Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa

MỞ ĐẦU MỤC TIÊU VÀ GIỚI HẠN ĐỀ TÀI Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây lúa 1.2. Tình hình sản xuất Lúa 1.2.1 Trên thế giới 1.2.2. Tình hình sản xuất gạo ở Việt Nam 1.3. Giá trị dinh dưỡng của hạt gạo 1.4. Phẩm chất hạt gạo 1.5. Độ trở hồ 1.5. Chỉ thị phân tử 1.6. SSR marker (Simple sequence repeat (microsatellite)) 1.7 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 1.7.1 Giới thiệu về PCR. 3 1.7.2 Nguyên tắc chung 1.7.4 Các yếu tố của phản ứng PCR: 1.7.4 Quy trình khuếch đại 1.8. Điện di Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá kiểu hình 2.2.2. Đánh giá kiểu gen 2.2.2.1. Ly trích DNA (Mini scale)1. 2.2.2.2. Kiểm tra chất lượng và số lượng DNA . 2.2.2.3. Khuyếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR . 3.2.2.4. Kiểm tra sản phẩm PCR Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân nhóm di truyền bằng kiểu hình 3.1.1 Kiểu hình của các giống lúa 3.1.2. Kiểu hình của các hạt lúa được thu tập trên ngọn 3.2. Đánh giá di truyền của độ trở hồ 3.4.Kết quả so sánh giữa kiểu gen và kiểu hình KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

MỞ ĐẦU

Là nước xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới, Việt Nam không chỉ quan tâm đến việc tăng năng suất cây lúa, mà còn phải nghiên cứu phát triển những giống lúa có phẩm chất tốt để cạnh tranh giữ vững vị thế của mình và tăng giá trị hạt gạo Việt Nam, đưa hạt gạo Việt Nam xâm nhập sâu vào các thị trường khó tính, mang lại lợi ích kinh tế cho người nông dân

Thị yếu người tiêu dùng luôn luôn quan tâm đến phẩm chất của cơm, đây là một chỉ tiêu quan trọng nó không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng amylose, độ bền gel mà còn phụ thuộc rất nhiều vào độ trở hồ của hạt gạo

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, sinh học phân tử đã đóng góp rất lớn vào việc tạo và chọn những giống lúa mới có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với điều kiện tự nhiên của từng địa phương Ứng dụng marker phân tử trong chọn giống giúp chúng ta lựa chọn một cách nhanh chóng, chính xác đặt tính của giống mà không bị chi phối bởi ảnh hưởng của môi trường Với những ưu điểm vượt trội so với marker hình thái và isozyme markers về số lượng, thời gian thí nghiêm, độ tin cậy, đơn giản… marker phân tử đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong việc chọn giống tốt phục vụ cho ngành nông nghiệp

Đề tài: “Ứng dụng marker phân tử xác định độ trở hồ một số giống lúa.” để phục

vụ cho việc nghiên cứu chọn giống lúa có phẩm chất tốt

MỤC TIÊU VÀ GIỚI HẠN ĐỀ TÀI

Giới hạn của đề tài

Đề tài này được tiến hành chỉ tập trung phân tích đối tượng là những giống lúa mới của Viện lúa Đông Bằng Sông Cửu Long

Hình 1.1 Cây lúa

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây lúa

Lúa (Oryza spp.) là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới, cùng với ngô (Zea Mays L.), lúa mì (Triticum sp tên khác: tiểu mạch), sắn (Manihot esculenta Crantz, tên khác khoai mì) và khoai tây (Solanum tuberosum L.)

Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa

Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu lục

địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm

và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá

trình trôi dạt lục địa Hiện nay có khoảng 21

loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa

được đã thuần hoá là lúa châu Á (Oryza sativa)

và lúa châu Phi (Oryza glaberrima) Lúa có

nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

khu vực đông nam châu Á và châu Phi Hai loài

này cung cấp hơn 1/5 toàn bộ lượng kalo tiêu

thụ bởi con người Lúa là các loài thực vật sống

một năm, có thể cao tới 1-1,8 m, đôi khi cao

hơn, với các lá mỏng, hẹp bản (2-2,5 cm) và dài

50-100 cm Các hoa nhỏ thụ phấn nhờ gió mọc

thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ

xuống, dài 30-50 cm Hạt là loại quả thóc (hạt

nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5-12

mm và dày 2-3 mm Cây lúa non được gọi là

mạ Sau khi ngâm ủ, người ta có thể gieo thẳng các hạt thóc đã nảy mầm vào ruộng lúa đã được cày, bừa kỹ hoặc qua giai đoạn gieo mạ trên ruộng riêng để cây lúa non có sức phát triển tốt, sau một khoảng thời gian thì nhổ mạ để cấy trong ruộng lúa chính Sản phẩm thu được từ cây lúa là thóc Sau khi xát bỏ lớp vỏ ngoài thu được sản phẩm chính là gạo và các phụ phẩm là cám và trấu Gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số

Hình 1.2 Ruộng lúa

thế giới, điều này làm cho nó trở thành loại lương thực được con người tiêu thụ nhiều nhất Trong tiếng Anh, từ rice (lúa, gạo) có nguồn

gốc từ arisi trong tiếng Tamil [11]

Theo Vũ văn Hiển và Nguyễn Văn Hoan (1999)

thì dựa theo hệ thống phân loại học thực vật: cây

lúa được xem như tất cả các loại cây cỏ khác

trong tự nhiên Nó được sắp xếp theo hệ thống

chung của phân loại học thực vật là nghành

(divisio), lớp (class), bộ (ordines), họ (familia),

chi (genus), loài (species) và biến chủng

(varietas)

