phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ chất bã mía

Bốn dòng nấm men này được chọn để đánh giá khả năng sử dụng bã mía cho quá trình lên men cồn, thông qua một số chỉ tiêu như thể tích khí, độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, hàm lượng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỪ MEN RƯỢU ĐỂ LÊN MEN CỒN

TRÊN CƠ CHẤT BÃ MÍA

LỚP:VI SINH VẬT HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỪ MEN RƯỢU ĐỂ LÊN MEN CỒN

TRÊN CƠ CHẤT BÃ MÍA

SINH VIÊN THỰC HIỆN BÙI THỊ NGỌC HÂN MSSV:3108489

LỚP:VI SINH VẬT HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ths VÕ VĂN SONG TOÀN

PGs Ts TRẦN NHÂN DŨNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Võ Văn Song Toàn Bùi Thị Ngọc Hân Trần Nhân Dũng DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

…… ………

…… ………

…… ………

…… ………

…… ………

…… ………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự động viên khích lệ to lớn cả về vật chất lẫn tinh thần từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn, đó chính là động lực giúp tôi vượt qua khó khăn hoàn thành đề tài luận văn Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Thầy Trần Nhân Dũng, thầy Võ Văn Song Toàn, người thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng

đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn này

Tôi cũng chân thành cám ơn tất cả các thầy cô trong Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã tận tình truyền dạy những kiến thức hữu ích giúp cho việc thực hiện đề tài được thuận lợi cũng như định hướng cho nghề nghiệp của tôi trong tương lai

Cô Nguyễn Thị Pha, cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học Khóa 36 đã động viên và khích lệ tinh thần trong suốt thời gian học tập tại trường

Cám ơn các cô chú công nhân viên của Viện đã giúp đỡ trong quá trình làm việc trong và ngoài giờ để tôi hoàn thành đề tài đúng tiến độ quy định

Tôi cũng vô cùng biết ơn tất cả các thành viên trong phòng CNSH Enzyme, các anh chị K35 TT, các bạn VSV K36, CNSH K36 đã tận lực giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Thân gửi đến tập thể lớp Vi sinh vật học Khóa 36 lời cảm ơn chân thành, đã tiếp thêm động lực cho tôi hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống

Cuối lời, kính chúc mọi người luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, vui vẻ và thành đạt Xin trân trọng cám ơn!

Bùi Thị Ngọc Hân

TÓM LƯỢC

- Đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ

chất bã mía” được thực hiện nhằm mục đích tuyển chọn các dòng nấm men có khả

năng lên men cồn trên cơ chất bã mía Kết quả đã phân lập được 18 dòng nấm men từ các viên men khác nhau ở 3 tỉnh (thành phố) Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang Các dòng nấm men được khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase: có 10 dòng (H5, H6, H7, H9, H10, H12, H13, H15, H16, H18) có hoạt tính exoglucanase, hoạt tính endoglucanase chưa thể hiện ở 18 dòng nấm men được phân lập Kết quả lên men trong ống Durham của 18 dòng nấm men cho thấy bốn dòng nấm men H6, H9, H10, H13 có khả năng lên men một số loại đường D-Glucose, D-Mannose và D-Galactose lần lượt là 30 cm, 30 cm, 30 cm, 30 cm (D-Glucose), 30 cm, 25,67 cm, 17, 33 cm, 17,67 cm (D-Mannose) và 25 cm, 21,33 cm, 28,33 cm, 30 cm (D-Galactose) Bốn dòng nấm men này được chọn để đánh giá khả năng sử dụng bã mía cho quá trình lên men cồn, thông qua một số chỉ tiêu như thể tích khí, độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, hàm lượng DM và CF giảm đi Chúng tôi kết luận rằng NT14 (dòng nấm men H13 và tổ hợp vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32) có khả năng lên men trên cơ chất bã mía tốt nhất Kết quả lên men của dòng nấm men H13 qua các chỉ tiêu khí CO 2 , nồng độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, lượng DM và CF mất đi đạt các giá trị cao nhất so với các dòng còn lại còn lại, kết quả lần lượt là 44 ml, 4,33, 2,23 g/ls, 0,483 g/l, 9,62% và 27,57%

