Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn nấm mốc có khả năng sinh enzyme phytase

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc sinh enzyme phytase” là kết quả nghiên cứu của tác giả.. Do đó việc phân lập khu hệ vi sinh vật

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

Đà Nẵng – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc sinh enzyme phytase” là kết quả nghiên cứu của tác giả

Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực, chưa từng được công bố Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi chú nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu kết quả là sản phẩm kế thừa hoặc đã công bố của người khác

Đà Nẵng, tháng 05 năm 2017

Tác giả

TRẦN VĂN VƯƠN

LỜI CẢM ƠN

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô PGS.TS Đỗ Thu Hà người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa -Môi trường - Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong 4 năm học

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Trần Văn Vươn

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHYTATE 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PHYTASE 5

1.2.1 Khái quát về enzyme phytase 5

1.2.2 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật 7

1.2.3 Phytase có nguồn gốc từ thực vật 8

1.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PHYTASE 8

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 9

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 11

1.5 ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU 12

1.5.1 Vị trí địa lý, địa hình 12

1.5.2 Đặc điểm khí hậu 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.3 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 14

2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 14

2.3.2 Thời gian nghiên cứu 15

2.3.3 Phạm vi nghiên cứu 15

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lí mẫu đất 15

2.4.2 Phương pháp phân lập nấm mốc có khả năng sinh phytase ngoại bào 16

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái các chủng tuyển chọn 17

2.4.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme phytase từ chủng nấm mốc tuyển chọn 17

2.4.5 Phương pháp sơ bộ ứng dụng dịch nuôi cấy của các chủng nấm mốc tuyển chọn đến giai đoạn đầu của sự sinh trưởng và phát triển cây lúa (Oryza stativa L.) 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 22

3.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE 22

3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC SINH ENZYME PHYTASE MẠNH 26

3.3 ĐẶC ĐIỂM NUÔI CẤY VÀ HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC TUYỂN CHỌN 30

3.5 THĂM DÒ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NUÔI CẤY CÁC CHỦNG NẤM MỐC ĐẾN GIAI ĐOẠN ĐẦU CỦA SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LÚA (ORYZA STATIVA L.) 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

KẾT LUẬN 41

KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

H: Huyện HSCC: Hệ sợi cơ chất HSKS: Hệ sợi khí sinh KL: Khuẩn lạc MT: Môi trường PSM: Phytase screening media TP: Thành phố

TX: Thị xã

Số chủng vi sinh vật sinh trưởng trên môi trường sàng lọc được

phân lập từ đất tại các xã thuộc huyện Hòa Vang -TP Đà Nẵng và

huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

20-21

3.2 Khả năng sinh enzyme phytase của các chủng nấm mốc tuyển

3.3 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc tuyển chọn 27

3.4 Hoạt độ enzyme của chủng MN-1 và MN-2 qua các thời điểm

3.5 Chiều cao cây tại các khay gieo trồng 34-35

3.6 Chiều cao cây lúa của các công thức qua 7 ngày gieo trồng 35

DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH

Số hiệu hình

1.1 Cấu trúc hóa học của phytate 03

1.2 Sự phân giải nhóm phospho trên acid phytate nhờ

3.5 Hình ảnh phân giải acid phytate của MN-1 và MN2

trên môi trường PSM 26

3.6

Hình ảnh khuẩn lạc ccác chủng nấm mốc tuyển chọn trên môi trường PDA 26

3.7 Hình ảnh khuẩn lạc các chủng nấm mốc tuyển chọn

trên môi trường Czapeck 27

3.8 Hình ảnh cơ quan sinh sản của chủng 1 và

3.9 Hình ảnh ống giống của chủng MN-1 và MN-2 28

3.10 Đồ thị hoạt độ enzyme hai chủng MN1 và MN-2

theo thời gian nuôi cấy 28

3.11 Thu dịch lỏng nuôi cấy các chủng tuyển chọn qua

các mốc thời gian 28

3.12 Dịch chứa enzyme phytase từ các chủng nuôi cấy 28

3.13 Dịch nuôi cấy lỏng qua 120 giờ nuôi cấy 29

3.14

Hình ảnh các khay CT1, CT2, CT3, CT4 theo thứ tự lần lượt từ 1, 2, 3, 4 sau 7 ngày gieo trồng 32

3.15 Chiều cao các cây ngẫu nhiên của các khay CT1,

CT2, CT3, CT4 theo thứ tự lần lượt từ 1, 2, 3, 4 33

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Phytase là enzyme có tác dụng thủy phân acid phytate tạo thành phosphate

và myo-inositol, làm tăng sự hấp thụ phytate, tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn Phytase có tác dụng xúc tác quá trình thủy phân phytate thành các phosphate vô cơ Điều này giúp cho phytase có khả năng hoàn tan các chất khoáng cần thiết trong đất

và chống lại tính chất kháng dưỡng của phytate [18], [37] Công trình nghiên cứu của Findenegg và Nelemans năm 1993 cho thấy sự phát triển của cây bắp tỉ lệ thuận với hàm lượng acid phytate được phân giải khi bổ sung phytase vào đất [22] Bên cạnh đó, vào năm 2002 Idriss cũng đưa ra các dữ liệu để chứng minh lượng phytase