Nghành (Divisio): Angiospermae – Thực vật có hoa

Lớp ( Class): Monocotylledones – Lớp một lá mầm

Bộ (Ordine): Poales (Graminales) – Hòa thảo có hoa

Họ (Familia): Poacae (Graminae) – Hòa thảo

Họ phụ (Subfamilia): Poidae – Hòa thảo ưa nước

Chi (Genus): Oryza

Loài (Species): Oryza sativa – Lúa trồng

Loài phụ (Subspecies): Japonica – Loài phụ Nhật Bản

India – Loài phụ Ấn Độ

Javanica – Loài phụ Java

Biến chủng (Varietas): Var Mutica – Biến chủng hạt mỏ cong

* Đặc điểm thực vật của cây lúa [10]

Các giống lúa khác nhau có những đặc điểm như chiều cao, thời gian sinh trưởng, tính chịu mặn, chống chịu sâu bênh, hạn hán…là khác nhau Song các giống lúa đều có

đặc tính chung về hình thái, giải phẫu và đều có chung các bộ phận rễ, thân, lá, bông và hạt

- Bộ rễ: là rễ chùm, những rễ non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành có màu vàng nâu và nâu đậm, những rễ già có màu đen Thời kì mạ rễ thưa và có chièu dài khoảng 5-6

cm, sau đó bộ rễ tăng dần và đến thời kì trỗ bông bộ rễ đạt tối đa có thể tới 500-800 cái

- Thân lúa: thân gồm nhiều mắt và lóng, thời kì lúa trổ thân được bao bọc bởi bẹ lá Tổng số mắt trên thân bằng tổng số lá trên thân công thêm 2, chỉ vài lóng ở ngọn là dài ra còn số còn lại là ngắn và đặc, lóng trên cùng dài nhất

- Lá lúa: lá lúa điển hình gồm bẹ lá, phiến lá, lá thìa và tai lá Lá được hình thành

từ các mầm lá ở thân Tốc độ ra lá phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh Số lá trên cây phụ thuộc chủ yếu vào giống, vụ, biện pháp bón phân, quá trình chăm sóc

- Bông: bao gồm bầu nhị, vỏ trầu và bao phấn Lúa là cây tự thụ phấn, sau khi trỗ một ngày thì quá trình tự thụ bắt đầu Vỏ trấu vừa hé mở 0-4 phút thì bao phân vở ra, hạt phấn rơi vào đầu nhụy và hợp nhất với nõn ở bên trong bầu nhụy để bầu nhụy phát triển thành hạt Thời gian thụ phấn từ lúc vỏ trấu mở ra đến lúc khép lại kéo dài 50-60 phút, thời gian thụ tinh kéo dài 8 giờ sau khi thụ phấn Sau khi thụ tinh phôi nhũ phát triển nhanh thành hạt, khối lượng hạt tăng dần trong vòng 15-20 ngày sau khi trỗ, đồng thời quá trình vận chuyễn và tích lũy vật chất, hạt lúa vào chắc và chín dần

* Thời gian sinh trưởng, người ta chia cây lúa ra ba thời kỳ sinh trưởng (Hình 2.4) Trong mỗi thời kỳ, nhu cầu thức ăn của cây luôn khác nhau Dinh dưỡng thích hợp cho cây sẽ giúp gia tăng năng suất của nó Ba thời kỳ đó là:[4]

- Thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng: từ lúc nảy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân hóa đòng Các giống lúa có thời gian sinh trưởng khác nhau là do sự dài ngắn khác nhau của thời kỳ này quyết định Trong thời kỳ này, cây lúa phát triển về thân lá, chiều cao và

nở bụi

- Thời kỳ sinh trưởng sinh dục: từ lúc phân hóa đòng đến khi lúa trổ bông Thời gian này kéo dài khoảng 35 ngày, các giống khác nhau có thời gian này không khác nhau

nhiều lắm Trong thời gian này, chiều cao cây tăng lên rõ rệt do sự vươn dài của các lóng, giảm số chồi vô hiệu, xuất hiện lá đòng (lá cuối cùng), đòng lúa hình thành và phát triển qua nhiều giai đoạn, cuối cùng thoát khỏi bẹ của lá cờ Giai đoạn này quyết định trọng lượng hạt rất lớn

Hình1.3: Ba thời kỳ sinh trưởng của cây lúa

- Thời kỳ chín: từ lúc trổ hoa đến khi thu hoạch Thời gian kéo dài khoảng 30 ngày đối với hầu hết các giống Giai đoạn này theo sau sự thụ tinh và trải qua các giai đoạn: chín sữa, chín sáp và chín hoàn toàn Trong ba giai đoạn này, giai đoạn chín sữa rất quan trọng, quyết định lớn đến trọng lượng hạt Tinh bột được tích lũy vào hạt trong giai đoạn này từ sự vận chuyển các chất dự trữ trong thân lá và sản phẩm quang hợp

1.2 Tình hình sản xuất Lúa

1.2.1 Trên thế giới

Trên thế giới, cây lúa được 250 triệu nông dân trồng, là lương thực chính của 1,3 tỉ người nghèo nhất trên thế giới, là sinh kế chủ yếu của nông dân Là nguồn cung cấp năng lượng lớn nhất cho con người, bình quân 180 - 200 kg gạo/ người/ năm tại các nước Châu

Á , khoảng 10 kg/người/năm tại các nước châu Mỹ Châu Á là nơi sản xuất và cũng là nơi tiêu thụ khoảng 90% lượng gạo toàn thế giới

Ở Châu Phi, gần như toàn bộ 38 nước đều trồng lúa, song diện tích lúa ở Madagascar và Nigeria chiếm 60 %, tổng diện tích lúa là 8,5 triệu hecta của châu lục này Năng suất lúa của Châu Phi thấp, khoảng 1,5 tấn/ha, hay bằng 40 % năng suất của Châu

Á

Sản xuất gạo toàn cầu đã tăng lên đều đặn từ khoảng 200 triệu tấn vào năm 1960 tới 600 triệu tấn vào năm 2004 Gạo đã xay xát chiếm khoảng 68% trọng lượng thóc ban đầu

