Nghiên cứu tương đồng di truyền và xác định độ thuần của một số tổ hợp tằm đang chọn tạo bằng dấu chuẩn phân tử RAPD pptx

NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐỒNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ THUẦN CỦA MỘT SỐ TỔ HỢP TẰM ĐANG CHỌN TẠO BẰNG DẤU CHUẨN PHÂN TỬ RAPD Đặng Đình Đàn, Nguyễn Thị Thanh Bình SUMMARY Study on molecular ge

NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐỒNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH

ĐỘ THUẦN CỦA MỘT SỐ TỔ HỢP TẰM ĐANG CHỌN TẠO

BẰNG DẤU CHUẨN PHÂN TỬ RAPD

Đặng Đình Đàn, Nguyễn Thị Thanh Bình

SUMMARY

Study on molecular genetic similarity of some selected Vietnamese silkworm

combinations by RAPD markers

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) method described by Williams and Welsh & McClelland in 1990 use primers annealing to homologous target sites randomly distributed in the

genome of Bombyx mori L The technology has provided a tool for genetic analyses of biological

subjects and it has been applied succefully in genetic selection as well as breeding for many agriculture subjects In this research, ten RAPD primers were surveyed to reveal molecular genetic similarity of five selected Vietnamese silkworm combinations The results obtained showed that the coefficients of genetic similarity of silkworm combinations change from 0,62 to 0,93 and the genotype homomorphism vary from 73,77% on combination C2 to 78,01% on combination A18 The method has been proved more efficient in comparison with the traditional assessment method

The possibility for applying the method in selection and breeding practice of Bombyx mori L was

diccused

Keywords: Bombyx mori L., genetic similarity, genotype homomorphism, RAPD

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong tạo giống, người ta đã tiến hành

chọn lọc với sự trợ giúp của chỉ thị phân

tử, đã có những giống vật nuôi và cây

trồng trong đó có tằm dâu được chọn tạo

bằng phương pháp này Ở Việt Nam, nuôi

tằm là một trong những nghề có từ lâu đời,

nhưng việc chọn tạo giống cho đến nay

vẫn tiến hành theo phương pháp truyền

thống nên có một số hạn chế Vì vậy,

nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật mới vào

công tác giống là vấn đề cần thiết, trong đó

có xác định độ thuần của giống và tổ hợp

lai trên cơ sở phân tích đa hình phân tử của

chúng bằng kỹ thuật RAPD Đây là một

trong những kỹ thuật đơn giản, dễ thực

hiện, giá thành thấp hơn so với những kỹ

thuật phân tử khác, được nhiều phòng thí

nghiệm trên thế giới sử dụng hiệu quả

trong hướng nghiên cứu trên

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu

Năm tổ hợp tằm lưỡng hệ L2, C2, C21B, A18, A27 đang chọn tạo thuộc đề tài tạo giống tằm xuân thu của Trung tâm Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Tách chiết AD: Theo Wiliam và

cộng sự

2.2 Xác định nồng độ AD: Bằng

phương pháp quang phổ

2.3 Kiểm tra AD: Trên gel agaroze

0,8% và chụp ảnh ở máy geldoc

2.4 hân gen: Bằng kỹ thuật PCR,

mồi do hãng Invitrogen tổng hợp Thể tích dùng cho mẫu là 20 µl Chu trình nhiệt theo tài liệu của Chapterjee và cộng sự

Sản phNm PCR kiểm tra trên gel

agaroze 1,3% - 1,5%

2.5 Phân tích kết quả: Bằng Excel,

thống kê sinh học và phần mềm

N TSYS.2.0 Hệ số đồng dạng được tính

theo công thức của N ei và Li

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Tách chiết và tinh sạch AD, từ mẫu

tằm

ADN được tách chiết từ mẫu tằm của

các tổ hợp lai bằng kit của Fermentas, các

bước tiến hành thực hiện theo chỉ dẫn của

nhà sản xuất gồm nghiền mịn mẫu trong

dung dịch đệm tách chiết, phân huỷ protein

bằng proteaza K, loại bỏ tạp chất bằng

phenol:chloroform, tủa ADN bằng ethanol,

loại ARN bằng Rnaza, tủa tiếp bằng ethanol

để thu ADN sạch Sản phNm ADN được

chạy điện di kiểm tra, đánh giá trên gel

agaroze 0,8% và hình 1 là kết quả thu được

Kết quả hình 1 cho thấy, sản phNm nhận

được đã loại hết ARN , các vạch gọn và có trọng lượng phân tử lớn hơn 21,6 kb ADN được bảo quản lạnh trong dung dịch TE