được tiết ra từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens FZB45 kích thích sự phát triển

của cây bắp con trồng trong hệ thống vô trùng chứa môi trường kiểm soát phosphate bằng cách bổ sung acid phytate [25] Những nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc chứng minh vi sinh vật sản sinh enzyme phytase trong đất có ảnh hưởng tích cực đến dinh dưỡng phospho trong cây Các nghiên cứu còn chỉ rằng, enzyme phytase còn góp phần giúp cho cây có thể hấp thụ nguồn nitơ và kali tốt hơn, và được xem như một nguồn thay thế phân bón hóa học [37]

Mặc khác, phytase làm giảm lượng phospho dư thừa thải qua phân, góp phần quan trọng vào ngành chăn nuôi sạch và bền vững [5], [11] Bên cạnh việc sử dụng như một chất phụ gia thức ăn, phytase còn có các ứng dụng trong y tế như phòng ngừa các biến chứng bệnh tiểu đường, chống viêm và chống ung thư thông qua sự hình thành các phosphate và myo-inositol Hơn nữa, phytase cũng đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy, xử lí bã thải sắn, nâng cao giá trị sử dụng, giá trị kinh tế cho bã thải sắn và hạn chế ô nhiễm môi trường do quá trình sản xuất tinh bột sắn gây ra [5], [12]

Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã được tìm thấy ở nhiều loài vi sinh vật, mô thực vật và động vật Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thường thấy nhất ở

nấm mốc đặc biệt là các chủng thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucor và

Rhizopus Phytase cũng đã được tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn như: Aerobacter aerogene, Pseudomonas sp, B subtilis, Klebsiella, E coli, Enterobacter sp và B amyloliquefaciens Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về

chi Bacillus và Enterobacter [11]

Trên thế giới, đã có các nghiên cứu về enzyme phytase từ vi sinh vật [5] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về phytase chỉ mới trong giai đoạn bắt đầu [5], [11]

Nước ta nói chung và Quảng Nam- Đà Nẵng nói riêng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm rất thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Vì vậy Việt Nam và Quảng Nam-

Đà Nẵng chắc chắn có thể tìm thấy nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh nhiều enzyme, chất kích thích sinh trưởng thực vật, chất kháng sinh quý hiếm Do đó việc phân lập khu hệ vi sinh vật đất tại Quảng Nam- Đà Nẵng sẽ có tiềm năng lớn trong tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase mạnh Đồng thời, tìm kiếm các nguồn gen quý nhằm phục vụ cho các công tác nghiên cứu tiếp theo

Xuất phát từ những lí luận khoa học và thực tiễn nêu trên, tôi tiến hành chọn

đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc sinh enzyme

phytase trong đất’’

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc sinh enzyme phytase và thăm

dò ảnh hưởng của enzyme phytase đến giai đoạn đầu gieo trồng của cây lúa Từ đó

có cơ sở khoa học cho việc bổ sung enzyme phytase vào trong đất, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC ĐỀ TÀI

- Phân lập và xác định hoạt độ được các chủng nấm mốc sinh enzyme phytase ngoại bào, làm tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng nguồn enzyme phytase trong lĩnh vực nông nghiệp tại địa phương

- Lựa chọn các chủng có hoạt độ enzyme phytase cao và bổ sung dịch nuôi cấy chứa enzyme phytase vào trong quá trình trồng cây nông nghiệp Từ đó tạo các

dữ liệu khoa học về việc ứng dụng enzyme phytase trong việc kích thích sự sinh

trưởng và phát triển của cây trồng, cũng như cải thiện việc hấp thu hàm lượng chất dinh dưỡng trong đất của thực vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHYTATE

Phytate là một dạng phospho hữu cơ, có tên là inositol hexakisphosphate (IP6) Phytate còn được gọi là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexadihydrogenphosphate

và có cấu trúc hóa học như hình 1.1:

Phytate chiếm từ 60-90% nguồn phosphate tổng của các thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật [31].Các dạng phytate khác nhau tồn tại dưới dạng đất sét hoặc kết tủa dưới dạng các muối không hòa tan của sắt và nhôm trong đất có tính axit hoặc các muối canxi không hoà tan trong đất kiềm Hơn nữa, phytate có khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại cần thiết cho độ phì của đất và tăng trưởng thực vật

Mặc khác, sự có mặt của phytate trong các thực phẩm hằng ngày gây tác động tiêu cực đến sự hấp thụ các khoáng chất như Fe2+, Ca2+, Mg2+, MN-2+ và Cu2+