Các số liệu về xuất nhập khẩu gạo lại khác hẳn, do chỉ khoảng 5-6% gạo được buôn bán ở quy mô quốc tế Ba nhà xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới là Thái Lan (26% sản lượng gạo xuất khẩu), Việt Nam (15%) và Hoa Kỳ (11%), trong khi ba nhà nhập khẩu gạo lớn nhất là Indonesia (14%), Bangladesh (4%) và Brasil (3%) Ngành sản xuất lúa gạo nước ta trong những năm vừa qua đã có những bước chuyển tích cực Nó đã thực sự giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế đất nước Hàng năm, ngành lúa gạo đã đóng góp từ

12 – 13% trong tổng GDP

1.2.2 Tình hình sản xuất gạo ở Việt Nam

Ở Việt Nam, dân số trên 85 triệu và 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo làm lương thực chính Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía bắc và đồng bằng sông Cửu Long ở miền Nam Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33-

34 triệu tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau khi xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia.[15]

Việt Nam là nước xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới chỉ sau Thái Lan, diện tích trồng lúa nước ta xếp vào hàng thứ 7 song xếp thứ 4 về năng suất Năng suất lúa của nước

ta ở năm 2004 đứng đầu trong các nước Đông Nam Á và đã đạt bình quân là 48,2 tạ/ha

Theo số liệu của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn, thành tựu sản xuất lúa gạo của nước ta là rất to lớn và vững chắc Nếu giai đoạn 1975-1980 sản lượng thóc nước

ta mới chỉ xung quanh 10-11 triệu tấn thì đến năm 1990 đã có dư 0,8 triệu tấn gạo với sản

lượng thóc là 19,2 triệu tấn, năm 2000 sản lượng lúa đã tăng lên 32,5 triệu tấn, đưa nước

ta vào một trong năm nước có sản lượng thóc lớn nhất thế giới Năm 2009 nước ta xuất khẩu 6 triệu tấn gạo, dự kiến năm 2010 sẽ xuất khẩu trên 6 triệu tấn

Giá xuất khẩu gạo của chúng ta đã không thua kém nhiều so với Thái Lan Là mặt hàng có giá trị xuất khẩu đứng thứ 5, lúa gạo đã đem về cho đất nước mỗi năm từ 600 –

800 triệu USD Không những thế nó còn có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực trên toàn thế giới Đứng thứ 2 về xuất khẩu gạo, nước ta mỗi năm góp từ 13 – 17% lượng gạo xuất khẩu trên toàn thế giới.[10]

Theo báo cáo ban đầu của Bộ kế hoạch đầu tư mà Reuters có được về vụ mùa ở nam Việt Nam cho biết sản lượng sẽ tăng do năng xuất tăng nhẹ, đạt 6,38 tấn/ha vào năm

2010, cao hơn năm 2009 0,02 tấn/ha Đồng bằng sông Cửu Long sẽ sản xuất 54% sản lượng lúa Việt Nam, nhưng sẽ cung cấp 90% lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam [14] 1.3 Giá trị dinh dưỡng của hạt gạo

- Protein: Các giống lúa Việt Nam có hàm lượng Protein chủ yếu trong khoảng 7- 8% Các giống lúa Nếp có hàm lượng protein cao hơn lúa tẻ Gạo giã càng trắng thì lượng protein càng giảm

- Lipit: Chủ yếu ở lớp vỏ gạo Nếu ở gạo xay là 2,02% thì ở gạo đã xát chỉ còn 0,52%

- Vitamin: Trong lúa gạo còn có một số vitamin nhất là vitamin nhóm B như B1, B2, B6, PP lượng vitamin B1 là 0,45 mg/100 hạt ( trong đó ở phôi 47%, vỏ cám 34,5%, hạt gạo 3,8%) Chất béo trong gạo thấp, từ 1-1,5% Gạo có ít Canxi, nhiều Phospho nên gạo là thức ăn có tính acit So với protein của trứng thì protein của gạo thiếu Lysin, vì vậy khi dùng nên phối hợp gạo với thức ăn động vật và đậu đỗ

Có khoảng 2 tỉ người ở Châu Á dùng gạo và các chế phẩm từ gạo để bổ sung 60 % tới 70 % nguồn năng lượng hàng ngày cho cơ thể Gạo là nguồn cung cấp năng lượng chính trong bữa ăn hàng ngày của chúng ta, gạo là một nguồn cung cấp năng lượng cho

cơ thể Trong gạo hàm lượng tinh bột 62,4% Là nguồn chủ yếu cung cấp kalo Giá trị nhiệt lượng của lúa là 3594 kalo Tinh bột được cấu tạo bởi amylose và amylopectin

Amylose có cấu tạo mạch thẳng và có nhiều ở gạo tẻ Amylopectin có cấu tạo mạch ngang và có nhiều ở gạo nếp

Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của lúa tính theo % chất khô so với một số cây lấy hạt khác [4]

Tinh bột Protein Lipit Cellulose Tro Nước

vị không… Chất lượng hạt cơm bao gồm có: hàm lượng amylose, độ trở hồ, độ bền gel; hàm lượng dinh dưỡng bao gồm: protein, vitamin, khoáng vi lượng…