Hình 1 Ảnh điện di AD

1 - 5: ADN của 5 mẫu

M: ADN λ/EcoRI+HindIII

Độ sạch và nồng độ ADN được giới thiệu ở bảng 1 Kết quả bảng 1 cho thấy tỉ

lệ OD260 nm/OD280 nm dao động từ 1,79 đến 1,98 chứng tỏ ADN thu được có đủ độ sạch

để làm nguyên liệu cho PCR trong các nghiên cứu tiếp theo

Bảng 1 Kết quả đánh giá độ sạch của AD tách chiết bằng kit

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1,84

1,87

1,79

1,96

1,86

1,84

1,86

1,89

1,98

1,87

1,97

1,96

1,97

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

1,82 1,81 1,92 1,98 1,89 1,85 1,90 1,82 1,81 1,92 1,91 1,89 1,98

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

1,86 1,79 1,85 1,89 1,86 1,96 1,79 1,95 1,92 1,91 1,94 1,92 1,86

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

1,86 1,93 1,92 1,87 1,86 1,85 1,79 1,83 1,79 1,85 1,90 1,81 1,89

2 Phân tích tương đồng di truyền và xác

định độ thuần của các tổ hợp tằm

Sử dụng 10 mồi RAPD đã tuyển chọn

từ đề tài độc lập khác để khuếch đại ADN của các tổ hợp tằm Hình 2, 3 là ảnh điện di

21,6 kb

1 2 3 4 5 M

sản phNm PCR của một số tổ hợp với mồi

khác nhau Phân đoạn khuếch đại được ghi

nhận là 1 và không khuếch đại là 0 Tất cả

các phân đoạn được đưa vào chương trình

N TSYST 2.0 để phân tích quan hệ di truyền

trong các tổ hợp tằm và hệ số tương đồng di

truyền của các tổ hợp tằm được trình bày

trong bảng 2, 3, 4, 5, 6 Kết quả bảng 2 cho

thấy, hệ số tương đồng di truyền của tổ hợp

tằm C21B biến động khoảng 0,623 đến

0,926 và ở khoảng 0,6 có 6 cặp chiếm 16%,

ở khoảng 0,7 có 20 cặp chiếm 44%, khoảng

0,8 có 12 cặp chiếm 27%, khoảng 0,9 có 6

cặp chiếm 13% Tổ hợp tằm C2 (bảng 3) có

hệ số tương đồng di truyền dao động từ

0,624 đến 0,892, trong đó ở khoảng 0,6 có

24 cặp chiếm 24%, khoảng 0,7 có 18 cặp

chiếm 40%, khoảng 0,8 có 16 cặp chiếm

36% Tổ hợp tằm L2 (bảng 4) có sự thay

đổi của hệ số tương đồng từ 0,644 đến

0,933, ở khoảng 0,6 có 8 cặp chiếm 18%,

khoảng 0,7 có 14 cặp chiếm 31%, khoảng

0,8 có 20 cặp chiếm 44% và khoảng 0,9 có

3 cặp chiếm 0,07% Tổ hợp tằm A18 (bảng

5) có hệ số tương đồng từ 0,684 đến 0,948,

ở khoảng 0,6 có 7 cặp chiếm 16%, khoảng

0,7 có 15 cặp chiếm 33%, khoảng 0,8 có 18

cặp chiếm 40% và 0,9 có 5 cặp chiếm 11%

Tổ hợp tằm A27 (bảng 6) chỉ số này biến thiên từ 0,674 đến 0,930, ở khoảng 0,6 có 6 cặp chiếm 13%, khoảng 0,7 có 24 cặp chiếm 53%, khoảng 0,8 có 14 cặp chiếm 31% và khoảng 0,9 chỉ duy nhất 1 cặp chiếm 2% Độ thuần của giống theo dấu chuNn phân tử được xác định bằng tỷ lệ các phân đoạn đồng hình trên tổng số các phân đoạn được nhân và kết quả được trình bày ở bảng 7 Kết quả bảng 7 cho thấy, trong các

