Ứng dụng Marker phân tử trong xác định dòng bất dục đực tế bào chất (CMS) và dòng phục hồi hữu dục Rf ở ớt (Capsicum annuum L.)

Lê Th Kính CN... Ngày nay, công ngh sinh h c đóng vai trò quan tr ng trong nông nghi p nói chung và ch n t o gi ng cây tr ng nói riêng... Trên hoa cu ng th ng không có li t ng.. pubesce

KHOA CÔNG NGH SINH H C

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGÀNH: CNSH NÔNG NGHI P

GVHD: TS Lê Th Kính

CN Nguy n Duy Khánh

SVTH: Nguy n Ng c Kim MSSV: 1053010353 Niên khóa: 2010-2014

TP H Chí Minh, tháng 5 n m 2014

L I C M N

u tiên, em xin chân thành c m n t t c th y cô Khoa Công ngh sinh h c,

Tr ng i h c M TP H Chí Minh đã nhi t tình gi ng d y, trang b cho em

nh ng ki n th c c n thi t trong su t nh ng n m tháng đ i h c

Em xin g i l i c m n sâu s c đ n cô Lê Th Kính đã h ng d n, giúp đ , t o

m i đi u ki n thu n l i cho em hoàn thành đ tài này

C m n t t c các anh, ch phòng thí nghi m Marker phân t đã giúp đ em r t nhi u trong su t th i gian th c t p và làm khóa lu n, đ c bi t c m n anh Nguy n Duy Khánh đã t n tình ch d y, h ng d n đ em hoàn thành đ tài

Em xin chân thành cám n Ban giám hi u nhà tr ng và Ban giám đ c cùng toàn b anh, ch trong công ty C ph n gi ng cây tr ng Mi n Nam đã t o đi u ki n thu n l i đ em th c t p và hoàn thành khóa lu n

Trân tr ng c m n b n bè đã giúp đ , ng h , khích l tinh th n c ng nh chia

s , c ng c ki n th c cùng mình trong quá trình th c t p và th c hi n khóa lu n t t nghi p

Cu i cùng, con xin t lòng bi t n đ n ba m đã nuôi n ng, d y d , ch m sóc, khích l , t o m i đi u ki n đ con h c t p, hoàn thành th c t p và t t nghi p

TP H Chí Minh, tháng 05 n m 2014

Nguy n Ng c Kim

M C L C

DANH M C HÌNH

DANH M C B NG

1 T V N 1

2 T NG QUAN TÀI LI U 4

2.1 Gi i thi u v cây t 5

2.1.1 Tên g i 5

2.1.2 Ngu n g c 5

2.1.3 Công d ng 5

2.1.4 Phân lo i 7

2.1.5 c đi m th c v t h c c a cây t 8

2.1.6 cay c a t 10

2.2 Ph ng pháp phát hi n gen CMS và gen Rf 10

2.2.1 Gen CMS 10

2.2.2 Gen ph c h i Rf 13

2.2.3 Marker phân t 13

2.2.4 Các dòng t trong h th ng s n xu t t lai 3 dòng 15

2.3 T ng quan tình hình nghiên c u v marker phân t liên k t v i gen CMS và gen ph c h i h u d c (Rf) t 15

2.3.1 Nghiên c u v marker liên k t gen CMS 16

2.3.2 Nghiên c u v marker liên k t gen ph c h i h u d c (Rf) t 17

3 V T LI U& PH NG PHÁP 20

3.1 M u th c v t 21

3.2 Nhu m h t ph n v i acetocarmine 24

3.3 Tách chi t DNA 24

3.3.1 Ph ng pháp tách chi t DNA genome c a các gi ng t 24

3.3.1.1 Nguyên lý 24

3.3.1.2 Quy trình 25

3.4 Ki m tra tính đ c hi u c a các marker b ng ph ng pháp PCR và đi n di 27

3.4.1 Ph ng pháp PCR 27

3.4.1.1 Nguyên t c 27

3.4.1.2 Thành ph n ph n ng 29

3.4.2 Ph ng pháp đi n di 30

3.4.2.1 Nguyên lý 30

3.4.2.2 Quy trình đi n di gel agarose 30

4 K T QU & TH O LU N 31

4.1 K t qu soi ph n hoa 32

4.1.1 Ph n hoa c a 8 c p A/B và 7 dòng R 32

4.1.1 Ph n hoa c a 49 m u thu th p 33

4.2 K t qu kh o sát các b m i 34

4.2.1 K t qu tách chi t DNA 34

4.2.2 Ch y th nghi m marker CMS trên dòng CMS và duy trì 35

4.2.3 K t qu kh o sát gradient nhi t đ trên các dòng CMS và duy trì 37 4.2.4 K t qu phân tích marker Orf456 trên 8 c p dòng CMS và dòng duy trì 38