[27], [33] Trong số đó, sự bất hấp thụ Zn2+ được xem là bất lợi nhất trong các khoáng chất kể trên [32], [33] Các trường hợp suy giảm Zn2+ đầu tiên được phát hiện tại Ai Cập vào năm 1963 Hầu hết khẩu phần ăn của họ là bánh mì và ngũ cốc [38] Sự hiện diện của phytate trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật là nguyên nhân chính làm giảm sự hấp thụ Zn2+, làm dẫn đến các căn bệnh về suy nhược thần kinh [36] Phytate tạo phức hợp với các kim loại trong thức ăn, khiến cơ thể không thể hấp thụ được các khoáng chất, làm giảm giá trị dinh dưỡng thức ăn Thêm vào

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phytate

đó, trong cơ thể con người không có enzyme phân hủy phức hợp phytate này Điều này khiến cho việc giải quyết vấn đề càng trở nên khó khăn [24]

Tuy nhiên, ngoài tính kháng dưỡng thì phytate vẫn có những ứng dụng quan trọng như là chất chống oxi hóa, dùng để bảo quản thực phẩm Nhiều nghiên cứu y học còn chỉ ra rằng, phytate như là một chất chống ung thư phổ rộng [43] Phytate

có thể chống lại được các bệnh ung thư như ung thư ruột già HT-29 ở người [41], các dòng tế bào máu bình thường ở người như K562 và các tế bào bạch cầu [19]

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PHYTASE

1.2.1 Khái quát về enzyme phytase

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bước acid phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các myo-inositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [44]

Khối lượng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa (trừ

phytase từ Klebsiella aerogenes là có 2 dạng phân tử cảm ứng) Phytase từ

eukaryote như nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa

và có khối lượng phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm mốc, khoảng 500 kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và động vật [44]

Phytase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật

và các loài vi sinh vật Phytase có mặt ở nhiều loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, nấm, nấm men và động vật nguyên sinh [9] Từ các nguồn thu enzyme khiến điều kiện hoạt động của phytase không giống nhau Các enzyme phytase từ thực vật thường hoạt động tốt ở nhiệt độ 45-60oC, trong khi phytase thu từ vi sinh vật hoạt động ở phạm vi nhiệt độ rộng hơn, từ 35oC đến 63oC [44]

Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemists) hiện nay phytase có một số cách phân loại như sau:

- Dựa trên vị trí cắt nhóm phosphate đầu tiên của vòng inositol thì phytase được chia ra làm 2 loại chính là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26)

- Dựa trên pH hoạt động tối ưu, phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa acid, ưa kiềm và trung tính

- Ngoài ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase được phân thành 3 loại khác nhau là: histidine acid phosphatase (HAP) phytases, ß-propeller phytase (BPP) và purple acid phosphatase (PAP) phytase [9]

Sau khi nhóm phosphate đầu tiên được thủy phân, năm nhóm còn lại trên phytate sẽ lần lượt được giải phóng bởi phytase và các acid photpho không đặc hiệu [34]

Enzyme phytase được biết đến rất sớm, tuy nhiên áp dụng quy mô sản xuất thương mại chỉ mới được tiến hành vào năm 1990 [44]

Hiện nay, phytase còn được sử dụng nhiều trong việc phục hồi đất và bán tổng hợp peroxydase [9] Các vi sinh vật sử dụng enzyme phytase để giải phóng các nguồn phospho tự do Từ đó giúp cây dễ dàng hấp thụ các nguồn phospho trong đất, cải thiện và kích thích sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây trồng Hơn nữa phytate còn tạo phức với một số kim loại trong đất, điều này giúp cho enzyme phytase khi được bổ sung vào đất, sẽ giúp đất tăng dinh dưỡng và độ phì nhiêu

Hình 1.2 Sự phân giải nhóm phospho trên phytate nhờ enzyme

phytase (Nguồn: W Schmidt – USDA/ARS) [44]

Phytase được xem như là nguồn phân bón sinh học có thể thay thế phân bón hóa học trong tương lai [18]

Ngoài ra phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau tập trung chính vào 2 lĩnh vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công nghiệp

1.2.2 Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật

Phytase được tìm thấy nhiều nhất ở nấm mốc đặc biệt ở các loài

A.ficuum, A.carbonarius, A.oryzae, A.niger và A.fumigatus thuộc chi Aspergillus

Ngoài ra phytase còn có trong các nhóm vi khuẩn thuộc về chi Bacillus và

Enterobacter [11]

Phytase được thu từ các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus được sử dụng

như một chế phẩm vi sinh trong việc cải tạo đất trồng Sự tăng trưởng đáng kể về kích thước, chiều dài rễ cũng như chiều cao cây của các cây gieo trồng khi được bổ sung chế phẩm vi sinh chứa enzyme phytase cho thấy đây là một tiềm năng ứng dụng to lớn [18]