tổ hợp đang chọn tạo thì tổ hợp tằm C2 có

độ thuần thấp nhất đạt 73,77%, sau đó là tổ hợp C21B - 74,44%, tổ hợp L2 - 75,00%, tổ hợp A27 - 77,42% và cao nhất là tổ hợp A18 đạt 78,01% Kết quả nhận được phù hợp với cách đánh giá bằng phương pháp truyền thống và công bố của một số tác giả khác Cho đến nay, cách đánh giá độ thuần

cổ truyền cần nhiều thời gian, độ chính xác hạn chế và phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của người nuôi Với sự trợ giúp của dấu chuNn phân tử có thể chủ động và đánh giá nhanh chỉ tiêu này Đây là những kết quả ban đầu của việc sử dụng dấu chuNn phân tử đánh giá độ thuần của giống, mở ra khả năng hỗ trợ hiệu quả cho công tác chọn tạo giống, góp phần cải thiện chất lượng giống tằm trong tương lai

Hình 2 Sản ph%m PCR mồi 0P019

M: marker 1 kb

1 - 10: Tổ hợp L2; 11 - 20: Tổ hợp C2

Hình 3 Sản ph%m PCR mồi HB10

M: marker 1kb

1 - 10: Tổ hợp C21B; 11 - 20: Tổ hợp A18

Bảng 2 Hệ số tương đồng tổ hợp tằm C21B

C21B.1 C21B 2 C21B.3 C21B.4 C21B.5 C21B.6 C21B.7 C21B.8 C21B.9 C21B.10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