Từ khóa:, bã mía, ethanol, lên men, nấm men, vi khuẩn

MỤC LỤC

Trang PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về men rượu 3

2.2 Giới thiệu chung về nấm men 4

2.2.1 Hình dạng và kích thước của nấm men 4

2.2.2 Cấu tạo của nấm men 6

2.2.3 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 6

2.2.4 Vai trò và ứng dụng của nấm men 7

2.3 Sự lên men ethanlol 7

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men 11

2.5 Ethanol sinh học 12

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học trong nước 12

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học ngoài nước 14

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương tiện nghiên cứu 16

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 16

3.1.3 Nguyên vật liệu 16

3.1.4 Xử lý số liệu, phân tích thống kê 17

3.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 18

3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng nâm men từ men rượu 18

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men 19

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men 19

3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men một số loại đường 20

3.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với các dòng vi khuẩn 20

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Phân lập các dòng nấm men từ men rượu 23

4.2 Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men 25

4.3 Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men 26

4.4 Khảo sát khả năng lên men một số loại đường 26

4.5 Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với vi khuẩn 30

4.5.1 Thể tích cột khí 30

4.5.2 Đo pH trước và sau lên men 31

4.5.3 Định lượng đường khử 32

4.5.4 Định tính độ cồn bằng cồn kế 33

4.5.5 Chuẩn độ dung dịch sau chưng cất 34

4.5.6 Kết quả phân tích DM 35

4.5.7 Kết quả phân tích CF 36

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 3: PHỤ LỤC THỐNG KÊ

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần hóa học của nấm men 6

Bảng 2 Thành phần môi trường Potato Glucose Agar (PGA) 17

Bảng 3 Thành phần môi trường Potato Glucose (PG) 17

Bảng 4 Thành phần môi trường cải tiến nuôi vi khuẩn dạ cỏ bò 18

Bảng 5 Thành phần môi trường cải tiến nuôi sinh khối vi khuẩn dạ cỏ bò 18

Bảng 6 Bảng phân bố NT 21

Bảng 7 Đặc điểm của các dòng nấm men phân lập 24

Bảng 8 Chiều cao cột khí CO2 (mm) trong ống Durham 27

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Tế bào nấm men 4

Hình 2 Các dạng tế bào nấm men khác nhau quan sát dưới kính hiển vi điện tử 5

Hình 3 Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2 10

Hình 4 Biểu đồ đường kính vòng halo của các dòng nấm men 25

Hình 5 Biểu đồ chiều cao cột khí sau 168 giờ 31

Hình 6 Biểu đồ đường khử sau lên men 32

Hình 7 Biểu đồ độ cồn sau chưng cất 33

Hình 8 Biểu đồ lượng ethanol (g/l) 34

Hình 9 Biểu đồ lượng DM giảm sau lên men 35

Hình 10 Biểu đồ lượng CF giảm sau lên men 36

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới Mỹ và Brazil đã thành công trong việc sản xuất ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía Điều này đã khích lệ các nước khác đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học

Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam

Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nông nghiệp Trong đó, bã mía là loại phụ phẩm có chứa đáng kể hàm lượng cellulose và các loại lignocellulose khác Theo kết quả của Tổng cục thống kê, năm 2012 cả nước

có khoảng 297,9 nghìn ha trồng mía với sản lượng cả nước đạt khoảng 19040,8 nghìn tấn Vì thế lượng bã mía thải ra hàng năm rất lớn, gây nguy cơ ô nhiễm môi trường cao Để tận dụng nguồn bã mía thải ra hằng năm và góp phần giảm thiểu tác động đến môi trường cũng như giải quyết vấn đề năng lượng, sử dụng bã mía như nguồn nguyên liệu đầu vào để sản xuất ethanol là hướng đi mới đầy tiềm năng và triển vọng ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay

Việc nghiên cứu sử dụng phụ phẩm nông nghiệp giàu hợp chất carbonhydrat làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu có sử dụng sự trợ giúp của các vi sinh vật đang

là một trong những giải pháp đầy hứa hẹn cho việc thay thế cho nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt, giảm thiểu sự tác động của môi trường là một trong những hướng nghiên cứu đang dần thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước Trong lên men ethanol sinh học, giai đoan lên men là một giai đoạn quan trọng Trong đó nấm men giữ vai trò quyết định trong quá trình lên men Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi, đặc biệt hiện diện nhiều trong đất trồng hoa quả và các nhà máy chế biến đường Ngoài ra, chúng còn xuất hiện trong trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang Nấm men lên men ethanol thường được phân lập từ quá trình lên men rượu, bã quả, mật rỉ của củ cải đường hay mía đường, Trên bánh men là sản phẩm hỗn hợp phong phú của vi sinh vật, trong đó có nấm men Các loài

nấm men thường gặp là Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Pichia anomada,… và một số nấm men dại khác Đây là nguồn phân lập nấm men cho quá

trình lên men ethanol

Do đó đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên

cơ chất bã mía” được tiến hành

1.2 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sử dụng cơ chất bã mía để lên

men cồn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về men rượu

Thực chất men rượu là môi trường không thuần khiết của hệ sinh vật có khả năng sinh trưởng, tổng hợp hệ enzyme đường hóa và lên men rượu Nói cách khác, hệ vi sinh vật trong men rượu rất đa dạng Trong đó, có ba loài phổ biến nhất, có số lượng đông đảo nhất và có vai trò quan trọng nhất: nấm men, nấm mốc và vi khuẩn

Các kết quả nghiên cứu khoa học cho thấy các giá trị pH bánh men rượu ở Việt Nam trong khoảng 5,76, độ ẩm khoảng 13,6, hàm lượng vi sinh vật trong nấm men

bánh men rượu Trong tổng số 119 vi sinh vật phân lập được thì có 53 tế bào nấm mốc,

51 tế bào nấm men và 15 tế bào vi khuẩn

Nấm mốc thường có mặt trong bánh men chủ yếu là các chủng Rhizopus, Mucor,

Aspergilluls, Amylomyces Chúng giữ vai trò đường hóa( Trần Thị Thanh,2001) Loài Mucor, đặc biệt là Mucor rouxii có khả năng chịu nhiệt cao (32-35oC), chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa

Nấm men gồm hai chi khác nhau là Endomycopsis fibuligenes là loài nấm men

rất giàu enzyme amylase, glucoamilase, do đó chúng vừa có khả năng đường hóa, vừa

có khả năng rượu hóa; và Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men rất nhiều

loại đường khác nhau như glucose, saccarose, maltose, fructose, raffinose, galactose

0,02-0,025% và có khả năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn với lượng đường trong dung dịch từ 12-14% có khi đến 16-18% Nồng độ rượu

Ngoài hai chi nấm men kể trên, trong men thuốc bắc còn thấy nhiều loài nấm men hoang dại khác nhau Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển hóa đường thành cồn, tuy rằng sự chuyển hóa này còn rất thấp Điều đặc biệt là

trùng ở nồng độ 0,05-1% (Nguyễn Đức Lượng, 1998)

Ngoài ra trong bánh men thuốc bắc còn có sự hiện diện của một số loài vi khuẩn phát triển, trong đó chủ yếu là các loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic Các loài vi

khuẩn thường làm chua môi trường Thời gian đầu của quá trình lên men, quá trình này xảy ra có lợi vì pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm mốc phát triển, tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men Mặt khác nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic Quá trình này làm tổn hao lượng cồn tạo thành (Nguyễn Thị Hiền, 2004)

2.2 Giới thiệu chung về nấm men

Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999) Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm, con người từ lâu đã biết ứng dụng nấm men vào sản xuất các loại

thực phẩm truyền thống như rượu, bia, bánh mì…

Hình 1 Tế bào nấm men

(* Nguồn: http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8485043/1/, ngày 20.7.2013)

2.2.1 Hình dạng và kích thước của nấm men

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: do cấu tạo đơn bào nên chúng tạo ra các khuẩn

lạc có những đặc trưng như: hình dạng khuẩn lạc thường tròn, không đều hoặc hình thoi, bìa của khuẩn lạc thường là bìa nguyên, chia thùy, gợn sóng hoặc răng cưa (Huỳnh Xuân Phong, 2010)