Trong một số loài khác của chi Aspergillus như A.rugulosus cho thấy việc sử

dụng hiệu quả enzyme phytase trong việc cải thiện hàm lượng chất chất khô và sản lượng các các loại ngũ cốc Ngoài ra phytase từ các nguồn vi sinh vật đã được bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm giúp vật nuôi có thể hấp thụ được phosphoric Việc bổ sung phytase từ nấm mốc trong chế độ ăn của heo đã giúp việc hấp thụ photpho tăng từ 52% đến 64% [28] Một nghiên cứu khác lại cho thấy, phytase từ nấm mốc bổ sung vào thức ăn của gà giúp chúng hấp thụ photpho tăng từ

50 đến 60% [29]

Hiện nay công nghệ DNA tái tổ hợp phát triển càng giúp cho chất lượng enzyme phytase thu từ nguồn này cải thiện đáng kể Việc bổ sung các đoạn gen giúp cho enzyme phytase tăng khả năng chống chịu với các điều kiện từ môi trường bên ngoài và chống lại sự phân hủy enzyme tiêu hóa trong dạ dày

1.2.3 Phytase có nguồn gốc từ thực vật

Một số loại ngũ cốc có chứa enzyme phytase được kể đến như lúa mì, cám lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen Trong khi một số loại ngũ cốc khác như ngô, yến mạch lại chứa ít hoặc không chứa phytase

Hoạt tính phytase được thu từ lúa mì có thể biến đổi rất cao từ 915 đến 1581 U/kg [20] Giải thích cho việc này có thể là do sự khác nhau giữa các giống lúa mì làm cho hoạt độ của phytase có mức biến thiên lớn [16]

Nhiệt độ hoạt động của phytase thực vật từ 45oC đến 60oC [44], tuy nhiên phytase thực vật lại có thể bị mất một phần hoạt tính hoặc toàn bộ do nhiệt độ quá nóng hoặc nhiệt độ bốc hơi quá cao [40]

Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh, phytase thu từ lúa mì đã bị mất hoạt tính một cách đáng kể khi ủ với enzyme tiêu hóa pepsin Cũng chính do hoạt tính phytase biến đổi cao nên không thể xem nó là nguồn phù hợp để bổ sung vào thức

ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm [16]

1.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PHYTASE

Nấm mốc là những vi sinh vật có nhân chuẩn thuộc nhóm vi nấm, được phân bố khắp nơi như đất, nước, không khí, sản phẩm từ sinh vật, bản thân các sinh vật kể cả con người [1] Nấm mốc có nhiệt độ tối ưu khoảng 250C, nhưng cũng có thể thích nghi với 00C, sống trong môi trường có pH hơi axít đến trung tính (pH 5- 7) [2]

Khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một

hệ sợi nấm, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony) Tùy theo môi trường cơ chất mà hệ sợi nấm sẽ phát triển thành các dạng khác nhau Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm

Hầu hết các loại nấm mốc có thể đồng hóa trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường [4] Các loài nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác

nhau đối với nguồn thức ăn nitơ, chúng sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ

Nhiều loài nấm mốc (thuộc các chi Aspergillus, Penicillium) có khả năng khử nitrat hóa Một số loài như Aspergillus flavus, Trichoderma lignorum,

Myrothecium verrucaria… có khả năng đồng hóa trực tiếp nitơ phân tử [4]

Các loài A.ficuum, A.carbonarius, A.oryzae, A.niger và A.fumigatus thuộc chi Aspergillus được nghiên cứu có khả năng sản sinh enzyme phytase ngoại bào

Chúng sử dụng nguồn Glucose-phosphate là cơ chất chính trong các quá trình trao đổi chất

Nguồn enzyme phytase sinh ra từ nấm mốc A.rugulosus đã được nghiên

cứu cho thấy khả năng sinh enzyme phytase giúp cho việc cải thiện chất khô và

sản lượng ngũ cốc A.niger sản sinh enzyme phytase giúp đồng hóa nguồn

glucophosphate, cung cấp nguồn phospho vô cơ, giúp cây sinh trưởng và phát triển mạnh [18]

Trong số các nguồn thu enzyme phytase từ các loài nấm khác thuộc chi

Aspergillus như A.fumigatus cho thấy có rất nhiều đặc tính nổi trội, phổ hoạt

động rộng và có thể chịu đựng được với điều kiện pH 2,5, có khả năng hồi tính cao [18]

Tuy nhiên, A.fumigatus là nấm gây bệnh thường gặp nhất ở những đối tượng suy giảm miễn dịch A.fumigatus có bộ gen đơn bội ổn định, không có biết

rõ chu kỳ hữu tính của loài nấm này và sinh sản bằng cách hình thành bào tử dính

và giải phóng vào trong môi trường Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37°C (cùng thân nhiệt của người), bào tử là các chất ô nhiễm do hít phải gặp nhiều nhất ở người Nhưng chúng cũng bị loại trừ nhanh chóng nhờ hệ miễn dịch

ở trên những người khỏe mạnh [18]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, một số chủng nấm mốc sinh thuộc các chi Aspergillus,