4.2.5 Ch y ki m tra marker Rf trên dòng ph c h i và dòng duy trì 39

4.2.6 K t qu kh o sát gradient nhi t đ c a b m i CRF-SCAR trên dòng R 40

4.2.7 K t qu phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B

và 7 dòng R 41

4.2.8 Phân tích y u t b t d c và ph c h i trên 49 m u thu th p 43

5 K T LU N & NGH 47

6 TÀI LI U THAM KH O 50

DANH M C HÌNH

Hình Trang

Hình 2.1 Các lo i t tr ng ph bi n Vi t Nam 7

Hình 2.2 t à L t 7

Hình 2.3 Các lo i t ki ng 8

Hình 3.1 Phá v màng t bào 24

Hình 3.2 M u sau khi vàng cho thêm chloroform - IAA (24:1) 25

Hình 3.3 M u sau ly tâm 25

Hình 3.4 DNA t a đáy eppendorf 26

Hình 3.5 Các giai đo n c a ph n ng PCR 27

Hình 4.1 H t ph n các dòng A/B nhu m v i acetocarmine 31

Hình 4.2 K t qu soi h t ph n c a 49 dòng/gi ng t thu th p 32

Hình 4.3 K t qu tách chi t DNA 33

Hình 4.4 Ch y th nghi m marker orf456 trên dòng CMS và dòng duy trì 34

Hình 4.5 Ch y th nghi m marker atp6 trên dòng CMS và duy trì 35

Hình 4.6 Kh o sát gradient nhi t đ m i orf456 và atp6 36

Hình 4.7 K t qu phân tích marker CMS trên 8 c p dòng A/B 37

Hình 4.8 Ki m tra marker CRFSCAR trên dòng ph c h i và dòng duy trì 38

Hình 4.9 Kh o sát gradien nhi t c a b m i CRFSCAR trên dòng ph c h i và dòng duy trì 39

Hình 4.10 Phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B và 7 dòng R 40

Hình 4.11 Phân tích nhân t CMS b ng marker Orf456 trên 49 m u t thu th p 42

Hình 4.12 Phân tích nhân t ph c h i b ng marker CRFSCAR trên 49 m u t thu th p 43

DANH M C B NG

B ng 1: Danh sách tên 49 dòng/ gi ng thu th p 20

B ng 2: Thông và trình t m i s d ng trong đ tài 22

B ng 3: K t qu phân tích y u t b t d c, h u d c b ng marker, ki m tra h t ph n

trên 8 c p A/B và 7 dòng R 40

B ng 4: K t qu phân tích nhân t CMS, Rf b ng marker cùng k t qu ki m tra h t

ph n trên 49 dòng/gi ng thu th p 43

1 T V N

t là lo i cây đ c con ng i tr ng tr t và thu hái t lâu đ i V i nhi u ng i, đây là gia v không th thi u trong b a n h ng ngày, làm t ng c m giác ngon

mi ng Trong t có các h p ch t sinh h c có ho t tính t t cho s c kh e nh vitamin, capsaicin, flavonoid,…vì th t đ c coi là m t d c li u quý trong y h c H n th

n a, t còn là nguyên li u quan tr ng cung c p cho các nhà máy, công ty s n xu t các m t hàng th c ph m tiêu th và xu t kh u đem l i l i nhu n cao [36]

n c ta, t đ c tr ng kh p 3 mi n v i di n tích tr ng kho ng 26.000 ha, nhu c u h t gi ng t hàng n m kho ng 2,6 t n h t v i giá tr kho ng 2 tri u USD [7] Các gi ng t cay đ c tr ng ch y u n c ta là nh ng gi ng đ a ph ng nh

t s ng, chìa vôi, t hi m,… Ngoài ra còn m t s gi ng nh p n i t Trung Qu c,

ài Loan và Nh t B n [8]

Th tr ng h t gi ng t cay Vi t Nam h u nh do các công ty n c ngoài chi m l nh, nghiên c u v ch n t o và s n xu t h t gi ng t cay trong n c ch phát tri n trong kho ng m t th p k nay N m 2004, B Nông nghi p và Phát tri n Nông thôn công nh n gi ng t m th i và đ a vào s n xu t th 2 gi ng t lai F1 do Viên nghiên c u rau qu Vi t Nam lai t o là HB 9 và HB 14, n ng su t trung bình đ t 20-

25 t n/ha Vi n Nghiên c u Cây n qu Mi n Nam đã cho ra đ i gi ng t lai Long

nh 3 d tr ng, ít sâu b nh, phù h p v i th nh ng vùng ng b ng sông C u Long, n ng su t cao 40-50 t n/ha Tuy nhiên, các gi ng t cay k trên v n ch a th kinh doanh trên di n r ng do ch a có kh n ng c nh tranh v i các gi ng ngo i nh p

kh túi ph n [7] V m t di truy n, b t d c đ c có 2 d ng là b t d c đ c do nhân và

b t d c đ c t bào ch t, d ng b t d c đ c trong nhân ít đ c s d ng do nó ph thu c quá nhi u vào đi u ki n môi tr ng, trong b i c nh bi n đ i khí h u nh hi n

nay s d ng d ng b t d c đ c nhân đ ph c v công tác lai t o là không th a đáng

vì con lai có kh n ng t p nhi m cao do dòng m b t d c không n đ nh Vì v y, s

d ng y u t b t d c t bào ch t trong s n xu t t lai 3 dòng là gi i pháp u vi t do dòng m có tính n đ nh cao và không ph thu c vào đi u ki n môi tr ng [11]