Hình 1.4 Hạt gạo

Các đặc tính phẩm chất hạt do yếu tố di truyền và môi trường quyết định, tùy theo tính trạng, sự thể hiện có thể do yếu tố di truyền, yếu tố kỹ thuật trước và sau khi thu hoạch hay do tương tác kiểu gen và môi trường quyết định Điều khó khăn cho phân tích

là phần lớn những tính trạng phẩm chất hạt có tương tác kiểu gen và môi trường không tuyến tính, khó giải thích trong những phân tích đơn giản (Bùi Chí Bửu, 1996) Chiều dài hạt gạo là tính trạng ổn định nhất, ít bị ảnh hưởng bởi môi trường, được điều khiển bởi đa gen (Somrith, 1974) Thứ tự tính trội được ghi nhận như sau: hạt dài > hạt trung bình > hạt ngắn > hạt rất ngắn Thị hiếu người tiêu dùng về dạng hạt rất thay đổi, có nơi thích dạng hạt tròn, có nơi thích dạng hạt gạo dài trung bình, nhưng dạng hạt gạo thon dài là được tiêu thụ nhiều nhất trên thị trường quốc tế (Khush và ctv, 1979)

1.5 Độ trở hồ

Độ trở hồ (GT) là tính chất vật lý thể hiện sự biến đổi của tinh bột từ trạng thái này sang trạng thái khác và không hoàn nguyên khi nhiệt độ tăng ở ngưỡng xác định Mức độ của độ trở hồ từ 55 – 790C lúc ấy gạo biến thành cơm và không hoàn nguyên Theo T.S Nguyễn Công Thành, Trung tâm CG TBKT, Viê ̣n Lúa ĐBSCL thì GT trung bình là điều kiện tối hảo cho chất lượng gạo tốt [14] GT thường liên quan tới tỉ lệ gạo lứt nhiều hơn

GT được kiểm soát bởi đơn gen, nhưng một vài tác giả đã công bố nó được kiểm soát bởi

đa gen

Cấu trúc hạt tinh bột là do sự sắp xếp không gian của sợi amylose và amylopectin hình thành Khi có tác động của nhiệt độ hoạt hóa chất thì cấu trúc này bị phá vỡ và làm biến dạng hạt tinh bột, quá trình này được gọi là sự hồ hóa (gelatinization), nhiệt cần thiết cho quá trình này gọi là nhiệt độ trở hồ (genlatinization temperature_GT) Nhiệt trở hồ là nhiệt độ nấu mà khi lên đến đó nước được hấp thụ và hạt tinh bột phồng lên không hoàn nguyên, đồng thời dạng tinh thể biến mất Nhiệt trở hồ thường từ 55-790C được chia thành 3 nhóm chính sau:

Thấp dưới 700C

Trung bình 70-740C

Cao trên 740C

Đặc tính vật lý của cơm liên quan nhiều đến nhiệt độ trở hồ hơn là hàm lượng amylose của tinh bột Gạo có nhiệt độ trở hồ càng cao càng ít nở, cần nhiều nước và thời gian nấu chín hơn do vậy nó làm cho hạt cơm đổ lông khi nấu, đồng thời nó còn phản ảnh

độ cứng của tinh bột và phôi, vì thế ảnh hưởng đến sự tấn công của côn trùng, nấm và vi khuẩn trên lúa ở ngoài đồng cũng như khi tồn trữ trong điều kiện ẩm ướt Có một số bằng chứng cho thấy GT cao ít bị thiệt hại hơn so với gạo có GT thấp Nhiệt độ không khí cao sau khi trổ làm tăng GT (làm giảm phẩm chất hạt) và ngược lại

Nhiệt độ trở hồ liên quan một phần đến hàm lượng amylose của tinh bột, là yếu tố quyết định phẩm chất gạo khi nấu Trong một số trường hợp, các nhà chọn tạo giống có thể dựa vào cách thử nhiệt độ trở hồ đơn giản để ước lượng hàm lượng amylose Việc chọn giống căn cứ trên tiêu chuẩn hàm lượng amylose là chính, thị hiếu của người tiêu dùng có thể quyết định tiêu chuẩn chọn giống có hàm lượng amylose cao hay thấp, hàm lượng amylose ảnh hưởng đến độ mềm, độ bóng và màu sắc của hạt cơm Theo tiêu chuẩn của hệ thống đánh giá của viện lúa quốc tế - IRRI (1996) thì hàm lượng amylose trong gạo được xếp thành 4 nhóm sau:

0-2% rất thấp (nếp)

2-20% thấp (gạo dẻo)

20-25% trung bình (mềm cơm)

Trên 25% cao (cứng cơm)

Gạo có hàm lượng amylose thấp thường ít hút nước, ít trương nở trong lúc nấu và cơm có độ bóng cao

Việc xác định hàm lượng amylose đòi hỏi thiết bị phức tạp và khó thực hiện Trong khi xác đinh nhiệt độ trở hồ thì đơn giản và nhanh chóng nên ta có thể áp dụng tính chất này để ước lượng nhanh về hàm lượng amylose của giống lúa Tuy nhiên sự ước lượng này chỉ có thể sử dụng cho giống lúa có hàm lượng amylose thấp vì nó liên hệ rõ rệt đến nhiệt độ trở hồ cao, còn việc chọn giống có hàm lượng amylose trung bình và cao đòi hỏi nhà chọn giống phải phân tích chỉ tiêu hàm lượng amylose

Dưới đây là kết quả đã ghi nhận được mối liên hiện giữa độ trở hồ và hàm lương amylose

Bảng 1.2 Nhiệt độ trở hồ và hàm lượng amylose của một số giống lúa

Nhiệt độ trở hồ Lượng amylose Ví dụ

Thấp Trung bình Cao

Century Patna 231 CICA 4

Peta, IR5 Japonica nhiều dòng lai IR8

Và vẫn chưa ghi nhận được hoặc rất hiếm xuất hiện tổ hợp của hàm lượng amylose với các phẩm chất khác của gạo (hàm lượng amylose và độ bền gel) sau khi điều tra 245 giống lúa của 27 quốc gia:

- Độ trở hồ cao (hoặc trung bình) và amylose cao

- Độ trở hồ cao (trung bình) và gel trung bình (cứng)

