KIỂM NGHIỆM bài sắc kí GIẤY

Nguyên tắc  Giấy làm giá mang pha tĩnh  Pha tĩnh và pha động đều là chất lỏng  Pha tĩnh được hấp phụ trong các lỗ xốp của chất mang  Pha tĩnh thường là nước  Sau khi chấm hỗn hợp ph

Saéc Kyù Giaáy (Paper Chromatography)

Nguyên tắc

 Giấy làm giá mang pha tĩnh

 Pha tĩnh và pha động đều là chất lỏng

 Pha tĩnh được hấp phụ trong các lỗ xốp của chất mang

 Pha tĩnh thường là nước

 Sau khi chấm hỗn hợp phân tích trên giấy, cho dung môi thứ hai (pha động) đi qua, các cấu tử của hỗn hợp sẽ được phân bố thành từng vùng trên giấy

 Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả tách Sự cân bằng giữa pha tĩnh và pha động đòi hỏi dụng cụ để SKG phải thật kín và có giá đỡ giấy sắc ký Để tách tốt, hướng chuyển động của dung môi phải trùng với hướng sợi giấy

Trang thiết bị – Giấy sắc ký

 Cellulose tinh khiết: độ dày và độ hút khác nhau  hiệu lực tách khác nhau

 Hút nước

 Tách các chất hữu cơ không tan trong nước: tẩm thêm một chất kỵ nước (dầu silicon, dầu parafin)

 Các thông số kỹ thuật:

 Độ dày (mm)

 Trọng lượng (g/m2)

 Chiều cao thấm nước trong một đơn vị thời gian

 Thời gian khai triển một đoạn dung môi (h)

Trang thiết bị – Giấy sắc ký

 Điều kiện lựa chọn

 Sức cản vừa đủ

 Đồng nhất về cỡ hạt và tỷ trọng

 Tinh khiết hóa học

 Ít hấp phụ

 Giấy Whatman (Wh)

Giấy

Wh

Số

Trọng lượng (g/m 2 )

Độ dày (mm)

Thời gian hút nước đến độ cao 7,5 cm

Thời gian khai triển một đoạn dung môi 40 cm

Đặc điểm

Trang thiết bị – Giấy sắc ký

 Giấy FN

Giấy FN

số

Trọng lượng (g/m 2 )

Độ dày (mm)

Mức hút nước/30 phút (mm)

Tương đương giấy Wh

Trang thiết bị – Giấy sắc ký

 Các loại giấy sắc ký thường dùng

Whatman

Schilcicher & Schull

Arches Durieux

Grycksbo

Papersbruck

FN

1

2

3

4

7

17

20

31 2040a 2040b 2043a 2043b 2045a 2045b 598G 602hp

1101

1104 1,2 3,4 5,6 7,8

Hay dù ng nhấ t Chả y chậ m (dù ng cho acid amin, peptid, protein) Giấ y dà y, chả y trung bình

Có tố c độ chả y lớ n (dù ng cho acid amin và đườ ng) Hạt giấ y lớ n, tố c độ chả y trung bình giữ a 1 và 4 Rấ t dà y và mề m, tố c độ chả y trung bình (dù ng điệ n di và sắ c ký sơ khở i trê n tỷ lệ nhỏ ) Chả y rấ t chậ m, đô i khi dù ng để tá ch cá c acid amin

Giấ y dà y, rử a vớ i acid, chả y nhanh Mề m, nhanh (bằ ng vớ i Whatman cỡ số 4) Mề m, dà y hơn loại 2040a

Cứ ng, nhanh trung bình (bằ ng vớ i Whatman cỡ số 1) Cứ ng, nhanh trung bình, dà y hơn loại 2043a

Cứ ng, rấ t chậ m Cứ ng, rấ t chậ m, dà y hơn loại 2045a Mề m, dà y và nhanh (dù ng cho sắ c ký đi lê n) Lá ng, cứ ng và chậ m