M t h n ch trong ch n t o gi ng t cay lai F1 có y u t CMS là m t nhi u

th i gian đ t o ra các dòng A/B, R cho con lai 3 dòng, th i gian đ t o m t gi ng

t lai F1 có kh n ng kinh doanh là 6-8 n m Tuy nhiên, các gi ng t cay nh p n i

c a các công ty n c ngoài hàng n m vào Vi t Nam ngày càng nhi u, càng đa d ng thì th i gian 6-8 n m m i ra gi ng là không có kh n ng c nh tranh [7]

Ngày nay, công ngh sinh h c đóng vai trò quan tr ng trong nông nghi p nói chung và ch n t o gi ng cây tr ng nói riêng M t trong nh ng ng d ng quan tr ng

là dùng marker phân t đ xác đ nh m t tính tr ng m c tiêu c a cây tr ng v i đ chính xác cao và th i gian nhanh chóng S d ng marker phân t đ xác đ nh các

y u t liên quan đ n CMS trên t đã đ c nghiên c u nhi u n i trên th gi i [11]

T i Vi t Nam, nhóm nghiên c u thu c tr ng H Khoa h c T nhiên TP.HCM đã

ti n hành kh o sát các b m i liên k t v i tính tr ng CMS và ph c h i h u d c

gi ng t ch thiên (Capsicum frutescens), k t qu nhóm xác nh n 3 marker đ c hi u

trong vi c phát hi n nhân t CMS và ph c h i [12], tuy nhiên đây ch là đ tài s

kh i trên 1 gi ng v i 4 b m i, vì v y c n có nghiên c u sâu h n trên b m i l n

h n và qu n th t đa d ng h n bao g m c t ch thiên và ch đ a

T nh ng th c ti n nêu trên, chúng tôi đã th c hi n đ tài: “ ng d ng

marker phân t trong xác đ nh dòng b t d c đ c t bào ch t (CMS) và dòng

ph c h i h u d c Rf t (Capsicum annuum l.)” M c tiêu kh o sát đ đ c hi u

c a các marker liên k t ch t v i gen CMS và gen ph c h i h u d c (Rf) T đó,

ch n l c các dòng CMS, dòng ph c h i n đ nh ph c v công tác ch n t o s n xu t

h t t lai F1

2 T NG QUAN TÀI LI U

Christopher Columbus đã là m t trong nh ng ng i châu Âu đ u tiên th y t ( Caribe), và g i chúng là "tiêu" (pepper) vì chúng có v cay t ng t (không ph i

b ngoài gi ng nhau) t đã đ c tr ng kh p n i trên th gi i sau th i Columbus Diego Álvarez Chanca, m t th y thu c trong chuy n đi th hai c a Columbus đ n West Indies n m 1493, đã mang nh ng h t t đ u tiên v Tây Ban Nha, và đã l n

đ u vi t v các tác d ng d c lý c a chúng vào n m 1494

T Mexico, vào th i đó đang là thu c đ a c a Tây Ban Nha, c ng là m t n c

ki m soát th ng m i v i châu Á, t đã nhanh chóng đ c chuy n qua Philippines

và sau đó là Trung Qu c, Tri u Tiên, Nh t B n v i s tr giúp c a các th y th châu Âu Gia v m i này đã nhanh chóng đ c s d ng trong ch bi n th c n c a các qu c gia này [8],[38]

đ bào ch các thu c tr b nh nh các h p ch t có ho t tính sinh h c ch a trong qu

t [10]

Theo y h c c truy n, t có v cay, nóng, có tác d ng khoan trung, tán hàn,

ki n t , tiêu th c, ch th ng (gi m đau), kháng nham (ch a ung th ) Do v y t

th ng đ c dùng đ ch a đau b ng do l nh, tiêu hóa kém, đau kh p, dùng ngoài

ch a r n r t c n,

Nghiên c u c a y h c hi n đ i c ng th ng nh t v i y h c c truy n v tác

d ng ch a b nh c a t K t qu nghiên c u c a các nhà khoa h c Trung Qu c cho

th y qu t có r t nhi u ích l i cho s c kh e Capsaicin trong qu t có tác d ng kích thích não b s n xu t ra ch t endorphin, m t ch t morphin n i sinh, có đ c tính

nh nh ng thu c gi m đau, đ c bi t có ích cho nh ng b nh nhân b viêm kh p mãn tính và các b nh ung th , capsaicin gây nóng và b ng rát khi ti p xúc v i da ng i, khi d ng tinh khi t capcaicin có th gây ch t ng i khi vô ý nu t ph i, tuy nhiên

t i m t l ng nào đó nó m i gây đ c cho c th [39]

Ngoài ra, t còn giúp ng n ng a b nh tim do ch a m t s ho t ch t giúp máu

l u thông t t, tránh đ c tình tr ng đông vón ti u c u d gây tai bi n tim m ch t còn có tác d ng ng n ng a tình tr ng huy t áp t ng cao M t s nghiên c u cho

th y, nh ng lo i t v xanh, trái nh có hàm l ng capsaicin nhi u h n Ngoài ra, trong qu t còn ch a nhi u lo i vitamin nh vitamin A, C, B1, B2, … Hàm l ng Vitamin A, Vitamin C trong t g p 5-10 l n cà chua và cà r t, qu t còn ch a các

ch t khoáng nh Ca, Fe, Na, P, S…, 1 s axit amin, protein và ch t béo, acid citric, acid malic, beta caroten…[8] [37] [40] Cây t tr ng trong ch u có th làm m t lo i cây c nh vì qu t có nhi u màu s c: tr ng, đ , vàng, cam, xanh, tím…tùy theo

i C pendu

ác loài t t

hu c v loNam [38]

