang đĩa sau.Ở đĩa này cân bằng mới được thiết lập và vật chất lại được chuyển cho pha sau nữa Do kết quả của các quá trình vừa mô tả, chất cần tách sẽ được chứa trong một số đĩa, trong

số đĩa này, các đĩa phần giữa có nồng độ cực đại so với các đĩa lân cận Sự phân bố nồng độ chất nghiên cứu dọc theo cột tuân theo phương trình:

C = Cmaxe−(x−x o)2/21H

(13) Trong đó, x- khoảng cách từ đầu cộ đến điểm, tại đó nồng độ chất nghiên cứu bằng

C

xo- tọa độ của tâm dãy sắc kí

H - chiều cao tương đương của đĩa lí thuyết

l - chiều dài của lớp chất hấp phụ, tưởng tượng được chia thành n đĩa lí thuyết

theo đó: n =

H

l

(14) Nếu tử của phân số trên số mủ của các phương trình (3) và (13) có cùng đơn vị đo

thì khi so sánh các phương trình này ta có: H=

e C

K =

=µ

Hiệu quả cột càng cao nếu chiều cao tương ứng của đĩa lí thuyết càng bé

Lí thuyết đĩa cho phép tính toán các đặc trưng của quá trình sắc kí

Tuy nhiên lí thuyết đĩa chỉ mang tính hình thức vì nó có tính gián đoạn, trong khi quá trình sắc kí lại có tính liên tục Lí thuyết đĩa cũng không chú ý đến các yếu tố khác

H

U

A B/U

Chiều cao tương đương của lí thuyết đĩa phụ thuộc vận tốc dòng của pha động U được mô tả bằng phương trình Van – Deemter:

Hằng số A liên quan với tác dụng của

khuếch tán xoáy lại phụ thuộc kích thước hạt

hấp phụ và mật độ nhồi cột

B liên quan với hệ số khuếch tán của phân

tử trong pha động và có chịu ảnh hưởng của

C U

B dU

=

dU dH

Tức là khi vận tốc dòng tối ưu Utư:

Utư =

C B

Thay giá trị Utư vào (3), ta tìm được chiều cao tối ưu của đĩa lí thuyết:

Htư = A + 2 BC (18) Vậy lí thuyết động học tạo cơ sở để tối ưu hóa quá trình sắc kí Khi kết hợp (17) và (18) ta thấy:

- Đại lượng A trong phương trình không phụ thuộc vận tốc dòng

- Khi vận tốc dòng lớn, thành phần CU sẽ trở nên rất lớn, độ hiệu quả của cột sẽ kém do các chất không kịp trao đổi và cân bằng trao đổi chưa kịp thiết lập

- Nếu vận tốc dòng quá bé thì số hạng B/U sẽ trở nên lớn, nghĩa là vùng sắc kí bị giãn rộng

- Vận tốc dòng tối ưu trong sắc kí lỏng thường bé hơn trong sắc kí khí 104 lần nên trong sắc kí lỏng thời gian phân tích kéo dài hơn sắc kí khí Hiện nay nhờ kĩ thuật sắc kí lỏng cao áp, ta có thể tăng vận tốc dòng mà hiệu quả tách vẫn tốt vì

có thể tăng chiều dài của cột.Ngoài các yếu tố vừa nêu còn có các yếu tố khác là yếu tố ngoài cột làm giãn rộng vùng sắc kí

- Độ tập trung của mẫu khi đưa vào cột (hoặc trên giấy, trên lớp mỏng) ở lớp đầu cột, nếu mẫu đưa vào càng loang rộng thì càng bị giãn rộng

- Sự phụ thuộc của hệ số phân bốvào nồng độ chất Điều này thường xảy ra với sắc kí lỏng, làm cho pic sắc kí không còn đối xứng khi tăng nồng độ Do đó không nên tách sắc kí với các dung dịch có nồng độ quá lớn