- Độ trở hồ trung bình và amylose rất thấp (nếp): rất hiếm xuất hiện

Độ trở hồ được đánh giá qua độ lan rộng và trong suốt của hạt gạo khi xử lý bằng KOH 1,7% ở 300C trong 23 giờ Gạo có nhiệt độ trở hồ thấp sẽ hòa tan hoàn toàn và trong suốt, loại có nhiệt độ trở hồ trung bình sẽ rã một phần, còn loại có nhiệt độ trở hồ cao hầu như không phản ứng với kiềm

Theo tiêu chuẩn đánh giá của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long thì độ trở hồ biến thiên từ cấp 1 đến cấp 9 như sau:

- Cấp 1 hạt gạo còn nguyên

- Cấp 2 hạt gạo phồng lên

- Cấp 3 hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên, ít nở

- Cấp 4 hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên, nở rộng

- Cấp 5 hạt gạo nứt hoặc rã, viền hoàn toàn nở rộng

- Cấp 6 hạt gạo rã hòa với viền, tâm đục -Cấp 7 hạt gạo rã hoàn toàn và hòa lẫn với viền trong suốt, tâm đục và mờ

- Cấp 8 hạt gạo tan hoàn toàn, tâm mờ, viền trong suốt, nở rộng

- Cấp 9 hạt gạo tan hoàn toàn, trong suốt, không phân biệt được viền

Bảng 1.2: Bảng phân cấp đánh giá nhiệt độ trở hồ

Cấp Phản ứng vơi alkali Nhiệt độ trở hồ

Theo IRRI (1996) thì độ trở hồ của gạo biến thiên từ cấp 1 đến cấp 7

Bảng 1.3: Bảng biến thiên độ trở hồ của gạo theo tiêu chuẩn đánh giá của IRRI

Cấp Mức độ Phản ứng của gạo

1 Cao hạt gạo còn nguyên

2 Cao hạt gạo phồng lên

3 Cao hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên, nở ít

4 trung bình hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên, nở rộng

5 trung bình hạt gạo rã ra, viền hòa tan, nở rộng

6 thấp hạt gạo rã ra hòa chung với viền

7 thấp hạt gạo tan hoàn toàn và quyện vào nhau

Các kết quả nghiên cứu về di truyền của GT cho thấy rằng GT được điều khiển bởi một gen (IRRI, 1976; Choi và ctv, 1980; Mckenjie và Rutger, 1983) GT do một gen chính và vài gen sửa đổi (modifiers) điều khiển (Kahlon, 1964; Heu và Choe, 1973; Hue

và Park, 1979; Mckenjie và Rutger, 1983) Stansel (1965), Choi và ctv (1980), Chen và ctv (1992) đã kết luận có hai gen điều khiển tính trạng này Tuy nhiên, vai trò đa gen cũng được đề cặp đến (Heda và Reddy, 1986) GT cao trội không hoàn toàn so với GT thấp (Ghosh và Govindaswamy, 1972; IRRI, 1976) GT cao trội hoàn toàn so với GT thấp (Heu và Choe, 1973; Heu và Park, 1979; Choi và ctv, 1980; Chen và ctv, 1992) GT cao lặn so vời GT thấp (Choi và ctv, 1980) GT do một dãy alen cùng một locus, cộng với vài gen sửa đổi, alen trội Alk quyết định tạo thành GT cao, alen alka lặn so với Alk quyết định hình thành kiểu GT trung bình, alen alkb lặn so với Alk và alkb tạo kiểu GT thấp (Lê Cẩm Loan và Gurdev S Khush, 1993) Sự khác biệt giữa hai giống có GT trung bình và cao do sự điều khiển của một gen chủ lực, cộng với một vài gen phụ có tính chất biến đổi (modifiers) (Kahlon, 1965) Khi lai giữa hai giống GT cao x GT trung bình, con lai chỉ có hai dạng hình giống như bố mẹ, nhưng khi lai GT cao x GT thấp, con lai phân ly cả 3 dạng hình, nhưng dạng GT trung bình rất ít, thậm chí không có trong các dòng lai đã ổn định (Stansel, 1966) Tính trội của GT cao rất phổ biến ở quần thể F2 (Somrith, 1974) Người ta cũng tìm thấy ảnh hưởng gen cộng tính trong hai cặp lai với mức độ tương tác gây phức tạp thêm trong phân tích (Somrith, 1974) Tính trạng GT cao, trung bình, thấp được điều khiển bởi đa alen tại một locus, với các gen phụ (modifiers) GT còn là tính trạng rất dễ thay đổi bởi môi trường, đặc biệt là sự thay đổi nhiệt độ khi lúa trổ đến vào chắc hạt (Heu và ctv, 1976) Gen trội alk điều khiển tính trạng GT cao, thể hiện tính trội hơn alka (điều khiển GT trung bình), cũng như gen alkb (điều khiển GT thấp), alka có tính trội hơn alkb (Lê Cẩm Loan và ctv, 1993) Không có ảnh hưởng tích lũy về lượng như amylose, do đó việc chọn lọc GT thấp hoặc trung bình nên tiến hành ở các thế hệ phân ly đầu tiên, trong cặp lai giữa bố mẹ có GT thấp (hoặc trung bình) Chọn lọc con lai

có GT trung bình, từ cặp lai giữa GT cao x GT thấp sẽ rất khó đạt kết quả tốt (Lê Cẩm Loan, 1994)

Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2000) cho rằng hệ số di truyền của GT được kiểm soát bởi hai gen qASS-6 và gen alk, cả hai đều nằm trên NST số 6, và GT bị ảnh

hưởng rất lớn của tương tác kiểu gen và môi trường Pooni và ctv (1992) đã đề nghị một

mô hình phân tích trực tiếp hạt và tính chất của phôi nhũ Mo (1995) đã thiết kế phân tích thống kê nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen đối với phôi nhũ và độ trở hồ