Penicillium, Mucor và Rhizopus có khả năng sinh enzyme phytase mạnh đã được

nghiên cứu Đối với các chủng vi khuẩn như Bacillus sp, Escherichia coli,

Enterobacte, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter đều có khả năng

tổng hợp enzyme phytase ngoại bào

Trong những giai đoạn đầu nghiên cứu, hầu hết kết quả của các tác giả tập trung vào việc phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase

Vào năm 2000, J Kerovuo đã tiến hành nghiên cứu 21 chủng Bacillus về khả

năng sinh enzyme phytase trên môi trường LB và môi trường có bột bắp Kết quả cho thấy không có chủng nào tổng hợp phytase trên môi trường LB, tuy nhiên trong

môi trường bột bắp thì có 2 chủng B.amyloliquefaciens và B subtilis VTT E68013

sản xuất phytase số lượng lớn

Năm 2003, Yadav và Tarafdar đã sử dụng chế phẩm vi sinh được tổng hợp từ nấm cho thấy hiệu quả trong việc phân giải phytate trong đất Sự tăng trưởng đáng

kể về sinh khối, chiều dài rễ, cây của các cây khi bổ sung chế phẩm giúp mở ra hướng ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực nông nghiệp [18]

Năm 2006, Tarafdar và Gharu tiến hành bổ sung chế phẩm vi sinh phân giải phytate từ các chủng nấm mốc cho cây lúa mì Chiều dài cây và sản lượng lúa mì có

sự thay đổi đáng kể sau khi bổ sung chế phẩm [18]

Các nghiên cứu những năm tiếp theo bổ sung cho việc tìm ra thành phần dinh dưỡng phù hợp nhằm tăng hiệu quả tổng hợp enzyme phytase [23]

Năm 2007, nghiên cứu của Baharak đã chỉ ra hàm lượng cacbon và nitơ tốt nhất để sản xuất phytase tối đa là 1,5% glucose và 0,5% dịch chiết malt, pH ổn định của các enzyme từ 4-10 nhưng pH tối ưu được tìm thấy là 6 [15]

Cùng với các nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng, nuôi cấy thích hợp thì việc đánh giá các yếu tố ảnh hưởng từ môi trường bên ngoài đến hoạt động của enzyme cũng dần được quan tâm

Năm 2012, nghiên cứu của B Sasirekha đã bổ sung khoảng nhiệt độ hoạt động từ 300C đến 500C, trong đó 370C là nhiệt độ enzyme hoạt động mạnh nhất [42]

Năm 2013, Nabil et al đã tiến hành thu enzyme phytase sau 4 ngày nuôi cấy

từ 3 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase cao, lượng phytase

tổng hợp thu được đánh giá cao với 720 U/ml tại pH = 7 [35]

Vào những năm gần đây, các nghiên cứu enzyme phytase có xu hướng tinh sạch, nâng cao phẩm chất enzyme tái tổ hợp và mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng

Năm 2014, Moushree Pal Roy đã tinh sạch và đánh giá khả năng hoạt động của phytase từ 2 loài vi khuẩn được phân lập từ phân bò, kết quả đã chỉ ra enzyme thu được có thể giữ được 80% hoạt tính tại nhiệt độ lên đến 750C [30]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu bước đầu về nghiên cứu tổng hợp

enzyme phytase từ các chủng nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn thuộc chi Bacillus

Các nghiên cứu đầu tiên thường tập trung vào việc tuyển chọn những chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phytase cao

Năm 2013, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Giang đã phân lập 6 chủng

vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis có khả năng sinh phytase ngoại bào với hoạt độ

phytase mạnh nhất là 19U/ml [5]

Vào năm 2014, nghiên cứu của Mạch Trần Phương Thảo đã tiến hành khảo sát các yếu tố về nhiệt độ, độ ẩm, tỉ lệ nước và tỉ lệ bổ sung đậu nành để tăng hiệu suất quá trình thủy phân phytate [12]

Đến năm 2015, nghiên cứu của Võ Đức Tuấn đã bổ sung thêm các dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt tính phytase [14]

Năm 2015, chủng nấm mốc Aspergillus fumigatus có khả năng tổng hợp

phytase cao đã được Nguyễn Thị Hà phân lập và tiến hành nghiên cứu khảo sát môi trường thích hợp để đạt hiệu suất cao nhất [6]

Các kĩ thuật sinh học hiện đại đã được áp dụng trong các nghiên cứu ở những năm gần đây

Năm 2015, nghiên cứu của Đỗ Thị Ngọc Huyền về việc tinh sạch và xác định tính chất của phytase tái tổ hợp đã cho thấy gen mã hóa cho phytase từ vi

khuẩn Bacillus subtilis đã được biểu hiện thành công trong E.coli BL21

Hiện nay việc khai thác tiềm năng của enzyme phytase trong lĩnh vực nông nghiệp và nuôi trồng thủy hải sản là một trong những hướng mở rộng nghiên cứu enzyme phytase