Hình dạng tế bào: Nấm men thường có hình cầu, hình elip, hình ovan và có cả

dạng hình dài Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số loài như Candida albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty giả và Eremothecium gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piškur, 2006)

Kích thước tế bào: Nấm men là loài vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực

Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn Kích thước của nấm

men khác nhau tùy theo loài và thời kỳ sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae là nấm men thường được sử dụng trong lên men rượu, bia có kích thước

chiều rộng khoảng 2,5 – 10µm và chiều dài 4,5 – 21µm, có thể thấy rõ dưới kính hiển

vi quang học (Nguyễn Lân Dũng, 1999)

Hình 2 Các dạng tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử

(*Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.htm, ngày 20/07/2013)

2.2.2 Cấu tạo của nấm men

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) nấm men có thành phần hóa học như sau:

Bảng 1: Thành phần hóa học của nấm men

(*Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Thành tế bào: Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm, chiếm 15 – 30%

trọng lượng khô của tế bào nấm men, được cấu tạo chủ yếu từ glucan (60% khối lượng thành tế bào), mannoprotein, chitin và một lượng nhỏ lipid

Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác nhau,

được cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khô), phần còn lại là lipid và một ít polysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999)

Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất

nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme

Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên

trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân Nhân tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể

Các bào quan và thành phần khác: ty thể, không bào, ribosome,…

2.2.3 Sự sinh sản và phát triển của nấm men

Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh sản

vô tính và sinh sản hữu tính

- Sinh sản vô tính: chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi

nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans)

- Sinh sản hữu tính: nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales

Nấm men là các vi sinh vật hóa dị dưỡng vì chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển Nguồn carbon được nấm men sử dụng hầu hết là đường sáu carbon như glucose và fructose hoặc các đường đôi như sucrose hoặc maltose Một số loài có thể sử dụng đường năm carbon (đường ribose) Nguồn nitrogen cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitrogen của tế bào là các hợp chất hữu cơ hay vô cơ có sẵn trong môi trường Nấm men có khả năng tổng hợp tất cả acid amin Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat Song, giống

Hansenula và giống Pichia lại đồng hóa được chất này Một số loài thuộc giống Brettanomyces cũng đồng hóa được nitrat Về nhu cầu dinh dưỡng các nguyên tố vô

cơ, phospho là nguyên tố được quan tâm nhiều nhất, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh,

Nấm men có thể tồn tại được trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí với khoảng nhệt độ tương đối rộng và pH acid thích hợp cho sự phát triển của nấm men

2.2.4 Vai trò và ứng dụng của nấm men

Nấm men có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như dùng trong sản xuất ethanol, bánh mì, rượu vang, bia, tạo sinh khối protein và vitamin, sản xuất enzyme, acid citrid… Trong đó việc ứng dụng nấm men vào việc lên men các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol rất đáng được quan tâm, nguồn ethanol giá thành rẻ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết vấn đề về nhiên liệu và ô nhiễm môi

trường

2.3 Sự lên men ethanol

Lên men ethanol là quá trình chuyển hóa đường thành ethanol được thực hiện bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau nhưng chủ yếu là nấm men Trong công nghiệp cồn, bia, rượu, các loại nước uống có cồn, người ta thường sử dụng nấm men

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces trong quá

trình lên men tạo ethanol

Ethanol được sản xuất chủ yếu từ các loại nguyên liệu từ thực vật có chứa đường, hoặc tinh bột và cellulose thông qua phản ứng trung gian thủy phân tạo đường

- Các cơ chất có hàm lượng đường cao thường được dùng để lên men ethanol thường là: rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín; sự lên men từ các nguyên liệu này được thực hiện trực tiếp mà không thông qua quá trình thủy phân tạo đường

- Những cơ chất giàu tinh bột như: gạo, lúa mì, ngô, khoai mì, khoai tây, khoai lang…, đối với các loại nguyên liệu này cần phải có quá trình thủy phân tinh bột tạo đường cho nấm men sử dụng để lên men tạo ethanol

và tốn kém Các phương pháp xử lý được áp dụng gồm có xử lý cơ học, hóa học và sinh học (dùng vi sinh vật)