Xanh

bi n Vi

t à L t kipedia)

y u đ c p

m [6], [21

Hi m-ch tNgu n SRC

t thì có 5

L.; loài C pendulum

phân bi t ]

thiên C)

- t ki ng nhi u màu s c th ng dùng trang trí, không cay Th ng có r t nhi u màu, trái to, nh , tròn nh cà hay hình gi t n c

A

B

Hình 2.3 Các lo i t ki ng

A: t hình gi t n c B: t tím

(Ngu n: SRC)

2.1.5 c đi m th c v t h c c a cây t [6] [10]

- Thân: t là cây b i thân g 2 lá m m, thân th ng m c th ng, đôi khi có th

g p các d ng (gi ng) có thân bò, nhi u cành, chi u cao trung bình 0,5-1,5 m, là cây hàng n m ho c lâu n m nh ng th ng đ c gieo tr ng nh cây h ng n m

- R : t có r c c phát tri n m nh v i r t nhi u r ph Do vi c c y chuy n, r

c c chính đ t, m t h r chùm kh e phát tri n, vì th nhi u khi l m t ng t có h

r chùm

- Lá: th ng là lá đ n m c xo n trên thân chính, có nhi u d ng lá, th ng g p

nh t là d ng lá mác, tr ng ng c, mép lá ít r ng c a Lông trên lá ph thu c vào các loài khác nhau, m t s có mùi th m Lá th ng m ng có kích th c trung bình 1,5-

12 cm x 0,5-7,5 cm

- Hoa: các hoa hoàn thi n và qu th ng đ c sinh đ n đ c trên t ng nách lá,

ch có loài C chinense th ng có 2-5 hoa trên m t nách lá Hoa m c th ng đ ng

ho c buông th ng Trên hoa cu ng th ng không có li t ng Hoa đa s có màu

tr ng, m t s gi ng có màu s a, xanh lam và tía (tím) Hoa có 5-7 cánh hoa, có

cu ng dài kho ng 1,5 cm, đài ng n có d ng chuông 5-7 r ng dài kho ng 2 mm b c

l y qu Nh y đ n gi n có màu tr ng ho c tím, đ u nh y có d ng hình b u Hoa có 5-7 nh đ c v i ng ph n màu xanh da tr i ho c tía trong khi nhóm C frutescens

và C chinense có ng ph n màu tr ng xanh, còn có th phân bi t các nhóm t theo

màu đ m ch m g c c a cánh hoa Kích th c c a hoa c ng ph thu c vào các loài khác nhau, đ ng kính cánh hoa t 8-15 mm

- Qu : qu m ng có r t nhi u h t v i th t qu nh n và chia làm 2 ng n Các

gi ng khác nhau có kích th c qu , hình d ng, đ nh n, màu s c, đ cay và đ

m m c a th t qu r t khác nhau Qu ch a chín có th có màu xanh ho c tím, qu chín có màu đ , da cam, vàng, nâu, màu kem ho c h i tím

- H t: d ng th n và màu vàng r m, ch có h t c a C pubescens có màu đen

H t có chi u dài kho ng 3-5 mm M t gam h t t ng t có kho ng 160 h t, còn t cay kho ng 220 h t tr ng 1 ha t c n kho ng 400 g h t

2.1.6 cay c a t

- Qu c a h u h t các loài t có ch a capsaicin (methyl vanillyl onenamide),

m t ch t tan trong d u, chính ch t này t o v cay cho t L ng capsaicin trong t

r t đa d ng và ph thu c vào di truy n, các lo i t ch a l ng capsaicin khác nhau cho đ cay khác nhau [21]

- V cay c a t ít hay nhi u là do t l ph n tr m c a các capsaicinoid (capsaicin) trong trái t o ra Các gi ng t ng t th ng có hàm l ng capsicin r t

th p (<0.1%) V cay c a t r t quan tr ng trong ch n gi ng đ i v i m t s vùng trên th gi i và ng i ta dùng đ n v Scovill (SU: Scovill Unit) đ th hi n đ cay

c a m t gi ng t, t i đa là 1000

SU=010 là không cay SU=1130 là cay nh SU=3180 là cay v a SU>80 là r t cay [39]