1.5 ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU

1.5.1 Vị trí địa lý, địa hình [46], [47]

Vị trí địa lý:

Huyện Hòa Vang là huyện ngoại thành duy nhất nằm trên phần đất liền của TP Đà Nẵng, nằm ở tọa độ địa lý: Từ 15°56' Bắc đến 16°13' Bắc và từ 107°49' Đông đến 108°13' Đông

Huyện gồm 11 xã : Hòa Bắc, Hòa Châu, Hòa Khương, Hòa Liên, Hòa Nhơn, Hòa Ninh, Hòa Phong, Hòa Phú, Hòa Phước, Hòa Sơn và Hòa Tiến Tôi tiến hành thu mẫu tại 4 xã trong khu vực huyện Hòa Vang

Điện Bàn là thị xã ven biển phía bắc của tỉnh Quảng Nam Địa bàn xã trải dài từ 15050' đến 15057' vĩ độ Bắc và từ 1080 đến 108020’ kinh độ Đông

Địa hình, đất đai:

Huyện Hòa Vang là huyện nông nghiệp của TP Đà Nẵng, diện tích đất tự nhiên là 73.488 ha (chiếm 74,8% diện tích của TP Đà Nẵng) Trong đó đất nông nghiệp 65.316 ha, đất phi nông nghiệp 7.271 ha và đất chưa sử dụng 901,7 ha Toàn huyện có 11 xã với 119 thôn, trong đó có 3 xã đồng bằng, 4 xã trung du, 4 xã miền núi (2014) [45]

Đất đai TX.Điện Bàn khá tốt, có độ phì nhiêu cao, nhóm đất phù sa chiếm đến 69,67% tổng diện tích đất, cho phép thâm canh nông nghiệp theo chiều sâu, nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng Bên cạnh đó, Điện Bàn là một TX đồng

bằng ven biển nên địa hình tương đối bằng phẳng, độ chênh cao thấp, thuận lợi cho phát triển đô thị - công nghiệp Có bờ biển cát trắng, nước trong, sông nước hiền hòa thuận lợi cho khai thác du lịch

1.5.2 Đặc điểm khí hậu

Hoà Vang nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa điển hình, nhiệt độ cao

và ít biến động Mỗi năm có hai mùa rõ rệt: mùa mưa kéo dài từ tháng 8 đến tháng

12 và mùa khô từ tháng 01 đến tháng 07, thỉnh thoảng có những đợt rét mùa đông nhưng không đậm và không kéo dài Nhiệt độ trung bình hàng năm là 25,8oC cao nhất vào các tháng 6, 7, 8 với nhiệt độ trung bình 28-30°C; thấp nhất vào các tháng

12, 1, 2 trung bình 18-23°C Riêng vùng rừng núi Bà Nà ở độ cao gần 1.500m, nhiệt

độ trung bình khoảng 20° Độ ẩm không khí trung bình hàng năm là 82%, cao nhất vào các tháng 10, 11 trung bình khoảng 85-87%; thấp nhất vào các tháng 6, 7 trung bình khoảng 76-77% [45]

Điện Bàn nằm trong khu vực có chế độ khí hậu nhiệt đới ẩm, gió mùa tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển các cây trồng nông nghiệp như lúa màu, cây thực phẩm và cây công nghiệp ngắn ngày Tuy nhiên do chế độ mưa phân hoá theo mùa trong năm không đồng đều gây khô hạn, nhiễm mặn trong mùa khô và bão thường xảy ra vào các tháng 9, 10, 11 kết hợp với các trận mưa lớn gây lũ lụt, xói lở khu vực ven sông làm ảnh hưởng đến sản xuất và sinh hoạt đời sống của nhân dân [47]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme phytase được phân lập ở các địa điểm trồng nông nghiệp và chăn nuôi tại địa bàn tỉnh Quảng Nam và thành phố Đà Nẵng

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đề tài tập trung nghiên cứu các nội dung sau:

- Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme phytase mạnh

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và nuôi cấy của các chủng nấm mốc tuyển chọn

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme phytase của các chủng nấm mốc tuyển chọn

- Nghiên cứu sơ bộ ảnh hưởng của dịch nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển

chọn đến giai đoạn đầu của sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa (Oryza stativa L.)