Hệ số di truyền thấp trên tính trạng độ bền gel, độ trở hồ, tỷ lệ xay chà biểu hiện sự đóng góp quan trọng của tương tác kiểu gen x mùa vụ và kiểu gen x môi trường Điều này cho thấy môi trường rất quan trọng khi chọn giống (Nguyễn Thị Lang và ctv, 2003) He

và ctv (1999) thiết lập quần thể tế bào double haploid để nghiên cứu hệ di truyền của GT

và tìm thấy ở GT cả gen chính và gen phụ đều nằm trên NST số 6, chỉ thị (marker) CT201-RZ450 trên gen qASS-6 và gen alk marker CT506-C235

Các kết quả trên cho thấy không có sự ổn định về số gen điều khiển tính trạng GT này cũng như mối quan hệ giữa tính trội và tính lặn.[4]

1.5 Chỉ thị phân tử

DNA marker là những chỉ thị phân tử được tạo ra nhờ kỹ thuật phân cắt DNA bằng những “restriction endonuclease” (enzyme phân cắt hạn chế) Khi sáng tạo ra những đoạn DNA mới, người ta đã cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa chỉ thị và gen định vị trên nhiễm sắc thể nào đó Bản đồ di truyền đơn giản của ruồi giấm đã được phát hiện rất sớm vào năm 1925 Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết gen, trên cùng một nhiễm sắc thể Những tính trạng này được xác định trên nhiễm sắc thể tuỳ thuộc vào mức độ liên kết của nó Sự sắp xếp một cách độc lập các nhiễm sắc thể giúp cho việc định vị của loci trong các nhóm liên kết gen Sự xuất hiện của hiện tượng quấn chéo (crossing cover) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác định thứ tự của các loci trong nhiễm sắc thể Khoảng cách di truyền trên bản đồ được đo bằng tần số tái tổ hợp gen (recombinations) Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ được kiên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được – gen đó có thể xem như là marker gen

Việc lập bản đồ gen và chọn lọc nhờ marker hình thái sẽ rất chậm, số lượng quá ít

và chỉ ở qui mô hình thái Còn việc áp dụng isozyme marker có chiều hướng tốt hơn nhưng số marker cũng quá ít, không thỏa mãn nhu cầu nghiên cứu DNA marker đã được chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần

“isozyme marker” (Tanksley và ctv, 1990) Việc áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và tương lai sẽ rẽ tiền hơn nhờ sự cải tiến không ngừng của các nhà khoa học

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như là một DNA marker

Các loại DNA markers thông thường

- RFLP : Restriction fragment length polymorphism

- ALP : Amplicon length polymorphism

- AFLP : Amplified fragment length polymorphism

- RAPD: Random amplified polymorphic DNA

- DAF: DNA amplification fingerprinting

- SSR: Simple sequence repeat (microsatellite)

- AP-PCR : Arbitrary primer – PCR

- SSCP : Single strand conformation polymorpnism

- MRDHV- DNA : Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA

( minisatellite)

- SNP : Single nucleotide polymorphism

Các DNA markers có thể được chia thành hai nhóm như sau:

- PCR – based: ALP, AFLP, SSR, SSCP

- DNA/ DNA hybridization – based: RFLP, minisatellite

Những lợi ích của DNA marker so với marker hình thái và isozyme marker là:

- Đo trực tiếp các vật liệu di truyền

- Có nhiều marker trong quần thể

- Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển.[6]

1.6 SSR marker (Simple sequence repeat (microsatellite))

SSR marker là một PCR-based marker khám phá sự khác biệt, các "vi vệ tinh" (microsatellite) bằng cách nhân bản các chuỗi mã đơn giản lặp lại (simple sequence repeat) phân tán trong bộ gen sinh vật nhờ phản ứng PCR Các đoạn này sau đó được tách

ra trên gel polyacryramide hoặc agarose và hiển thị nhờ phản ứng nhuộm Bạc (Ag) hoặc Ethidium Bromide rồi chụp hình bằng tia UV Chiều dài các đoạn DNA trên điện di thường khoảng 100 – 200 bp Các đoạn mồi (primer) được thiết kế cho phản ứng PCR dựa trên chuỗi mã ở 2 đầu của các “vệ tinh” Thể đa hình chiều dài các chuỗi mã đơn giản lặp lại (SSLPs) được xác định dựa trên sự khác biệt về số lượng các đơn vị lặp tại locus

mà marker đó định vị và nó cung cấp một nguồn đánh đấu sự khác biệt ngay trên vật chất

di truyền.[6]

Người ta thấy cần phải cải tiến để có những đánh dấu phân tử cung cấp ở mức độ cao hơn về tính đa dạng alen và đánh dấu vi vệ tinh đáp ứng được phần nào yêu cầu này bởi vì nó cho kết quả nhanh, tin cậy hơn RAPD, thể hiện tính chất “đồng trội” (codominant), không dùng chất đồng vị phóng xạ

Ứng dụng kỹ thuật SSR có nhiều thuận lợi hơn RFLP, do đó hiện nay các nhà nghiên cứu thường dùng SSR để thiết kế bản đồ gen trong di truyền, chọn giống, đa dạng hoá các vật liệu di truyền Các bản đồ di truyền thế hệ thứ hai được xây dựng dựa vào loại marker rất phong phú và có tính đa hình cao này đã được phát triển trên rất nhiều loài Ở động vật, vi vệ tinh với các base CA /GT là những đơn vị lặp lại rất phổ biến, nhưng ở thực vật thì AT/TA phổ biến hơn sau đó là GA/CT Loại đa hình này có tính chất tái bản rất cao Những primer như vậy thực sự rất cần cho yêu cầu phát hiện nhanh và chính xác các locus đa hình

Quy trình thực hiện như sau:

- Tách chiết và tinh sạch DNA của mẫu nghiên cứu

- Thực hiện phản ứng nhân gen qua PCR với các mồi đặc trưng cho các đoạn lặp đơn giản

- Điện di trên gel agarose tính toán số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA

- Xử lý số liệu bằng các phần mềm Map Marker Program, SYTSTAT, NTSYSpc… lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loài

Sử dụng SSR marker có thể phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể, dễ thực hiện và ít tốn kém [7]

Phản ứng PCR cho SSR bao gồm các thành phần sau:

- Một dung dịch gọi PCR buffer chứa Tris-HCl, KCl và MgCl2

SSR rất phong phú và phân bố rộng trong genome cây lúa vì thế chúng được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền giữa các giống lúa Bản đồ di truyền SSR trên genome cây lúa được thiết kế với các SSR marker được viết tắt là RM (Rice Microsatellite) ở Mỹ và OSR ở Nhật Sự phong phú về số lượng các marker SSR với các motif lặp đi lặp lại phát triễn trên các phần mã hóa và không mã hóa của bộ gen cây lúa (Wu và Tanksley, 1993; Panaud và ctv, 1995, 1996; Akagi và ctv, 1996; Chen và ctv, 1997; Temnykh và ctv,200) giúp cho việc khảo sát sự hiện diện và khác biệt các chuỗi mã đơn giản lặp đi lặp lại trên toàn bộ genome ngày nay càng hoàn hảo So sánh 323 SSR marker ( 194 marker từ kho lưu trữ genomic của cây lúa và 129 marker từ kho lưu trũ thiết lập từ protein ( isozyme marker) thể hiện tính trạng rice-expressed sequence tags – ESTs ), Cho và ctv (2000) xác định tỷ lệ đa hình tìm thấy nhờ marker từ genome cao hơn

rất nhiều các marker từ ESTs ( 83,8% so với 54,0%) Về các motif lặp lại, mức độ đa dạng di truyền cao nhất tìm thấy ở marker khuếch đại chuỗi mã GA trong khi hầu hết các marker khuếch đại chuỗi mã CCG hoặc CAG không tìm thấy sự khác biệt

SSR là marker có giá trị cao bởi vì chúng thường là di truyền codominant và dễ dàng phân tích bằng PCR Trên lúa có khoảng 5700 – 10000 SSR có trình tự nhau 2, 3 hoặc 4 đơn vị lặp lại Với số lượng lớn SSR sẽ thuận lợi cho việc ứng dụng lập bnar đồ gen Một bản đồ gen của cây lúa được Chen và ctv (1997) thiết lập trên 121 SSR marker Một bản đồ có mật độ phân tử cao cũng được công bố năm 1998 được thiết lập với 2275 marker Một bản đồ khác đã được thực hiện bằng 312 SSR marker vào năm 2000 Ngoài

ra McCouch và ctv năm 2002 cũng đã phát triển và thiết lập bản đồ trên cây lúa với 2240 SSR marker mới

Nguyễn Thị Lang (2001) đã thiết lập bản đồ di truyền cho gen kháng mặn trên cây lúa bằng SSR marker trên các quần thể con lai BC2F2 của nhiều tổ hợp lại khác nhau

Các tổ hợp lai giữa cây lúa trồng và cây lúa hoang đã được phần nhóm di truyền thông qua STS marker trên gen kháng rầu nâu Bph – 10 và SSR marker để phát hiện gen mục tiêu du nhập từ lúa hoang vào lúa thường các tính trạng chống chịu độ độc nhôm, chống chịu sâu bệnh, năng suất cao…(Lang và Bửu, 2002) [6]

1.7 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

1.7.1 Giới thiệu về PCR [3]

Phản ứng chuỗi của polymerase thường được viết tắc là PCR (polymerase chain reaction) Đây là một kỹ thuật tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tủ bao gồm RNA, protein, plysaccharride, ADN không có chức năng di truyền

Người ta gọi đó là kỹ thuật tạo dòng ADN invitro Ngày nay, PCR được dùng phổ biến

trong nhiều lĩnh vực thuộc sinh học

PCR là kỹ thuật xử lý invitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát triển primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do

sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu của các dây đơn DNA này, kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase

Hình 1.11: Phản ứng PCR

Sự khuếch đại này được tính như sau:

Tổng số DNA được khuếch đại = m x 2n

Trong đó n là số chu kỳ và m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra Giả sử chúng ta được hiệu quả khuếch đại là 100 %, chúng ta sẽ có:

Số chu kỳ Tổng số khuếch đại

- Biến thành dây đơn (denature)

- Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây nền (template), được gọi là tiến trình “annealing” để có phân tử DNA mới

- Kéo dài dây mới nhờ Taq polymerase (extension)

- Lặp lại qui trình

Hình 1.12 Quá trình phản ứng PCR

Ba giai đoạn này lập lại nhiều lần, để tạo mức độ cao trong sự khuếch đại Ba giai đoạn xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thí dụ 940C, 550C, 720C), nên máy nhân gen (thermalcycler) phải có tính chất tự động hoá một cách chính xác, với sự trợ giúp của Taq Enzyme này được chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt độ cao sống ở suối nước nóng

(750C) là Thermophilus aquaticus, có hoạt tính tối ưu ở 720C, song nó có thể bền vững tới

940C [2]

Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng

để khuếch đại (amplified) một đoạn chuyên tính nào đó của DNA Thể tăng hoạt có tính

“chọn lọc” này được hoàn thiện thông qua sự hợp lại của hai oligonucleotide (F và R)

trong phản ứng Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác động làm cho DNA bị

biến chất (mở dây đôi thành dây đơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và

cho nó hoạt động như những primer trong sinh tổng hợp DNA Để có tác động một cách

