BÁO CÁO KHOA HỌC: "ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN MÙI THƠM TRÊN LÚA" pptx

ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN MÙI THƠM TRÊN LÚA Nguyễn thị Lang & Bùi Chí Bửu Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long I MỞ ĐẦU Mùi thơm được tách từ nhựa resine, dầu hương dầu baldams

ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN MÙI THƠM TRÊN LÚA

Nguyễn thị Lang & Bùi Chí Bửu

Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long

I MỞ ĐẦU

Mùi thơm được tách từ nhựa (resine), dầu hương dầu

(baldams) thực vật xem như thành phần của mùi thơm được đánh dấu bằng một chỉ thị là mùi Mùi thơm hay còn gọi là bột thơm khi nấu cơm mùi vị bốc hơi cho thấy một hợp

chất chính của formaldehydes, ammonia và hydrogen sulfide Một số nhà nghiên cứu cho rằng có sự gia tăng chất

propanol, pentanal, và hexanal trong thời gian dự trữ Hơn

100 thành phần chất bột như hydrocarbons, alcohols,

aldehydes, ketones, acids, esters, phenols, pyridines,

pyrazines, và thành phân khác khi nấu cơm

Chứng minh chất 2-acetyl-1-pyrroline trong giống hai

giống lúa Basmati 370 và Jamine có liên quan đến mùi

thơm Emmanual 1993 đã báo cáo thông qua đánh HPLC thông qua cách đánh gía của gạo IR 64, Azucena, và

Basmati, chứng minh pentanol, hexanol, benzaldehyde, va 2-acetyl-1 pyrroline, 2-acetyl-1 pyrroline là thành phần

chính trong mùi thơm của gạo

Nghiên cứu di truyền của mùi thơm trên lúa cho thấy rằng gen mùi thơm được kiểm chứng bởi một gen lặn ( Berner v ctv 1989) Ahn et al 1992 báo cáo rằng marker ADN liên kết với gen mùi thơm Đoạn nhiễm sắc thể từ ( Della)dùng làm donor được tách bởi kỹ thuật RFLP,thông qua phát triển dòng đẳng gen ( NILs) Dùng RFLP cho thấy sự liên kết đơn gen với RG 28 trên nhiễm sắc thể số 8 ở khoản

cách gần 4.5cM( Ahn va ctv 1992) Mới đây bản đồ fine mapping được Lang và ctv 2002 thiết kế với khoảng cách

di truyền là 1,8cM Nhờ marker phân tử liên kết rất chặt với mùi thơm và từ đó có thể phát hiện đồng hợp tử và dị hợp

tử giai đoạn thế hệ ban đầu, rút ngắn thời gian cải tiến trong chọn giống Lang và ctv 2002 Trong bài nầy áp dụng

marker để đánh giá các giống có mùi thơm nhầm phục vụ

cho mục tiêu chọn giống luùa có hương vị

II VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

II.1 Vật liệu

Sử dụng mẫu giống lúa bản địa từ Ngân Hàng gen của

VLĐBSCL và nhóm lúa cao sản được thu thập bao gồm:

217 giống lúa mùa đa dạng hóa nguồn gen và dùng 7 giống lúa có phẩm chất ngon để phát triển quần thể (bảng 1)

Bảng 1: Đặc điểm các giống được sử dụng làm vật liệu lai

II.2 Phương pháp

II.2.1 Đánh gía kiểu hình về tính trạng phẩm chất lúa

Đánh giá mùi thơm

Hạt của cây (cá thể của BC2 F3) được bóc võ trấu bằng tay Mười hạt của mỗi cá thể BC2 F3 được nghiền bằng máy Wil grinder, tốc độ trung bình Bột gạo của mỗi hạt được đặt trong một hộp plastic 5x5 cm Mỗi hộp, chúng tôi cho vào 500l alkali pha loãng (1,7%) và đậy lại Mẫu đã xử lý được đặt trong điều kiện nhiệt độ của phòng thí nghiệm trong 30 phút Các hộp được mở ra từng cái theo thứ tự, rồi đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngữi Những cá thể

dị hợp tử được ghi nhận trên cơ sở biểu hiện mùi thơm

hoặc không thơm của hạt ở BC2 F3 Chọn 10 hạt của 10 cá thể BC2 F3 individual được xem như đồng hợp đối với tính trạng thơm Sự thể hiện mùi thơm và không thơm ở BC2 F3 cho thấy tính chất dị hợp tử của cá thể nghiên cứu Do tính chất quan trọng và mức độ chính xác của đánh giá kiểu hình, đặc biệt là trong phân tích con lai trồng dồn (bulk segregants), chúng tôi phân tích thêm 30 hạt cho mỗi kiểu gen đồng hợp thơm và đồng hợp không thơm Nó phải đảm bảo độ chính xác cao trong qui trình MAS