2.3 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.3.1 Địa điểm nghiên cứu

* Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa:

Lấy mẫu đất trồng đậu, trồng lúa và chăn nuôi gia súc gia,cầm tại các địa điểm:

- Xã Hòa Nhơn, xã Hòa Liên, xã Hòa Thọ Đông, xã Hòa Thọ Tây thuộc Huyện Hòa Vang, Quận Cẩm Lệ, Thành phố Đà Nẵng

- Xã Điện Ngọc thuộc thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

* Địa điểm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

- Phòng thí nghiệm Vi sinh - sinh lý - hóa sinh, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng

- Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng

- Phòng thí nghiệm Vi sinh, trường Cao đẳng Lương thực thực phẩm, Đà Nẵng

2.3.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 04/2016 đến 04/2017

- Nghiên cứu phân lập, đánh giá hoạt độ enzyme và tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt độ enzyme mạnh tại PTN Vi sinh - sinh lý - hóa sinh, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng và PTN Phòng thí nghiệm Vi sinh, trường Cao đẳng Lương thực thực phẩm, Đà Nẵng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn có chứa enzyme phytase đến giai đoạn đầu của sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa

(Oryza stativa L.) tại PTN Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại

học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp l ấy mẫu và xử lí mẫu đất

Mẫu đất được lấy ở độ sâu 0-20 cm xung quanh các khu chuồng trại chăn nuôi, đất trồng đậu, trồng lúa

Dùng dao, kéo vô trùng lấy khoảng 20g mẫu cho vào túi nilon tiệt trùng, buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng lạnh 4oC nếu thời gian vận chuyển lâu [13]

Mẫu đất được làm khô tự nhiên trong không khí, tránh ánh nắng trực tiếp Đất sau khi phơi khô được nghiền nhỏ, rây qua sàng 2 mm [21]

Các mẫu đất tại các vị trí được thu mẫu lặp lại 3 lần

2.4.2 Phương pháp phân l ập nấm mốc có khả năng sinh phytase ngoại bào

- Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorow [13]

- Chọn khuẩn lạc riêng lẽ và cấy chuyền vào các ống nghiệm thạch nghiêng để bảo quản giống

- Cách tiến hành:

+ Cân 1 gam mẫu đem nghiền, cho vào bình tam giác 250ml có chứa 99ml nước cất vô trùng, lắc mẫu trên máy lắc ngang với tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 15 phút Dịch mẫu thu được có độ pha loãng 10-2

+ Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch trên cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước vô trùng, lắc đều ta được độ pha loãng 10-3 Tiếp tục pha loãng như vậy đến độ pha loãng 10-4, 10-5 Dùng pipet vô trùng hút ở mỗi độ pha loãng 0,1ml dịch mẫu và nhỏ hộp petri có chứa môi trường PSM vô trùng Sau đó dùng que trang đều giọt dịch trên mặt thạch Mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa petri, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-30oC trong 3-5 ngày để tạo thành các khuẩn lạc riêng lẽ Chọn những khuẩn lạc riêng lẽ, mọc tốt, cấy chuyền sang ống thạch nghiêng chứa cùng môi trường phân lập cho đến khi thuần chủng Bảo quản giống ở nhiệt độ 4-6oC

+ Môi trường sàng lọc chủng phytase (PSM – phytase screening media) (g/l):

x: hoạt tính phân giải phytate (%),

D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính khuẩn lạc (mm) [21]

- Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp mạnh

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái các chủng tuyển chọn

- Nuôi cấy các chủng nấm mốc trên 2 môi trường: Cazpeck, PDA

- Nuôi cấy ở nhiệt độ 35oC, thời gian nuôi cấy là từ 3-5 ngày Sau đó đem ra quan sát khả năng sinh trưởng, màu sắc khuẩn lạc, hệ sợi khí sinh, hệ sợ cơ chất, sắc

tố tan và hình dạng bào tử

- Sử dụng khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng (1978), Nguyễn Đức Lượng, Bergey (1989), Gause và cộng sự (1983), Katshuiko Ando (2002), Robert A.Samson (1984), , , [3], [8], [17], [23], [26], [39]

2.4.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme phytase từ chủng nấm mốc tuyển chọn [10]

Xác định hoạt tính phân giải phytate của enzyme phytase từ những chủng tuyển chọn bằng dung dịch màu amonium molypdate

Chuẩn bị dịch phản ứng:

- Cân 0.12 g Natri axetate đưa vào 20 ml nước cất (CM = 0.1), dùng acid axetic điều chỉnh pH về 5.5

- Cân 0.06652 g Natri phytate đưa vào 20 ml nước cất (CM = 3.6 mM), điều chỉnh pH về 5.5 bằng acid citric

- Cân 1 g trichloroaxetic acid (TCA) đưa vào 10 ml nước cất (d = 10%)

- Cân 0.2472 g amonium molypdate cho vào 20 ml nước cất (CM = 10 mM)

- Cân 0.384 g tinh thể acid citric đưa vào 10 ml nước cất (CM = 0.2 M)

- Lấy 1 ít dung dịch acid sunfuric (98%) từ lọ ra dùng dần

- Cân 0.54 g FeSO4 cho vào 20 ml nước cất (2.7%)

- Lấy 100 µl dịch nổi để im 5 phút ở nhiệt độ phòng

- Lấy 200 µl dd natri axetate 0.1 M + 200 µl natri phytate 3.6 mM, trộn đều

- Hút nhẹ bằng pipette hoặc votex

- Ủ hỗn hợp ở 370C trong 15 phút để phản ứng thủy phân xảy ra

- Sau 15 phút, dừng phản ứng bằng 500 µl trichloroaxetic acid (TCA) 10% hoặc 42 µl TCA 200% để tránh làm loãng dịch, để im trong 5 phút