đặc biệt tại vị trí mình mong muốn, những primer này phải được tổng hợp để cung cấp

khoảng 20-24 bp chuỗi xoắn (duplex) tại mỗi đoạn cuối của segment

Primer ở bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, ký

hiệu là F Primer bên phải tác động dây 5’-3’ còn được gọi là reverse primer, ký hiệu là R

Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự

đã nói trên Có thể tóm tắt các bước của chu kì phản ứng chuỗi PCR theo sơ đồ sau:

Tóm lại, khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một

khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo

phản ứng dây chuyền với polymerase Độ dài của DNA được tăng hoạt tuỳ thuộc vào số

đoạn và chiều dài của primer trong phản ứng, điều kiện chất đệm, nhiệt độ annealing

1.7.4 Các yếu tố của phản ứng PCR:

- DNA mục tiêu: là những đoạn ADN mang mật mã đã được biết trước Trong kỹ

thuật PCR, người ta sẽ nhận được kết quả tốt, nếu ADN thật sự tinh khiết

- Primer và dNTP: chiều dài của primer và thành phần của dNTP ảnh hưởng quan

trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động dây đơn

- Chất đệm: thành phần chất đệm gồm có Tris, KCl, MgCl2 Nồng độ Mg 2+ tối

hảo là 1,5 – 2,5 mM Vì dNTP có thể gắn với Mg 2+ , cho nên nồng độ chính xác của Mg2+

phụ thuộc và nồng độ dNTP

- DNA polymerase được dùng phổ biến là Taq polymerase trích ly từ Thermus

aquaticus, có tính ổn định nhiệt rất cao

- Các thành phần khác như chất tẩy không có tính ion, gelatin, NP40 và Tween 20 được thêm và với số lượng nhỏ nhằm thúc đẩy hoạt động của Taq polymerase.[8]

1.7.4 Quy trình khuếch đại

Chu kỳ 25-35 trong điều kiện:

+ Denature 94-960C 15 giây (hoặc lâu hơn tùy theo vật liệu)

+ Annealing 550C 1 phút

+ Extension 720C 2 phút

Hình 1.13 Qui trình khuyếch đại trong phản ứng PCR

Bảng 2.4 Thiết lập chương trình chạy PCR trực tiếp trên máy cho SSR

Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian

(phút)

đó có các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng - band) khác nhau tương ứng với độ lớn của chúng Trong khi đó, các phân tử protein do tích điện bề mặt khác nhau nếu điện di trong gel không gây biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt, nhưng nếu điện di trong gel sau khi xửlý bằng SDS thì do bề mặt protein trở nên tích điện âm đồng nhất nên chúng dịch chuyển về anode với tốc độ khác nhau hầu như chỉ phụ thuộc khối lượng phân tử [9]

Hình 1.14 Quá trình điện di

Agarose là một trong các dạng của polysaccharide Theo tinh chất của nó các nhà khoa học đã khai thác đặc tính gel trong điện di để phân loại các DNA Agarose sẽ tạo thành các hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoạc đun nhiệt độ cac trong vài phút Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau [gọi là gelling] Giữa những hạt như vậy có những lỗ rất nhỏ, kích thước của những lỗ này có thể xê dịch chút ít tùy theo nồng độ của agarose gel Trong điện trường DNA duy chuyễn từ cực âm sang cựa dương, vì ADN mang điện tích âm (do tính chất của gốc phosphate)

Hình 1.15 Agarose

Khi DNA duy chuyễn qua các lổ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự dịch chuyễn của DNA DNA có phân tử càng lớn, thì lực cản càng mạnh Do đó, DNA có phân tử càng nhỏ di chuyễn càng nhanh Nhờ vậy, người ta phân loại được các đoạn DNA trên agarose gel Khi nồng độ agarose thay đổi, kích thước lổ giữa các hạt agarose cũng thay đổi Nó sẽ trở nên lớn hơn khi nồng độ agarose càng thấp Kích thước của lổ to và phân tử DNA bé, thì sự khuếch đại sẽ gặp trở ngại Người ta thấy rằng cần có sự tương xứng giữa hai yếu tố, để có kết quả mong muốn khi nghiên cứu các đoạn DNA [6]

Bảng 1.5 Quan hệ giữa nồng độ agarose và độ lớn DNA

Vị trí của DNA trong gel được được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel đươc nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium brommide (EtBr) và

có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet – UV)

Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau:

- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cát hạn chế ( ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…)

- Phân tách các sản phẩm PCR ( ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…)

- Phân tách DNA của hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern

Ưu điểm của phương pháp này là gel đươch rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu,

và bền vững vật lý hơn polyacrylamide Mẫu cũng dễ thu hồi Nhược điễm là agarose gel

có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định

Các yếu tố ảnh hưỡng đến tốc độ dịch chuyễn điện di trong agarose gel:

- Các phân tử DNA có kích thước càng lớn ( khối lượng phân tử lớn ) thì tốc độ dịch chuyễn càng chậm

- Nồng độ agarose: đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyễn ở các tốc

độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau

- Cấu hình của DNA: các DNA dạng vòng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cũng khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau Nhìn chung, DNA của cá plasmid mạch vòng dịch chuyễn nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng Hầu hất plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng ( siêu xoắn) và vòng đứt

- Thành phần base và nhiệt độ: tập tính điện di của DNA trong agarose gel không

bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối của các đoạn DNA có kích thước khác nhâu không thay đổi trong khoảng từ 40C – 300C Nói chung, agarose gel thường được chạy ở nhiệt độ phòng

Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-photphate-EDTA (TPE) nồng độ khoảng 50mM

và pH 7,5- 7,8 Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng đệm của nó lại thấp Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tốt các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt Các đoạn DNA sẽ dịch chuyễn với các tốc độ khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau về cường lưc ion của đệm Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hổ trợ cho độ dẫn (conductivity) Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyễn cần thiết của DNA trong gel Ngược lại, nếu dùng đệm nồng độ