2.2.1 Gen CMS

B t d c đ c là hi n t ng cây tr ng s n sinh ra các h t ph n b t d c (h t ph n không có s c s ng, không th n y m m và th tinh trên núm nh y cái), nh ng b

ph n cái (noãn) v n phát tri n bình th ng và có kh n ng th tinh nh giao ph n chéo Hi n t ng này r t có l i cho công tác lai gi ng đ i v i các cây t th ph n,

vì khi ti n hành s n xu t h t lai không c n kh đ c dòng m

D a vào đ c tính di truy n hay ngu n g c phát sinh c a các d ng b t d c

ph n, th ph n, th tinh v n bình th ng Tuy nhiên, ph ng pháp này không th làm m t ch c n ng c a m i h t ph n và đôi khi gây tác d ng b t l i cho môi

tr ng

- B t d c đ c nhân (Nuclear Male Sterility-NMS): tính tr ng b t d c đ c

ki m soát b i 1 ho c 2 c p gen nhân và không ch u s ki m soát c a gen trong t bào ch t Nhi u nghiên c u cho r ng c p gen l n trong nhân ki m soát tính tr ng b t

d c đ c nh y c m v i đi u ki n môi tr ng, bao g m b t d c đ c nh y c m v i đ dài ngày PGMS- Photoperiodic-sensitive Genic Male Sterility) và b t d c đ c nh y

c m v i nhi t đ (TGMS- Thermo-sensitive Genic Male Sterility) i v i PGMS, thông th ng cây s b t d c trong đi u ki n ngày dài (h n 14 gi chi u sáng), h u

d c khi đ dài ngày ngày ng n h n (nh h n 14 gi chi u sáng) Còn v i TGMS cây th ng b t d c khi nhi t đ cao và h u d c khi nhi t đ môi tr ng th p D ng

b t d c đ c trong nhân có th t khôi ph c kh n ng sinh s n khi đi u ki n môi

tr ng thay đ i, tuy nhiên đây c ng chính là nh c đi m c a d ng b t d c đ c này

vì chúng ph thu c quá nhi u vào đi u ki n môi tr ng gây khó kh n cho công tác

tr ng tr t, duy trì và s d ng dòng b t d c trong công tác s n xu t h t lai [11]

- B t d c đ c t bào ch t (CMS - cytoplasmic male sterility) là k t qu c a s

t ng tác gi a gen trong nhân và các thay đ i v gen ho c c u trúc c a gen t bào

ch t CMS là m t tính tr ng di truy n làm cây không s n xu t đ c h t ph n ho c làm m t ch c n ng c a h t ph n, đ c tính này có giá tr quan tr ng v m t kinh t trong s n xu t h t lai nhi u lo i cây tr ng Dòng t b t d c đ c CMS đ c phát

hi n l n đ u tiên b i Peterson (1958) [23], k t đó, dòng này là dòng duy nh t

đ c s d ng đ s n xu t h t t lai [18],[28] Gen liên k t v i tính tr ng b t d c

đ c xác đ nh thu c b gen ti th [27]

D a vào báo cáo c a Wang và c ng s (2004) v kh n ng ph c h i h u d c trên t CMS, nhóm nghiên c u [29] gi thuy t r ng có th có nhi u h n 1 y u t gây nên b t d c đ c t, h cho r ng gen atp6 và orf456 thu c gen coxII là 2 trong

nh ng y u t t o nên tính b t d c t Sau khi ti n hành thí nghi m nhóm k t lu n

gen atp6 và orf456 có th là nhân t quan tr ng trong hình thành tính tr ng b t d c

đ c t

2.2.2 Gen ph c h i Rf

Ph c h i h u d c dòng t CMS đ c ki m soát b i gen Rf n m trong nhân,

s có m t c a gen tr i này c ch bi u hi n thành ki u hình c a gen b t d c đ c Có nhi u h n 1 gen đi u khi n kh n ng ph c h i h u d c h th ng t b t d c Ngoài

ra, tính ph c h i h u d c còn đ c đi u khi n b i gen ph c h i không hoàn toàn

Pr, gen ph c h i m t ph n b át ch b i gen tr i Rf nh ng nó l i tr i so v i gen rf,

gen Pr làm th c v t s n xu t đ ng th i h t ph n bình th ng và h t ph n không phát tri n, nh h ng đ n quá trình ch n l c dòng và lai t o h t gi ng F1 [20] [31] [34]

2.2.3 Marker phân t

Trong di truy n h c, marker phân t là 1 đo n DNA liên k t v i 1 locus nh t

đ nh trong b gen Marker phân t đ c s d ng trong sinh h c phân t và công ngh sinh h c đ xác đ nh m t trình t DNA c th [35]

M t s k thu t phân t ph bi n:

 RFLP (Restriction fragment length polymorphism): c t DNA m u

b ng 1 ho c nhi u RE (Restriction Endonuclease- emzym c t gi i h n n i bào), s n

ph m phân tách b ng đi n di argarose

u đi m c a ph ng pháp này là: Có kh n ng l p l i cao, xác đ nh đ c di truy n đ ng tr i, có tính đ c hi u locus (nên trình t b o t n c a các gene trên các sinh v t có quan h g n g i có th xác đ nh đ c), không yêu c u thông tin chu i,

d ghi đi m do kích th c các b ng th ng khác nhau đáng k Tuy nhiên, có 1 s

nh c đi m đáng k nh : yêu c u s l ng và ch t l ng DNA cao, không th t

đ ng hóa nên t n công s c và chi phí, m c đ đa hình th p khó đ c k t qu

 AFLP (Amplified fragment length polymorphism): c i ti n t RFLP, ph ng pháp này d a trên c s khu ch đ i có ch n l c các đo n DNA đã b c t, dùng trong PCR M u DNA đ c phân c t b ng các RE (Restriction Endonuclease- emzym c t

gi i h n n i bào), các s n ph m c t đ c n i v i các adapter, adapter ho t đ ng nh