8 Các thiết bị dùng trong phương pháp sắc kí

Các thiết bị dùng cho sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng thường khá đơn giản, có thể tự lắp ráp ở các phòng thí nghiệm hóa học bất kì Với các loại sắc kí khác, các theit61 bị

có thể khá phức tạp nhưng thông thường có một số bộ phận chính sau đây: bộ nạp mẫu, cột sắc kí và detectơ Ngoài ra trong thiết bị còn có cấu trúc để nạp khí mang hay dung môi, bộ chuyển đổi các xung của detectơ thành các chỉ số đo cần thiết

- Bộ nạp mẫu cho phép lấy chính xác lượng mẫu đưa vào cột sắc kí Một trong các yêu cầu chính của bộ phận nạp mẫu là phải đảm bảo lặp lại về kích thước mẫu và giữ

được điều kiện nạp mẫu vào cột không thay đổi.Bề mặt bên trong bộ nạp mẫu phải không có các tác dụng hấp phụ, cũng như các hoạt động xác tác làm thay đổi thành phần mẫu phân tích.Với các chất khí, chất lỏng, người ta thường dùng loại bơm đặc biệt, có thể lấy các thể tích mẫu từ một phần đến hàng chục microlit.Không hiếm trường hợp, người ta sử dụng bơm tiêm y tế để lấy mẫu và đưa mẫu vào hệ thống sắc

kí

- Các quá trình tách sắc kí thường được thực hiện trên cột sắc kí Các cột sắc kí rất

đa dạng về hình dáng, kích thước và vật liệu chế tạo Người ta thường dùng loại cột thẳng, cột dạng xoắn…Chiều dài cột có thể từ một, vài mét đến hàng chục mét Đường kính trong của cột có thể từ vài milimet đến hàng chục milimet Tùy thuộc tính chất hệ thống phân tích, vật liệu chế tạo cột có thể là thép, đồng thau, thủy tính từ… Vật liệu chế tạo cột phải bền hóa học, trơ đối với thành phần của mẫu phân tích…

Các chất hấp phụ nhồi vào cột phải có những yêu cầu sau: có tính chọn lọc cần thiết đối với thành phần mẫu nghiên cứu, có độ bền cơ học, bền hóa học và trơ hóa học với các cấu tử trong mẫu phân tích Trong thực tế người ta thường dùng nhôm oxit, silicagel, than hoạt tính, các polime xốp trên cơ sở polistyrol, đivinylbenzen và zeolit tổng hợp… Việc chọn chất hấp phụ tùy thuộc trạng thái tập hợp của các pha, các phương pháp sắc kí và các yếu tố khác

Đối với sắc kí khí thì nhiệt độ rất có ảnh hưởng đến quá trình tách, vì vậy cột sắc kí khí thường phải được ổn nhiệt.Thông thường trong sắc kí khí nhiệt độ thường được giữ ở nhiệt độ phòng, nhưng cũng có trường hợp phải ổn nhiệt ở 0oC hoặc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng

Trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng và vài dạng sắc kí khác, giấy và lớp mỏng, các chất hấp phụ được trải thành lớp mỏng để làm chức năng của cột sắc kí

- Người ta dùng detectơ để phát hiện sự thay đổi thành phần của các chất thoát ra khỏi cột (hoặc là chất khí hoặc là dung dịch) Chỉ số của detectơ thường được chuyển thành tín hiệu điện và được ghi lại bằng các máy chỉ thị thích hợp Các đặc trưng quan trọng của detectơ là độ nhạy, giới hạn dò tìm, quán tính và phạm vi phụ thuộc tuyến tín giữa cường độ tín hiệu với nồng độ Detectơ có thể làm việc theo kiểu vi phân phản ánh sự thay đổi tức thời của nồng độ hoặc theo kiểu tích phân chỉ sự thay đổi tổng cộng của nồng độ sau một khoảng thời gian nào đó

+ Trong các detectơ tích phân để phân tích khí, chất khí thoát ra khỏi cột sẽ được hấp thu nhờ một dung dịch thích hợp, sau đó hoặc phân tích dung dịch hấp thụ hoặc đo thể tích khí còn lại không bị hấp thụ