- Sau 5 phút, đem dịch đi ly tâm lạnh 5000 v/p, thu dịch nổi chuyển sang ống mới, giữ im trong 10 phút

Đối với dịch đối chứng

- Hút 1000 µl nước cất đưa vào ống effendorf

Bước 3:

- Pha dung dịch màu: 4 ml amonium molypdate 10 mM + 4 ml acid sunfuric +

2 ml FeSO4, đưa vào ống fancol

- Bổ sung 500 µl hỗn hợp dung dịch màu vào các ống phản ứng và ống đối chứng

- Để im trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 4:

- Đem đi đo quang phổ ở bước sóng 700 nm

Bước 5:

- Dựa vào đường chuẩn photphate tự do xác định hoạt tính phytase

- Cứ 1 U ứng với 1 µmol photphate tự do sản sinh ra trong 1ml dịch trong thời gian 1 phút

Xây dựng đường chuẩn

Sử dụng 5 nồng độ 0µM, 100 µM, 200 µM, 300 µM,500 µM chất chuẩn

K2HPO4 lần lượt đem phản ứng với các dung dịch đã chuẩn bị ở bước trên

Đo độ hấp thụ của các dung dịch bằng phản ứng màu ở bước sóng 700 nm trên máy so màu Ema Kết quả được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Mối tương quan giữa nồng độ K 2 HPO 4 với OD

2.4.5 Phương pháp sơ bộ ứng dụng dịch nuôi cấy của các chủng nấm mốc

tuyển chọn đến giai đoạn đầu của sự sinh trưởng và phát triển cây lúa (Oryza stativa L.) [37]

 CT1: Đất trồng khử trùng + dịch nuôi cấy bổ sung chủng nấm mốc tuyển

chọn + natri phytate + lúa nẩy mầm

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn K 2 HPO 4

 CT2: Đất trồng khử trùng + phân lân + natri phytate + lúa nẩy mầm

 CT3: Đất trồng khử trùng + dịch nuôi cấy không bổ sung các chủng nấm

mốc tuyển chọn + natri phytate + lúa nẩy mầm

 CT4: Đất trồng khử trùng + natri phytate + lúa nẩy mầm

- Xử lí đất và chuẩn bị giống

Hấp khử trùng mẫu đất, trong mỗi khay tiến hành thêm 500g đất đã được chuẩn bị sẵn

Chuẩn bị giống: Tiến hành ngâm trong nước theo tỉ lệ 2 sôi: 1 lạnh đến khi

hạt thóc no nước thì vớt ra (4-6h), rửa sạch, để ráo, dùng khăn ẩm bọc lại, ủ kín, để chỗ ẩm trong vòng 48h để hạt nẩy mầm Sau đó tiến hành gieo trồng, quan sát sự phát triển chiều cao cây trong vòng 7 ngày

- Liều lượng bổ sung natri phytate tại các công thức đều là 0.5g

- Chế độ chăm sóc và điều kiện phát triển giữa các công thức là như nhau

- Sau 07 ngày, tiến hành đo chiều cao phát triển của cây và thu thập số liệu

2.4.6 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu thu thập ngoài thực địa được nhập vào phần mềm Excel 2013 Sau đó các dữ liệu excel được chuyển sang phần mềm SPSS 20 để xử lý

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE

Từ 45 mẫu đất trồng (lạc, đậu tương, trồng lúa) và đất chăn nuôi ( lợn, gà, trâu, bò) tại các xã thuộc H Hòa Vang, TP Đà Nẵng và xã Điện Ngọc, thuộc TX Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam, Tôi đã sơ tuyển được 129 chủng vi sinh vật sinh trưởng

và phát triển trên môi trường sàng lọc Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, quan sát tế bào dưới kính hiển vi, áp dụng khóa phân loại Bergey, Gause và cộng sự, Nguyễn Đức Lượng, Bùi Xuân Đồng (1984), Robert A.Samson 1984 [3], [8], [17], [23], [39] Tôi đã xác định được có 32 chủng nấm mốc và 97 chủng vi khuẩn trong tống số chủng phân lập Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Số lượng chủng vi sinh vật được phân lập từ đất tại các xã thuộc H

Hòa Vang -TP Đà Nẵng và TX Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

vi khuẩn

Số chủng nấm mốc

Tổng

số chủng VSV Loại đất

Độ

ẩm (%)

pH

Thảm thực vật

Trồng rau 11 2 13 Đất thịt

nặng 80-85 6.5

Trồng lúa 5 0 5

01/

2017

Đất thịt trung bình 60-75 6.5-7

nặng 60-75 6.5 Lúa 5 0 5 Đất thịt 70-75 7 Nuôi 7 8 15