1 m i liên t c khu ch đ i các đo n DNA m c tiêu

u đi m: tin c y và kh n ng l p l i cao, không c n bi t tr c v thông tin genome c a đ i t ng nghiên c u, r t giàu thông tin vì có th đánh giá đ ng th i nhi u locus (đánh giá đa hình trên toàn b gene) Tuy nhiên, ph ng pháp này tr i qua nhi u b c th c hi n, đòi h i k thu t ph c t p, đ t ti n do nh n di n b ng đi n

di polyacrylamide và ph i thêm RE, adapter

 RAPD (Random amplification of polymorphic DNA):k thu t này th c ch t

là quá trình nhân b n các đo n ADN b ng k thu t PCR có s d ng các m i đ c thi t k ng u nhiên (thông th ng có chi u dài kho ng 6-10 bp), trong đó DNA

đ c khu ch đ i b i các đo n m i ng u nhiên, dùng đ nghiên c u s khác bi t di truy n c a nh ng gi ng/loài khác nhau

u đi m: phát hi n nhanh d ng di truy n, đ n gi n không đòi h i k thu t cao, r , không dùng phóng x Nh c đi m: xu t hi n các b ng tính tr ng tr i không phân

bi t đ c cá th đ ng h p t và d h p t , tính l p l i không cao do m i ng u nhiên

 SCAR (Sequence characterized amplified regions) k thu t SCAR đ c c i

ti n t k thu t RADP (Random amplification of polymorphic DNA) k thu t

SCAR đo n m i đ c s d ng dài kho ng 22-30 nu thay vì 8-10 nu nh k thu t RAPD, đo n m i dài h n và đ c thi t k đ c hi u cho DNA xác đ nh nên m i b t

c p đ c hi u ngay v trí đích, khu ch đ i đúng vùng gen quan tâm, t đó cho k t qu

n đ nh h n, d l p l i h n so v i k thu t RAPD [1] Tuy nhiên SCAR là marker

tr i ch cho k t qu có ho c không nên chúng không phân bi t đ c cây mang gen

đ ng h p hay gen d h p, do đó marker này không đ c s d ng cho nh ng loài

g n gi ng nhau M t s marker SCAR c th đã đ c áp d ng trong các nghiên c u

l p b n đ gen và h tr ch n gi ng [42]

2.2.4 Các dòng t trong h th ng s n xu t t lai 3 dòng

Liên quan đ n tính tr ng b t d c đ c có các dòng cây nh sau:

- Dòng b t d c (dòng A): ki u gen ty th có gen đ t bi n đ c tr ng cho tính

tr ng b t d c đ c, ki u gen trong nhân không có gen tr i Rf

- Dòng ph c h i (dòng R): ki u gen ty th có ho c không có gen đ t bi n đ c

tr ng cho tính tr ng b t d c đ c, ki u gen trong nhân có đ ng h p tr i Rf

- Dòng duy trì (dòng B): ki u gen ty th không có gen đ t bi n đ c tr ng cho

tính tr ng b t d c đ c, ki u gen trong nhân không có đ ng h p tr i Rf

Cây t có vai trò không nh trong đ i s ng con ng i nên nghiên c u đ lai

t o nhanh các gi ng t t dòng CMS càng tr nên c p thi t Trên th gi i đã và đang có các nhà nghiên c u s d ng các k thu t sinh h c phân t đ phát hi n gen

CMS và gen Rf nh m kh c ph c nh ng nh c đi m trong công tác ch n t o gi ng

t theo ph ng pháp truy n th ng nh ch n l c ki u hình, kh đ c th công t n

nhi u th i gian và công lao đ ng,… Tôi xin trình bày s l c m t s công trình

nghiên c u v tính tr ng b t d c đ c tiêu bi u:

2.3.1 Nghiên c u v marker liên k t gen CMS

- T nghiên c u tr c đó trên gi ng t Milyang (Capsicum annuum cv.) nhóm

nghiên c u [15] cho r ng có 2 b n sao atp6 hi n di n t h u d c trong khi có 1

b n sao atp6 và 1 gen gi c a atp6 trong dòng CMS [23] Báo cáo này c a nhóm

nh m b sung thêm đ c tính c a atp6 trong ty th t, đ c bi t là gen gi atp6 [(S)