+ Các detectơ kiểu vi phân bao gồm loại detectơ làm việc theo kiểu dẫn nhiệt, theo mật độ, theo độ dẫn điện, theo độ dẫn nhiệt của ngọn lửa, ngọn lửa ion hóa và các loại detectơ ion hóa khác…

Việc chọn detectơ phụ thuộc tính chất của hệ nghiên cứu, trạng thái tập hợp của các pha và các đặc điểm khác của hệ

9 Các ứng dụng chung của phương pháp sắc kí

Ngày nay phương pháp sắc kí được ứng dụng để tiến hành tách phân li, phân tích nhiều hợp chất khác nhau, vô cơ cũng như hữu cơ Trong việc phân tích các hợp chấthữu cơ, phương pháp sắc kí đóng vai trò chủ đạo

Dùng phương pháp sắc kí người ta có thể tiến hành tách và phân tích nhiều hỗn hợp phức tạp.Người ta cũng có thể dùng phương pháp sắc kí để phân tích các chất rắn khi đưa chúng về trạng thái lỏng (hòa tan vào dung môi thích hợp), hoặc trạng thái khí (gia nhiệt)

Việc phân tích định tính hoặc định lượng các chất theo phương pháp dựa vào các đặc trưng lưu của quá trình sắc kí Tính phổ biến của các phương pháp sắc kí ngày càng gia tăng khi kết hợp sắc kí với phương pháp khối phổ hoặc một phương pháp xác định thích hợp khác

Sắc kí phân bố lỏng – lỏng được sử dụng đặc biệt hiệu quả để phân tích các hợp chất có tính chất hóa học gần giống nhau như các amino axit

Trong phân tích hữu cơ và hóa sinh đặc biệt có ý nghĩa là phương pháp sắc kí giấy,

là một phương pháp sắc kí rất đơn giản và có độ nhạy cao

Phương pháp sắc kí lớp mỏng có độ lặp lại cao, ứng dụng để xác định các chất trong các đối tượng tự nhiên, trong dược phẩm, các mẫu hóa sinh và nhiều đối tượng khác

Phương pháp sắc kí trao đổi ion là phương pháp thích hợp cho việc tách và phân tích các hỗn hợp các ion phức tạp Đây cũng là phương pháp làm giàu các chất vi lượng và có thể áp dụng vào quy mô tách, làm giàu công nghiệp

Để ứng dụng phương pháp sắc kí vào việc phân tích vật chất điều quan trọng là cần chọn một sơ đồ thích hợp cho quy trình tiến hành các quá trình sắc kí

10 Sơ đồ tách và phân tích

II SẮC KÍ CỘT (COLUMN CHROMATOGRAPHY)

Sắc kí cột (sắc kí cột hở) được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển.Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150 µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột

Hệ thống như thế thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả thấp so với sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tuy vậy, sắc kí cột có những ưu điểm như pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu lớn

Chất nghiên cứu

Dễ bay

hơi

Khó bay hơi

Gia nhiệt mạnh

Không phân cực

Sắc kí khí

Phân cực

SK Thuận pha

SK Ngược pha

Phân cực yếu

SK Thuận pha

SK Ngược pha

Bị ion hóa

Không

bị ion hóa

SK trao đổi

Phân cực mạnh

1 Lựa chọn chất hấp thu và dung môi để khởi đầu giải ly

Trong loại sắc kí cột với pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực giải ly sau

Với hai phân tử không phân cực, phân tử có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với phân tử nhỏ, và cũng có khi nó còn ở lại lâu trong cột hơn so với vài phân tử tuy có tính phân cực nhưng có trọng lượng phân tử nhỏ

Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần được trình bày trong bảng 1

Bảng II.1: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần

Loại hợp chất Thứ tự giải ly ra khỏi cột

Hydrocarbon Nhanh, với dung môi không phân cực

1.2 Chọn dung môi bắt đầu cho quá trình sắc kí cột

Trước khi triển khai sắc kí cột, nhất thiết phải sử dụng sắc kí lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước như sau:

Bước 1: Mẫu cần sắc kí được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A)

Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5 x 10 cm Chấm lên những tấm bản này, mỗi tấm một chấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A)

Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi dung ly khác nhau, kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc các thuốc thử Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, ví dụ: hexan : etyl acetate

Bước 4:

* Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của một phản ứng tổng hợp hữu cơ

(hỗn hợp chứa 2 – 3 hợp chất), hãy chọn hệ dung môi nào mà có thể đẩy hợp chất cần quan tâm lên ở vị trí trên bản với Rf = 0,2

* Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, (cao có chứa nhiều hợp chất

từ không phân cực đến rất phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có

thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với Rf = 0,5 và chọn dung

môi chấm dứt sắc kí cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết, lên

vị trí ở bản với Rf = 0,2

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc kí cột

Lưu ý:

* Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và của sắc kí cột giống nhau

* Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm nêu trên, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn Bởi vì chất hấp thu, ví dụ silicagel, tráng trên bản mỏng là loại silicagel dùng cho sắc kí lớp mỏng, với cỡ hạt nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên

bản bằng áp lực lớn nên có độ chặt chẽ lớn Trong khi đó chất hấp thu do ta tự nạp cột trong phòng thí nghiệm là loại silicagel dung cho sắc kí cột, với cỡ hạt lớn hơn, lại được nạp vào cột ở áp suất thường nên có tính lỏng lẻo hơn

2 Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột

Muốn tách chất dược tốt, các kết quả thực nghiệm cho thấy có mối liên quan giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột

2.1 Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng

Các khảo sát thực nghiện cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25 – 50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc kí Tuy nhiên, với những hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100 – 200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn

Vì thế, trước khi tiến hành sắc kí, phải dự đoán rằng với một lượng mẫu chất muốn tách (x gam) phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chất hấp thu chiếm một chiều cao phù hợp trong cột mà cột vẫn còn chỗ để chứa dung môi Với lượng chất hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc kí với kích thước phù hợp

2.2 Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong của cột sắc

kí

Các khảo sát thực ngiệm cho thấy, muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp

thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: chiều cao chất hấp thu: đường kính trong của cột vào khoảng 10:01

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dung một bông thủy tinh để chặn, tiếp theo phủ các lên để có được một mặt bằng phẳng

Chất hấp thu được nạp vào cột ở dạng sệt được chuẩn bị như sau:

- Trong một becher đã có chứa sẵn dung môi (loại dung môi ít phân cực nhất được dung cho quá trình bắt đầu giải ly cột), cho chất hấp thu vào becher, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều Không được thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt,

có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất Lượng dung môi phải vừa đủ để dung môi không bị quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng

- Dùng một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa

mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột

Rót dung dịch sệt vào đầu cột

ngang qua một phễu có đuôi dài

- Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột

- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất Lưu ý trong quá trình nạp cột, không được để cho đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn phải có dung môi phủ trên phần đầu cột

- Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu phải nằm ngang Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đão nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo trộn một phần chất hấp thu ở trên đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng

Đối với loại chất hấp thu có thể trương nở, cần có thời gian để chúng trương nở Thường người ta thêm đủ lượng dung môi để làm thành hỗn hợp sệt và để yên suốt một đêm, hôm sau thêm dung môi vào để hỗn hợp sệt có thể rót chảy, để rót vào cột

3.2 Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột

Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng 2/3 chiều cao cột Ngang qua một phễu lọc có đuôi dài, cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong vột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vào vừa khõ nhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2

cm trong cột, thì mở nhẹ khóa bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này được sử dụng để rót trả lại lên đầu cột

Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất

Cả 2 cách nhồi cột đều cho kết quả tốt nếu thực hiện việc nạp cột một cách cẩn thận Trong trường hợp sau khi nạp xong, quan sát thấy có nhiều bọt khí, có những

“bất thường” trong cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ đầu

4 Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc kí

4.1 Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch

Nếu mẫu ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp lên đầu cột sắc kí Nếu mẫu ở dạng rắn, hòa tan mẫu chất vào một lượng nhỏ dung môi khởi đầu cho sắc kí cột