Quá trình chuyển hóa sinh khối cellulose thành ethanol yêu cầu việc xử lý nguyên liệu thành đường đơn sẵn sàng cho quá trình lên men Thủy phân hỗn hợp cellulose khó hơn thủy phân tinh bột vì hỗn hợp cellulose là tập hợp các phân tử đường liên kết với nhau thành mạch dài (polyme carbonhydrat) gồm khoảng 40 - 60% cellulose và 20 - 40% hemicellulose, có cấu trúc tinh thể bền Hemicellulose chứa hỗn hợp các polyme có nguồn gốc từ xylose, mannose, galactose kém bền hơn cellulose Nói chung hỗn hợp cellulose khó hòa tan trong nước Phức polyme thơm là lignin (10

Việc chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học ethanol có ba bước cụ thể là tiền xử lý, thủy phân và lên men Các nguyên liệu trở nên dễ tiếp cận hơn với các enzyme sau khi tiền xử lý Cellulose phân cắt tạo thành đường khử mà đó là cơ chất cho quá trình lên men Cellulose là thành phần quan tâm chính và có thể xử lý bằng phương pháp hóa học hoặc thủy phân bằng enzyme để tạo thành glucose làm chất nền chính trong quá trình lên men ethanol Hemicellulose có cấu trúc nhỏ gọn hơn so với cellulose và có thể bị phân hủy đáng kể hoặc hòa tan trong tiền xử lý

Nhằm tạo ra một dạng cellulose đơn giản hơn để cho quá trình thủy phân dễ dàng hơn, các enzyme có thể tiếp xúc tối đa với cơ chất tương thích Phương thức và hiệu quả của quá trình tiền xử lý thay đổi nhiều tùy thuộc vào đặc tính cấu trúc của nguồn nguyên liệu được lựa chọn Các phương pháp xử lý được áp dụng gồm có xử lý cơ học, hóa học và sinh học (dùng vi sinh vật)

Xử lý cơ học làm giảm kích thước nguyên liệu, các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi Trong đó phương pháp xử lý bằng hơi nước được xem là hiệu quả hơn hết

Sử dụng tác động của hóa chất Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên vì nó rẻ và hiệu quả Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong

nhiều từ quá trình trung hòa acid với CaOH Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng các hóa chất khác Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp Detroy et al (1992) cho thấy rằng amonia lỏng có phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine có thể còn hiệu quả hơn Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol,

hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm Tuy nhiên xử lý bằng phương pháp hóa học gây nhiều tốn kém và ảnh hưởng nặng đến môi trường, do đó hiện nay phương pháp sinh học đang dần được được hoàn thiện để thay thế toàn phần hay sử dụng kết hợp với các phương pháp hóa học

Phương pháp xử lý sinh học sử dụng loại nấm như Cyathus sp, Streptomyces viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida và Peurotus cornucopiae có khả

năng thủy phân lignin và hỗ trợ một phần thủy phân nguồn nguyên liệu cellulose

Quá trình tạo hỗn hợp đường từ cellulose bắt đầu bằng giai đoạn vi khuẩn phân giải cellulose tổng hợp enzyme nhằm phân cắt mạch polymer của cellulose thành các cấu trúc đơn giản hơn và theo sau đó là quá trình thuỷ phân các cellulose đơn giản thành hỗn hợp đường

Quá trình này gây tiêu tốn nhiều chi phí trong giai đoạn sản xuất cồn Bằng kỹ thuật di truyền, các nhà nghiên cứu đang hướng đến tạo ra một tổ hợp enzyme có thể thủy phân nguồn nguyên liệu lignocellulose hiệu quả nhất Thủy phân hoàn toàn nguồn lignocellulose cần có những sự chuyển đổi các nhóm polysaccharide sau:

Chuyển hóa cellulose: Cellulose là loại polysaccharide đồng hình được cấu tạo từ

-D-glucose thông qua liên kết -(1-4) glycoside thành từ các đơn phân Quá trình thủy phân bằng tổ hợp enzyme cellulase bao gồm exoglucanase (-cellobiohydrolase), endoglucase, –glucosidase và sản phẩm cuối cùng là glucose