Do yêu cầu chính xác trong đánh giá kiểu hình phục vụ trong marker phaân tõ chúng tôi thu thập mẫu lá ở giai

đoạn đẻ nhánh Mỗi cá thể, chúng tôi thu 10 lá và cắt ra thừng mẫu có chiều dài 5mm, rồi đặt chúng vào lọ thủy tinh có nấp đậy, rồi tồn trữ trong điều kiện -20oC trước khi đánh giá mùi thơm Mỗi giờ, chúng được cho điểm đối với từng mẫu lá được ướp lạnh, đặt trong ống nghiệm có nấp đậy, và trộn với 5ml dung dịch 1.7 % KOH trong 10 phút ở 50oC Bốn đến năm người cho điểm theo cảm quan bằng phương pháp ngữi mùi

II.2.2.Phát triển quần thể

Phương pháp lai : hồi giao (Backcross), từ các tổ hợp lai: IR64/ Hoa Lài, IR64/Khao Dawk Mali 105,IR64/Nàng thơm Chợ Đào, IR64/OM 1706, IR64/Jasmine 85

II.2.3.Phương pháp phân tích "PCR-based MAS"

Tách chiết ADN

Phân tử ADN phục vụ cho yêu cầu phân tích PCR được chuẩn bị theo qui trình simplified miniscale Một mẫu lá tươi, non (2 cm) được thu và đặt trong ống nghiệm ly tâm 1,5ml có đánh dấu, trong đá lạnh Lá được nghiền trong cối

và chày (Spot Test Plate -Thomas Scientific) sau khi đã thêm vào 400 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25mM EDTA, 300mM NaCl and 1% SDS) Nghiền mẫu đến khi dung dịch đệm có màu xanh lá cây Thêm 400l dung dịch đệm rồi trộn đều Chuyển 400 l lysate vào ống nghiệm có mẫu lá ban đầu Lysate sẽ kích hoạt phản ứng tách protein nhờ cho vào 400l chloroform Vật thể nổi (supernatant) được chuyển vào ống nghiệm mới (1.5 ml) và ADN được kết tụ nhờ sử dụng cồn ethanol Mẫu ADN

được làm khô nhờ gió và ngưng kết trong 50l dung dịch đệm TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0) Chúng tôi sử dụng aliquot 1l cho phân tích PCR Mẫu ADN được tồn trữ trong tủ lạnh sâu -20oC để sử dụng

primer

Trình tự của RG28 (Ricegenes) được thiết kế từ RFLP điều khiển tính trạng mùi thơm (Lang et al 2004)

35 chu kỳ 94oC trong 60 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 60 giây Qúa trình kéo dài dây sau cùng là 72oC trong

5 phút Cho thêm vào 13l dung dịch đệm (98%

formamide, 10mm EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol) sau khi PCR Đa hình trong sản phẩm PCR được phát hiện nhờ thuốc nhuộm ethidium bromide sau khi điện di trên 5% agarose gel

Cho điểm microsatellite và phân tích liên kết gen

Marker được cho điểm căn cứ sự có hoặc không có của băng theo hai băng chuẩn: con lai phân ly (segregant) có mùi thơm và không có mùi thơmtheo bố mẹ Những băng khác nhau như vậy được cho điểm 1 (aroma) hoặc 2 (non-

aroma) Liên kết giữa SSR marker và gen fgr được ước

đoán theo bản đồ liên kết gen trong phần mềm

MAPMARKER (Lander 1989)

Phân cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn tương ứng

Nếu số band hiện trên màn ảnh là đơn hình

(monomorphic) , bắt buộc chúng ta tiếp tục bước tiếp theo

là dùng enzyme để tiêu hóa Các enzyme có chiều dài từ

4-8 bp cho thấy kiểu băng đơn hình Sau khi thử nghiệm với enzyme tương ứng chúng sẽ biểu hiện đa hình