watp6-2] trong dòng CMS t nghiên c u s t ng quan gi a gen watp6 và tính

tr ng CMS, h so sánh RNA phiên mã và RNA ch nh s a các atp6 dòng CMS

(thi u gen Rf) và dòng ph c h i (mang gen Rf) K t qu thí nghi m cho th y có s

tái t h p x y ra gen atp6 và coxII, đó có th là nguyên nhân d n đ n hình thành

dòng CMS

- D a trên các k t qu c a phân tích RFLP (restriction fragment length

polymorphism) gi a dòng t h u d c và dòng CMS, nhóm nghiên c u [17] cho

r ng vùng coxII và atp6-2 c a hai dòng này có c u trúc DNA khác nhau Nhóm tác

gi cho r ng có nhi u h n m t tác nhân gây nên tính tr ng CMS và h phát hi n có

s khác bi t trong quá trình phiên mã c a gen atp6 gi a dòng CMS và dòng h u

d c Cu i cùng, nhóm tác gi k t lu n vùng gen orf456 và atp6 có th là nguyên

nhân t o nên tính b t d c đ c t

- Marker phân t orf456 và watp6-2 đ c s d ng trong ch n l c dòng CMS

t Tuy nhiên, trong th c t , gen orf456 và watp6-2 hi n di n c dòng duy trì

(m c đ th p) gây lo ng i v đ tin c y trong vi c ch n l c nh ng cây có ch a gen

CMS Nhóm nghiên c u [30] phát tri n marker accD-U giúp xác đ nh dòng CMS

t đáng tin c y h n Qua k t qu nghiên c u nhóm ch ng minh r ng accD-U có th

xác đ nh ki u di truy n t bào ch t chính xác h n orf456 ho c watp6-2 trong đó

ki u gen CMS đ c xác đ nh rõ ràng b ng s có m t/v ng m t các b ng và accD-U

k t h p ch t ch v i các ki u gen CMS h n

2.3.2 Nghiên c u v marker liên k t gen ph c h i h u d c (Rf) t

- Nhóm tác gi [34] cho r ng có nhi u gen đi u khi n kh n ng ph c h i h u

d c dòng t b t d c đ c, nhóm đã ti n hành kh o sát đ đ c hi u c a marker liên

k t gen ph c h i h u d c Rf trên qu n th F2 c a Niujiaojiao No.21 (rf/rf)/Xiangtanwan (Rf/Rf) Hai marker RAPD (Random amplified polymorphic

DNA) là OP131400 và OW19800 đ c xác đ nh là có liên k t ch t v i locus Rf,

kho ng cách di truy n t ng ng c a 2 marker này v i locus Rf là 0,37 và 8,12cM

Hai marker giúp nh n di n 13 dòng t lai có kh n ng ph c h i khác nhau c bi t

c hai marker đ u không hi n di n t t c các dòng t ng t, chúng có th giúp ích

cho vi c chuy n các gen Rf vào các dòng t ng t

- Nhóm nghiên c u [20] đã ti n hành các thí nghi m và xác đ nh locus Pr (partical restoration) có liên quan đ n kh n ng ph c h i h u d c c a dòng CMS,

nghiên c u s d ng 87 cá th phân ly c a qu n th F2, 8 marker liên k t gen Pr

đ c dùng đ xác đ nh kh n ng ph c h i c a các cá th trong qu n th F2, k t qu cho th y marker PR-CAPS h u d ng trong vi c xác đ nh và ch n l c các dòng ph c

h i

- Nhóm nghiên c u [21] đã kh o sát đ đ c hi u c a 4 marker có liên quan v i

gen ph c h i h u d c Rf, c th h s d ng 3 marker liên k t gen ph c h i Rf

(OPP13-CAPS, AFRF8-CAPS, CRFSCAR-SCAR) và 1 marker liên k t gen ph c

h i h u d c không hoàn toàn Pr (PR-CAPS) K t qu cho r ng 4 marker này đ u có liên k t ch t v i locus gen ph c h i, nh ng marker này s giúp ích r t nhi u cho

vi c ch n l c các dòng duy trì và ph c h i khi s n xu t t lai b ng vi c s d ng y u

t CMS

- Gen ph c h i h u d c Rf đ c s d ng hi u qu trong s n xu t h t lai t,

m c dù các marker liên k t gen Rf là có s n nh ng kh n ng ng d ng c a chúng

còn h n ch vì có s không th ng nh t ki u gen và ki u hình khi xác đ nh b ng marker T nh ng nguyên do trên nhóm tác gi [32] đã phát tri n và đánh giá kh

n ng ng d ng c a các marker liên k t gen ph c h i h u d c t, h phát tri n 3

marker phân thành 3 nhóm v i kho ng cách di truy n cách locus Rf l n l t là 0,4

cM (marker CRF-SCAR); 1,4 cM (marker BAC13T7 SCAR); 14 cM (marker PEPPR1), nh v y marker CRF-SCAR đ c cho là có kh n ng ng d ng cao khi cho k t qu t ng ng gi a ki u gen v i ki u hình K t qu nghiên c u này cho

th y các marker m i phát tri n này cho phép xác đ nh dòng ph c h i chính xác v i

đ tin c y cao

- nghiên c u v nh h ng c a kh n ng duy trì và kh n ng ph c h i h u

d c dòng b t d c đ c t bào ch t trên qu n th t Capsicum annuum L ,nhóm tác gi [33] đã dùng 1 marker liên k t gen Rf (marker CRF- SCAR) đ phân tích

trên 6 dòng CMS, 5 dòng duy trì và 6 dòng ph c h i K t qu cho th y marker này

đ c hi u trong vi c xác đ nh các dòng cây mang gen ph c h i h u d c, t đó góp

ph n h tr công tác ch n t o các dòng cây đ ph c v s n xu t h t lai b ng ph ng pháp CMS