Chuyển hóa hemicellulose: hemicellulose là thành phần dồi dào nhất thứ 2 trong nguồn nguyên liệu lignocellulose (25-30%) Hemicellulose là một loại polymer

dị hình được tạo bằng các đơn phân pentose (D-xylose, D-arabinose), đơn phân hexose (D-mannose, D-glucose, D-galactose) và các acid đường Xylan là thành phần thường

thấy trong các thân gỗ cứng, tuy nhiên glucomanan lại là thành phần chính trong các loại thực vật thân mềm Tổ hợp enzyme để thủy phân hemicellulose cũng rất phức tạp

Ví dụ -xylanse để thủy phân xylan thì tổ hợp enzyme cần thiết là arabinofuranosidase, -glucuronidase và -xylosidase

endo-1,4-L-Nguồn enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay là từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger Đa số vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose cũng có khả năng

tổng hợp xynalase để phân hủy xylan Khả năng này thường thấy ở vi sinh vật sống

trong dạ cỏ động vật nhai lại như: Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio, Ruminococus và các vi khuẩn chi Clostridium Hiện nay, người ta đang thay thế dần các hệ enzyme

chịu nhiệt, chịu các điều kiện hóa học quá hạn Hơn hết là các nghiên cứu về phức hợp cellulosome của các vi khuẩn kỵ khí đang dần mở ra một con đường mới nhằm tăng hiệu quả thủy phân của tổ hợp trên các loại nguyên liệu lignocellulose

- Cơ chế của quá trình lên men ethanol từ glucose

Lên men ethanol là quá trình trao chuyển hóa dưới tác dụng của chất xúc tác là enzyme Đây là quá trình lên men kỵ khí dưới sự có mặt của nấm men tạo thành

Quá trình lên men rượu của nấm men gồm hai giai đoạn chính:

- Tăng sinh khối nấm men: tế bào nấm men phát triển và tăng sinh khối, giai đoạn này cần sự hiện diện của oxy

- Lên men chuyển hóa đường thành rượu: quá trình này xảy ra dưới điều kiện

kỵ khí theo sơ đồ sau:`

(*Nguồn: Norr et al, 2003)

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men

- Dinh dưỡng

Nitơ và nguồn carbon là yếu tố dinh dưỡng chính trong môi trường lên men Sự tương tác lẫn nhau của các chất dinh dưỡng có thể đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của nấm men Các chất bổ sung vào môi trường sinh trưởng có chứa maltose hoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm tăng sinh khối và sự sản sinh ethanol (Helena de Cruz et al, 2003)

- Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men Thông thường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28 – 30°C Nhiệt độ khoảng hơn 50°C và dưới 0°C thì sự lên men hầu như bị đình trệ Thông thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất sản phẩm, cũng như ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm Trong công nghiệp lên men thực phẩm, nhiệt độ tối ưu của quá trình lên men có thể không trùng khớp với nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật

- pH

pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và ảnh hưởng lên sự phát triển của nấm men Năng suất lên men ethanol cao nhất thường dao động ở pH 4,5 – 4,7 Khi pH được điều chỉnh lên 7 hoặc cao hơn thì acid acetic được tạo thành từ acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al, 2001)

- Khí oxy và carbonic

Nấm men là vi sinh vật vừa kỵ khí vừa hiếu khí Trong điều kiện kỵ khí, chúng

sinh sản của nấm men Trong điều kiện nhiệt độ cao, lượng khí hòa tan trong dung dịch lên men sẽ giảm xuống, tạo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men của nấm men

- Nồng độ ethanol

Nồng độ ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, nồng độ ethanol cao có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men Việc chọn lọc dòng nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao sẽ mang lại lợi ích đáng kể cho quá trình lên men vì các dòng nấm men này có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men

Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 dòng nấm men từ viên men rượu, 9 dòng được chọn để khảo sát khả năng chịu độ cồn Kết quả thử khả năng chịu đựng độ cồn cho thấy 7 dòng có khả năng chịu độ cồn trong khoảng 5 – 6% (w/v) ethanol và 2 dòng có khả năng chịu độ cồn thấp hơn từ 2,4 – 3% (w/v) ethanol