Chậ m và tương đố i dà y Nhanh trung bình, tương đố i dà y Nhanh

Trung bình Chậ m Nhanh

Trang thiết bị – Dung môi

 Dung môi làm pha tĩnh thường là các dung dịch nước

 Pha động thường là dung môi có độ phân cực thấp hơn pha tĩnh

 Dung môi phải đạt các yêu cầu sau:

 Tinh khiết

 Dung môi dùng làm pha động và pha tĩnh không hỗn hòa nhau

 Độ tan và hệ số phân bố của các cấu tử phải khác nhau trong 2 pha Độ tan của các cấu tử trong pha động nên nhỏ hơn trong pha tĩnh

 Thành phần dung môi trong quá trình sắc ký không được biến đổi

 Dung môi dễ loại khỏi giấy

Trang thiết bị – Pha tĩnh

 Nước và dung dịch nước: Giấy sắc ký được nhúng vào dung dịch nước rồi làm khô tự

nhiên, sau đó cho vào bình bão hòa hơi nước Với pha tĩnh là nước có thể nhúng giấy vào nước, rồi treo giấy lên cho chảy hết nước dư hoặc treo giấy vào môi trường bão hòa hơi nước trong một thời gian đủ để giấy bão hòa hơi nước

 Các dung môi thân nước (các alcol): Treo giấy vào bình đã bão hòa hơi dung môi pha

tĩnh (MeOH, EtOH) hoặc nhúng giấy vào dung dịch pha tĩnh Trong trường hợp hệ dung môi hai pha thì pha thân nước làm pha tĩnh, pha kỵ nước làm pha động

 Dung môi hữu cơ không phân cực (đảo pha): Để tách các chất hữu cơ không tan trong

nước người ta dùng SKG đảo pha Giấy được tẩm dung môi không phân cực (silicon/n-hexan) hay được ankyl hóa, acetyl hóa

Trang thiết bị – Pha động

 Dung môi làm pha động trong SKG thường có tính phân cực hơn dung môi pha

động trong SKLM

 Một số hệ dung môi thường dùng trong SKG

 Isopropanol - amoniac - nước (9:1:2), (6:3:1)

 n-BuOH - acid acetic - nước (4:1:5), (4:1:1)

 Giấy được thấm bằng formamid 40% trong EtOH, pha động là

chloroform (formamid // chloroform)

 Formamid // benzen - chloroform (Tỷ lệ pha động benzen – chloroform

thay đổi từ 1:9 đến 9:1 tùy thuộc tính tan của chất cần phân tích)

 Formamid // benzen

 Formamid // benzen - cyclohexan (1:9 đến 9:1)

 Dimetylformamid // cyclohexan (pha tĩnh là dung dịch dimetylformamid

50% trong EtOH)

 Kerosene // 70% isopropanol (pha tĩnh là kerosene 10-20% trong ete dầu

hỏa)

 Dầu parafin // dimetylformamid - MeOH - nước (10:10:1) (pha tĩnh là

dung dịch dầu parafin 10% trong benzen)