- T i Vi t Nam n m 2013, nhóm nghiên c u [12] đã ti n hành kh o sát đ đ c

hi u c a 4 b m i liên quan đ n tính tr ng b t d c đ c t bào ch t và ph c h i h u

d c qu n th t ch thiên, sau khi kh o sát b ng k thu t đi n di k t h p đ i chi u

k t qu ki m tra h t ph n các dòng b t d c (không có h t ph n b t màu đ khi nhu m v i acetocarmine), dòng duy trì và dòng ph c h i h u d c (có h t ph n b t màu đ khi nhu m v i acetocarmine) T nh ng k t qu trên nhóm k t lu n marker coxIISCAR, coxIITri-M1 và RFSCAR có th s d ng đ nh n di n các dòng cây khác nhau gi ng t ch thiên ng th i, nhóm này c ng cho r ng marker atp6

không liên h tr c ti p v i tính tr ng b t d c đ c t bào ch t t ch thiên

(Capsicum frutescens)

Nghiên c u v marker và quy trình phân tích khác nhau đã đ c báo cáo trên

th gi i, nh ng đ tìm đ c marker phù h p v i ngu n v t li u di truy n và đi u

ki n công ngh Vi t Nam c n có các thí nghi m kh o sát c th Các công trình

nghiên c u v gen CMS và gen ph c h i h u d c Rf t đã và đang đ c th c hi n

trong và ngoài n c, tuy nhiên nh ng công trình này các nhóm tác gi kh o sát trên nhi u marker v i các k t qu không gi ng nhau, vì v y, đ tài này chúng tôi

ti n hành kh o sát l i tính đ c hi u c a các b m i s d ng ph bi n các công trình đã th c hi n và các m i này đ c nh n đ nh là có liên k t ch t v i gen b t d c

đ c bào ch t (CMS), gen ph c h i h u d c (Rf) trên đ i t ng là gi ng t th ng

m i ph bi n Vi t Nam Capsicum annuum L C th , đ i v i tính tr ng b t d c

đ c t bào ch t chúng tôi kh o sát marker ORF456 và ATP6 trên b t chu n là 8

c p dòng A/B do AVRDC (Vi n nghiên c u và phát tri n rau qu Á Châu) cung

c p, trong đó: A là dòng b t d c đ c, B là dòng duy trì b t d c; đ i v i tính tr ng

ph c h i h u d c trong nhân (Rf) chúng tôi kh o sát tính đ c hi u c a các b m i

CRFSCAR, BAC13T7-SCAR, OPP13-CAPS, AFRF8, PR-CAPS, PEPPR1 trên b

t chu n là 7 dòng R c a công ty C ph n gi ng cây tr ng Mi n Nam Ngoài ra, chúng tôi s ti n hành phân tích nhân t CMS và nhân t ph c h i trên 49 dòng/gi ng t thu th p c a công ty C ph n gi ng cây tr ng Mi n Nam b ng các marker đ c hi u đã đ c công nh n sau quy trình kh o sát

3 V T LI U

&

B ng 2: Thông tin và trình t m i s d ng trong đ tài

[32]

5

OPP13-CAPS

F-TACAGCTTCAAAGTAAACACAACC R-TCCCATCTAGCCTCTGCCTTCTCAAATG

[21]

6

AFRF8-CAPS

F-GTTGATGCTCTATG-GTTGGAGAAC R-GCACTATTCCTATTG-GCTTTCTG

[21]

7

PR-CAPS

F-ATGTCACCCCCACA-CACTCCTTCACCT R-TCCCATCTAGCCTCT-GCCTTCTCAAATG

3.2 Nhu m h t ph n v i acetocarmine

Ch n 5 hoa trên m t cây, thu nh n vào sáng s m kho ng 7 gi , ch n nh ng hoa thành th c và bao hoa ch a m

Quy trình: [3], [12]

- C đ nh các hoa c a t ng cá th trong các bercher ch a dung d ch carnoy (t

l 3 Alcol: 1 Acid Acetic) trong 2 gi

- Sau đó, r a m u b ng Alcol 900 trong 10 phút

- Gi m u trong Alcol 700

- M i hoa l y 3 bao ph n, cho bao ph n lên lame ép nghi n nát bao ph n b ng kim m i mác, lo i b các v bao ph n, sau đó, nh 1 gi t acetocarmine vào và đ y lamelle l i, quan sát h t ph n d i kính hi n vi v t kính 40X

M i quan tâm hàng đ u c a các k thu t tách chi t nucleic acid là thu nh n

đ c các phân t này tr ng thái nguyên v n t i đa không b phân hu b i các tác nhân c h c (phân t b gãy do nghi n, l c m nh) hay hoá h c (phân t b thu gi i

b i các enzyme n i bào gi i phóng ra môi tr ng khi t bào b phá v ) Các DNA

c n đ c tách chi t trong đi u ki n nhi t đ th p đ c ch ho t đ ng c a các enzyme n i bào (DNase, RNase)

Quá trình tách chi t DNA tr i qua 3 giai đo n:

- Giai đo n 1: Phá v t bào b ng ph ng pháp v t lí hay hóa h c Tu t ng

lo i t bào, có c u t o thành và màng t bào khác nhau, ch n ph ng pháp áp d ng thích h p, riêng l hay ph i h p T bào th c v t th ng đ c nghi n trong nit

l ng đ phá v vách t bào ho c dùng các ch t t y đ phá màng t bào

- Giai đo n 2: Lo i b các thành ph n không mong mu n trong m u (protein, lipit, polysaccharide…) ch y u là protein Lo i b các t p ch t trong m u b ng m t