Phân tích phông sai kieu hình va he di truyeàn theo Bu va Lang 2003

III KếT QUả

III.1 Điều tra nguồn vật liệu

Điều tra nguồn vật liệu cung cấp tính trạng mục tiêu được chuẩn bị để phục vụ cho công tác lai tạo sau này

Mẫu giống có tính trạng mùi thơm cấp 2 chiếm tỉ lệ rất thấp

(8%)

III.2 Phân tích đa dạng di truyền :

áp dụng mô hình phân nhóm di truyền và phân tích

khoảng cách di truyền bằng marker phân tử, microsatelite

để phân nhóm di truyền 38 mẫu giống lúa mùa tại 31 loci khác nhau Các primer cho nhiều alen là RM180, RM183 Kết quả ghi nhận có 5 nhóm chính (cluster) và nhiều nhóm phụ (subclusters) ( bảng 2, hình 2)

Bảng 2: Kết qủa phân nhóm của 38 mẫu giống tại 31 loci

Phân nhóm di truyền

áp dụng phần mềm “PopGene” để phân tích, các nhóm di

truyền được phân chia như sau

- Nhóm 1: bao gồm hai giống ở lane số 31 (Móng chim)

và lane số 32, 34 (Đuôi trâu, Nếp Ba Tập) với khoảng cách

- Nhóm 5 có hai nhóm phụ, giống lúa thơm Tàu hương

có khoảng cách di truyền rất gần với Nếp Đài Loan

Hình 2: Phân nhóm di truyền lúa mùa tạ 31 loci khác nhau

của microsattelite 1: Nếp Tàu Hương, 2: Nàng thơm, 3: Thơm Sớm, 4: Nàng thơm, 5:Nhen, 6: Hai Bông, 7: Nếp Sáp , 8: Cà Đôn, 9: Nếp Mống Chim, 10: Ba Thiệt , 11: Nếp Cá Rô 12: Năm Lựa8, 13: Nếp Đài Loàn, 14: Nếp Than, 15: Thằng Còn , 16: Trắng bồ Câu , 17: Nhen, 18: Nếp mùa sơm, 19: Nếp huyết Hồng , 20:Nếp mỡ, 21: Nếp Lùn , 22: Trắng Tép , 23: Tép hành , 24: Trắng Phiếu , 25: Trắng Tròn , 26: Lùn Cẩn, 27: Nàng Gao, 28: Nếp Bồ Câu, 29: Nếp Phú , 30: Thần nông Lùn, 31: Mống chim Ô, 32: Đuôi châu, 33: Trời Cho, 34: Nếp Ba Tập , 35:Nếp đỏ , 36: Hoa Lai , 37: IR 64 , 38:

Khao Daw Mali 105

III.3 Lai phân tích và hình thành quần thể BC

Hình 3: Phát triển dòng lai BC tại VLĐBSCL

Giống IR 64 được Viện lúa Quốc tế phát triển năm 1985,

và được công nhận giống quốc gia tại Việt nam năm 1989,

là giống năng suất cao, hàm lượng amylose trung bình 25%), không thơm Giống Hoa lài là giống mùa địa phương phát triển ở Tỉnh Đồng Nai, hạt dài, hàm lượng amylose thấp(16,1%), có mùi thơm (cấp 1) Khaodawk Mali 105: là giống lúa mùa của Thái Lan, hàm lượng amylose 20-22%,

(23-có mùi thơm (cấp 2) Nàng thơm Chợ Đào: giống lúa thơm

cổ truyền, nguồn gốc từ làng Mỹ Lệ, Long An, có hàm

lượng amylose trung bình (24,0%), mùi thơm cấp 2 Giống

Jasmine 85 có nguồn gốc từ Mỹ, và IRRI, có hàm lượng amylose trung bình và mùi thơm (cấp 2)

Giống lúa có khả năng làm vật liệu tái tục (recurrent parent) và amylose trung bình như IR64 được sử dụng để phát triển quần thể BC2F2 của IR64/ OM1706// IR64, IR 64/ VĐ20// IR64 và IR64/ Jasmine 85 // IR64