Các chất tan nhiều

trong nước

Các chất ít thân

nước

Các chất kỵ nước

Trang thiết bị – Bình sắc ký – Dụng cụ khác

 Bình sắc ký

 Thủy tinh, nắp đậy kín, mép mài nhám, không dùng nút cao su

 Hình trụ hay hình hộp chữ nhật với nhiều kích thước khác nhau

 Có thể dùng ống nghiệm hay ống đong có nút hay nắp kín

 Các dụng cụ khác

 Dụng cụ chấm sắc ký: ống mao quản, micropipet

 Tủ sấy giấy sắc ký

 Bình phun thuốc thử hay khay nhúng thuốc thử

 Kẹp plastic, inox

Quá trình và kỹ thuật sắc ký

 Chuẩn bị: bình sắc ký, dung môi, giấy sắc ký

 Chấm dung dịch lên giấy

 Khai triển sắc ký

 Phát hiện các vết trên giấy

 Màu sắc tự nhiên của vết

 Phun thuốc thử cho màu đặc trưng

 Soi UV

 Vị trí các vết trên sắc ký đồ: Rf hay Rs

Các kỹ thuật khai triển SKG

 Sắc ký đi lên

Sắc ký đi lên

Đầu giấy có chấm chất phân

tích nhúng vào dung môi ở

đáy bình Pha động chạy lên

nhờ lực hút mao quản

Chậu đựng dung môi

và tách các chất có

Trọng lực tác

chiều với lực hút mao quản nên tốc độ hút giảm nhanh khi đã chạy lên

Các kỹ thuật khai triển SKG

 Sắc ký đi xuống

Sắc ký đi xuống

Đầu giấy có chấm chất phân

tích nhúng vào máng dung

môi Pha động chạy từ trên

xuống nhờ trọng lực

- Có thể tách các chất có R f khác nhau nhỏ

Dụng cụ phức tạp hơn phương pháp khác

Các kỹ thuật khai triển SKG

 Sắc ký đi ngang – Sắc ký hình tròn

Sắc ký đi ngang

Giấy cắt hình vuông hoặc

hình chữ nhật được đặt nằm

ngang trên các đũa thủy tinh

Đầu giấy chấm chất phân

tích nhúng vào chậu dung

môi

- Dụng cụ đơn giản có thể đặt trong tủ ấm hoặc tủ lạnh

- Định lượng nhanh đường, acid amin, chất béo

Phương pháp Giấy và kiểu dụng cụ Ưu điểm

Sắc ký hình tròn

Giấy cắt hình tròn, có một

bấc, được nhúng vào chén

dung môi Pha động đi từ

tâm ra ngoài theo vòng tròn

chính xác

hơn các phương pháp trên

định tính

với chất mẫu có khó khăn

Ứng dụng của SKG

 Định tính và thử tinh khiết

 Dựa vào Rf

 Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A trên cùng một sắc đồ

 Điều kiện X là A: Rf(X) = Rf(A) với các hệ dung môi khác nhau

 Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ

 Bán định lượng – định lượng

 Đo chiều dài hay đo diện tích của vết (bằng máy, bằng cách cân khoanh giấy có vết, đếm ô vuông,…)

 Đo cường độ màu của vết (bằng máy, bằng mắt)

 Phương pháp rửa: cắt khoanh giấy có vết, chiết bằng dung môi rồi định lượng bằng các phương pháp thích hợp

Ứng dụng của SKG

 SKG theo cơ chế kết tủa

 Giấy là chất mang chứa thuốc thử làm kết tủa

 Pha động chứa chất tan

 Sự tạo thành kết tủa xảy ra trên bề mặt giấy do tương tác của các phân tử thuốc thử bị hấp phụ trên giấy với các ion trong pha động

 Một số ion có thể sắc ký kết tủa trên giấy

Ion Chất làm kết tủa Hàm lượng chất kết tủa (%) Thuốc thử phát hiện - màu

Ưu và nhược điểm của SKG

 Ưu điểm:

 Kỹ thuật và dụng cụ đơn giản, dễ thực hiện

 Phương pháp vi phân tích vì lượng mẫu cần dùng nhỏ (  1  g)

 Có thể ứng dụng để xác định nhiều chỉ tiêu như định tính, định lượng, xác định tạp liên quan,…

 Hiện là phương pháp đơn giản nhất để tách và phát hiện các hợp chất có chứa nguyên tố phóng xạ

 Nhược điểm:

 Không làm sắc ký chế hóa bằng SKG

 Không dùng được các hóa chất có tính ăn mòn trong phát hiện vết

 Thời gian khai triển lâu từ 4 - 5 giờ (thậm chí từ 2 -3 ngày)

 Giấy dễ hấp phụ các chất khác có trong môi trường nên phải bảo quản giấy sắc ký thật kỹ