C21B.1 1.000

C21B 2 0.926 1.000

C21B.3 0.766 0.798 1.000

C21B.4 0.689 0.818 0.623 1.000

C21B.5 0.768 0.766 0.843 0.926 1.000

C21B.6 0.652 0.778 0.767 0.744 0.768 1.000

C21B.7 0.722 0.926 0.711 0.926 0.667 0.878 1.000

C21B.8 0.812 0.829 0.700 0.656 0.678 0.786 0.822 1.000

C21B.9 0.700 0.722 0.812 0.852 0.926 0.926 0.856 0.812 1.000

C21B.10 0.756 0.744 0.756 0.733 0.767 0.821 0.865 0.724 0.711 1.000

Bảng 3 Hệ số tương đồng tổ hợp tằm C2

C2.1 C2 2 C2.3 C2.4 C2.5 C2.6 C2.7 C2.8 C2.9 C2.10 C2.1 1.000

C2 2 0.742 1.000

C2.3 0.763 0.654 1.000

C2.4 0.785 0.882 0.817 1.000

C2.5 0.796 0.828 0.642 0.654 1.000

C2.6 0.882 0.871 0.721 0.774 0.742 1.000

C2.7 0.682 0.624 0.785 0.796 0.742 0.828 1.000

C2.8 0.684 0.786 0.817 0.648 0.774 0.678 0.860 1.000

C2.9 0.817 0.682 0.652 0.882 0.785 0.882 0.871 0.658 1.000

C2.10 0.892 0.785 0.765 0.774 0.892 0.764 0.892 0.774 0.892 1.000

Bảng 4 Hệ số tương đồng tổ hợp tằm L2

L2.1 L2 2 L2.3 L2.4 L2.5 L2.6 L2.7 L2.8 L2.9 L2.10 L2.1 1.000

L2 2 0.711 1.000

L2 3 0.822 0.856 1.000

L2.4 0.844 0.878 0.822 1.000

L2.5 0,678 0.878 0.822 0.933 1.000

L2.6 0.722 0.778 0.767 0.744 0.744 1.000

L2.7 0.844 0.656 0.711 0.644 0.667 0.811 1.000

L2.8 0.878 0.644 0.700 0.878 0.678 0.822 0.922 1.000

L2.9 0.644 0.722 0.711 0.844 0.689 0.900 0.844 0.878 1.000

L2.10 0.756 0.744 0.756 0.733 0.878 0.878 0.844 0.833 0.867 1.000

Bảng 5 Hệ số tương đồng tổ hợp tằm A18

A18.1 A18.2 A18.3 A18.4 A18.5 A18.6 A18.7 A18.8 A18.9 A18.10 A18.1 1.000

A18.2 0.895 1.000

A18.3 0.843 0.948 1.000

A18.4 0.921 0.921 0.868 1.000

A18.5 0.737 0.842 0.842 0.763 1.000

A18.6 0.816 0.763 0.763 0.842 0.658 1.000

A18.7 0.764 0.763 0.816 0.737 0.658 0.895 1.000

A18.8 0.895 0.947 0.895 0.921 0.789 0.816 0.763 1.000

A18.9 0.895 0.711 0.895 0.684 0.605 0.895 0.737 0.763 1.000

A18.10 0.737 0.684 0.632 0.868 0.948 0.763 0.763 0.868 0.868 1.000

Bảng 6 Hệ số tương đồng tổ hợp tằm A27

A27.1 A27.2 A27.3 A27.4 A27.5 A27.6 A27.7 A27.8 A27.9 A27.10

A27.1 1.000

A27.2 0.744 1.000

A27.3 0.864 0.744 1.000

A27.4 0.884 0.698 0.814 1.000

A27.5 0.837 0.721 0.791 0.884 1.000

A27.6 0.698 0.768 0.698 0.744 0.767 1.000

A27.7 0.791 0.721 0.698 0.884 0.86 0.814 1.000

A27.8 0.721 0.86 0.767 0.767 0.791 0.744 0.791 1.000

A27.9 0.791 0.674 0.744 0.744 0.721 0.721 0.767 0.93 1.000

A27.10 0.721 0.744 0.674 0.721 0.837 0.837 0.837 0.862 0.837 1.000

Bảng 7 Kết quả xác định độ thuần của các tổ hợp tằm

IV KẾT LUẬN

Sử dụng 10 mồi RAPD chọn lọc để

phân tích tương quan di truyền của 5 tổ hợp

tằm đang chọn tạo, hệ số tương quan được

xác định trong khoảng 0,62 đến 0,93 và độ

thuần thay đổi từ 73,77% ở tổ hợp C2 đến

78,01% ở tổ hợp A18, kết quả phù hợp với cách đánh giá theo phương pháp truyền thống, cần nghiên cứu hoàn thiện để đưa ứng dụng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 guyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị

Hằng, ông Văn Hải, 2004 Nghiên cứu

đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng 1/2004, tr 19 - 24

2 gô Lê Thương, Trịnh Hữu Hằng,

guyễn Thị Thanh Bình, 2005 Nghiên

cứu đa hình phân tử và nhận biết một số giống tằm lưỡng hệ Việt Nam bằng kỹ thuật PCR - RAPD Hội nghị Khoa học toàn quốc những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống - 11/2005, tr.1424 - 1427

3 Trần Duy Dương, Lưu Thị gọc Huyền,

Vũ Đức Quang, Hoàng Tuyết Minh, 1999

Sử dụng phương pháp RAPD trong nghiên cứu đa hình một số dòng lúa phục vụ cho công tác giống Hội nghị Công nghệ Sinh toàn quốc NXB KH &

KT, tr.1452 - 1458

4 Chatterjee S.., Pradeep A.R, 2003

Molecular markers (RAPD) associated with growth, yield and origin of the

silkworm Bombyx mori L in Indian

Genetika, 39(12), pp.1612 - 1624

5 William J.G.K., Kubelik, K.J Livak,

J.A.F Rafalski, S.V Tingey, 1990 DNA

polymorphism amplified by arbitrary primer are useful as genetic markers Nucleic Acids Res, 8, pp.6531 - 6535

,gười phản biện: Trần Duy Quý

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

7