Một số tổ hợp được quan sát trên quần thể F2 với hai thông số hệ số di truyền (Hbs) và phương sai kiểu gen (g2 ) đối với hàm lượng amylose, % protein, độ bền thể gel (GC), và mui thôm Kết quả ghi nhận ở bảng 3 cho thấy hàm lượng amylose của các tổ hợp cho thấy hệ số di truyền khá cao, chứng tỏ rằng amylose được kiểm soát chủ yếu do yếu tố di truyền bên trong Gía trị hệ di truyền thấp được ghi nhận đối với tính trạng độ bền thể gel, mui thôm Một vài tổ hợp ghi nhận hàm lượng protein có hệ số di truyền thấp Điều nầy cho thấy ảnh hưởng quan trọng của tương tác giữa kiểu gen và môi trường (GxE) trong hầu hết các tính trạng của phẩm chất hạt Qua bảng 3 cũng khẳng định

rằng nếu đánh gía quần thể trên F2 cho thấy mùi thơm

tương tác với môi trường rất cao trên cà 4 tổ hợp lai

Bảng 3: Hệ số di truyền và phương sai của vài tổ hợp, phân

tích quần thể F2

III.4 Phân tích di truyền gen điều khiển mùi thơm

Biến thiên kiểu gen

Bản đồ gen điều khiển tính trạng mùi thơm được thiết

lập trên cơ sở marker RG28 (Lang và ctv 2002) Việc thiết

kế các primer, chuyển đổi từ RFLP thành STS để đánh giá kiểu gen mùi thơm thông qua marker phân tử với chuỗi

trình tự như sau:

EcoRI cho ra hai băng đa hình Một băng kích thước 1,2kb tương ứng với IR64 và một băng có kích thước 1kb tương ứng với Khao Dawk Mali 105 ứng dụng marker này để thử trên quần thể 90 cây BC2 F3 từ tổ hợp IR64/ Khao Dawk Mali, kết quả phân tích mức độ chính xác khi so sánh giữa kiểu gen và kiểu hình thấp 60% (Bảng 4)

Bảng 4: So sánh kiểu hình và kiểu gen trên quần thể BC2 F3

của IR64 / KDM105

Do kỹ thuật STS cho đa hình thấp, chúng tôi thiết kế lai một microsatellite dựa trên cơ sở clone có sằn

Thiết kế Primer RG28 thông qua kỹ thuật SSR với chuỗi trình tự sau:

RG28.F 5'-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3' RG28.R 5'-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3'

Đánh giá mùi thơm

Dùng phương pháp KOH để đánh giá kiểu hình và dùng SSR primer để đánh gía kiểu gen Primer RG 28F-R để dùng thử trên các giống lúa: IR64, OM1490, VĐ20, Khao Dawk Mali 105, Hoa Lài Đa hình biểu hiện rất rõ giữa các giống này vói RG28

Biến thiên kiểu hình

Quần thể BC2 F3 được phát triển từ KhaodawkMali/

OM1490 Khaodawkmali 105 được xem như là giống có chất lượng cao và mùi thơm OM1490 là giống cải tiến, ngắn ngày không thơm

Khao Dawk Mali, OM1490, Jasmine (thơm), và 250 cá thể

BC2 F3 được sử dụng để đánh giá mùi thơm Phân ly 71 dòng thơm : 179 dòng không thơm ở BC2 F3 cho thấy sự biểu hiện của một gen lặn fgr đáp ứng theo định luật di truyền Mendel với tỉ lệ 1:3 Trong 250-BC2 F3 của tổ hợp lai Khao Dawk Mali x OM1490, có một sự biến thiên khá lớn về tính trạng mùi thơm Phân bố tần suất của thơm : không thơm trong quần thể BC2 F3 có tính chất liên tục Mùi thơm của Khao Dawk Mali đạt điểm 2, của OM1490 đạt điểm 0 Có khoảng 39.66% cá thể BC2 F3 có mùi thơm như Khao Dawk Mali và 61.30% không có mùi thơm như OM1490 Điều này cho thấy một sự tái tổ hợp rất tốt về

tính trạng aroma trong quần thể này

Phân tích hạt của quần thể BC2 F3 để kiểm tra độ phân ly tính trạng thơm và không thơm Kết quả cho thấy 118 cây không thơm, 33 cây thơm nhẹ, 37 cây thơm, và 12 rất

thơm Dựa vào thang điểm không thơm = 1, thơm nhẹ = 2, thơm = 3 và rất thơm = 4, cho thấy rằng tính chất thơm rất phức tạp (hình 4)

Hình 4: đánh gía kiểu hình trên quần thể BC2 F3

KhadawMali 105 và OM 1490

Đối với STS marker, đa hình giữa giống KhaoDawk Mali

và OM1490 trên RG28 biểu thị khá rõ Bản đồ gen liên kết gen của mùi thơm được thiết lập trên hai marker RG28 và

RM223 cho thấy khoảng cách di truyền với gen fgr là

1,8cM và 13,2 cM trên nhiễm sắc thể số 8, theo thứ tự

(Lang va ctv 2003) Marker RG28 cho đa hình giữa hai nhóm thơm và không thơm với độ lớn phân tử sau khi chạy điện di biến động trong quãng 90 và 190bp

Đối với KhaoDawkMali 105 (thơm) và OM1490 (không thơm), kích thước phân tử của KDM là 120bp và của

OM1490 là 60bp (Hình 5)

Hình 5: Sản phẩm PCR quần thể BC2 F3 của KhaoDawk

mali 105/ OM1490, với primer RG 28F-R

Phân tích giá trị dự đoán kết quả so sánh giữa kiểu gen

và kiểu hình để khuyến cáo MAS (marker assited selection) trong chọn giống lúa có gen thơm với RG28F-R cho kết qủa rất cao 92% (Bảng 4)

Bảng 4: Ước đoán mức độ chính xác trên quần thể BC2 F3

từ Khao DawMali 105/ OM 1490

IV Kết luận

Đối với cây lúa, sau mục tiêu năng suất, phẩm chất hạt là một yêu cầu vô cùng quan trọng, đặc biệt là mùi thơm Mùi thơm cũng đáp ứng với thị hiếu của người tiêu dùng trong một số khu vực trên thế giới Thị trường gạo thơm là thị trường gạo cao cấp với giá trị thương mãi rất cao Mùi

thơm là một tính trạng rất phức tạp trong thể hiện kiểu

hình, bởi vì nó lệ thuộc vào môi trường bên ngoài khá phức tạp Chúng ta có thể đã loại bỏ rất nhiều con lai có gen

thơm, nhưng kiểu hình không thể hiện do ảnh hưởng môi trường do vậy dùng marker phân tử khẳng định lại đánh gía các tính trạng thông qua kiểu gen và không bị ảnh hưởng tác động điều kiện môi trường Thực hiện marker RG 28F-

R cho kết qủa liên kết giữa marker và gen mục tiêu với khoảng cách di truyền khá gần là trong quần thể

KDM/OM1490, và ước đoán mức độ chính xác là 92% Với marker nầy có thể áp dụng chọn lọc và phục vụ chọn giống lúa mùi thơm

SUMMARY

APPLY MOLECULAR MARKER EVALUATED FOR AROMA GENE IN RICE

The genomic clone RG28 , which is tighly linked to frg

gene in rice, provides to perform marker aided selection in rice breeding program This study was to apply molecular

marker through using SSR markers linked to fgr gene in

rice RG28 can be converted by sequencing into SSR and used as primers for PCR amplification of genomic DNA from rice varities differing aromatic responsiveness DNA

marker-assited selection was used to detect fgr gene

through examining the power of identified SSRs in

predicting the phenotype of the fgr locus Genotypes of F2

individuals at this locus were determined by performing progeny testing for fgr in the BC2 F3 generations The

results indicated an accuracy of more than 92% in

identifying aromatic rice plants which were similar to that using RG28F-R Germplasm survey was implemented to become useful for parents selection in breeding program to aim at transferring the gene from donor to another

Từ khóa: Aroma, marker-assisted selection (MAS),

microsatellite, SSRs (simple sequence repeats)

Tài liệu tham khảo

Ahn SW, CN Bollich and SD Tanksley 1992 RFLP

tagging of a gene for aroma in rice Theor Appl Genet 87:27-32

Berner DK, BJ Hoft 1986 Inheritance of scent in America long grain rices Crop Sci 26:157-159

Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 2003 Giáo trình di

truyền số lượng Nhà xuất bản Nông Nghiệp

Nguyen thi Lang and Bui Chi Buu 2002 Identification and