- Nồng độ dịch lên men

Nồng độ dịch lên men được xác định bằng khối lượng đường sucrose trong dung dịch (độ Brix) Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi độ nhớt của môi trường tăng áp suất dẫn đến mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Nồng độ ethanol được sản sinh tăng cao cũng gây ức chế nấm men Tuy nhiên nếu nồng độ dịch đường quá thấp thì sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất lên men, hao phí trong quá trình chưng cất

2.5 Ethanol sinh học

Ethanol sinh học (bio-ethanol) là một loại nhiên liệu sinh học dạng lên men và chưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, thường được sản xuất từ các loại cây nông nghiệp hàm lượng đường cao như bắp, lúa mì, lúa mạch, mía Ngoài ra, ethanol sinh học còn được sản xuất từ cây có chứa cellulose Cellulose đã được sản xuất thành công và đưa vào sử dụng làm nhiên liệu nhiều nước trên thế giới Hiện nay, việc sản xuất ethanol từ các loại cây nông nghiệp có thể ăn được đang gây lo lắng về vấn đề an ninh lương thực Chính vì vậy, thế giới đang đi theo hướng sản xuất ethanol từ nguyên liệu chứa hợp chất cellulose

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học trong nước

Trần Diệu Lý (2008) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ bằng

phương pháp nổ hơi, thủy phân bằng cellulase và lên men với Saccharomyces cerevisiae Kết quả cho thấy từ 1 kg rơm thô sẽ thu được 204,16g glucose, qua đó thu

Nguyễn Thị Hằng Nga (2009) nghiên cứu khả năng sản xuất ethanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp Đề tài đã xác định được điều kiện cho quá trình thủy phân

dịch sau thủy phân có hàm lượng đường khử là 4 g/l Đề tài đã chọn chủng xạ khuẩn ACT 06 làm tác nhân cho quá trình thủy phân bằng vi sinh vật và chủng SA.03 là chủng nấm men có khả năng lên men cao làm tác nhân cho quá trình lên men Kết quả cho thấy cần 7.787 kg thân cây ngô sau thu hoạch để sản xuất được dịch giấm chín chứa 1 lít ethanol

Nguyễn Xuân Cự (2010) nghiên cứu khả năng thủy phân bằng axít loãng và bước đầu đánh giá hiệu quả sản xuất ethanol sinh học từ thân cây ngô Quá trình thủy phân

thành khá cao (4,2 g/l) khi tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 (w/v) Đây được xem là điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân thân cây ngô bằng acid loãng Sử dụng

Saccharomyces cerevisiae lên men có thể chuyển hóa khoảng 70% lượng đường khử

trong dung dịch và lượng ethanol tạo thành có nồng độ 2,5% thể tích Dựa trên các kết quả nghiên cứu này, có thể tính sơ bộ để sản xuất 1 lít etanol sinh học cần khoảng 3,24

kg nguyên liệu từ thân cây ngô

Đoàn Thị Ngọc Hân (2010) báo cáo đề tài luận văn “Bước đầu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm” đã khảo sát các điều kiện để tối ưu các quá trình lên men ethanol từ

37°C trong 23 giờ, sau khi tiền xử lý, rơm được thủy phân ở điều kiện 3% (v/v) enzyme, 50°C, pH % trong 72 giờ sẽ thu được lượng đường khử là 0,455g/g rơm Để

thu được ethanol, bổ sung 0,3% (v/v) nấm men Saccharomyces cerevisiae vào dịch

đường khử, sau 3 ngày lên men, lượng ethanol thu được là 3% (v/v)

Tại Việt Nam, mẻ sản phẩm cồn sinh học ethanol đầu tiên được sản xuất dùng để

pha vào xăng đã xuất xưởng ngày 5.8.2010 Đây là sản phẩm của nhà máy sản xuất

nhiên liệu sinh học ethanol đầu tiên của Việt Nam, hoàn thành và đưa vào sản xuất tại Công ty cổ phần Đồng Xanh, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam

Từ năm 2011, Việt Nam có chính sách sử dụng xăng sinh học E5 (hàm lượng ethanol 5%) làm nguyên liệu thay thế cho xăng A92 truyền thống Năm 2011, Việt Nam, đã sản xuất ethanol khoảng 0,3 triệu tấn/ năm Mục tiêu của chính phủ tới

năm 2015 là 1,5 triệu tấn Quy trình công nghệ sinh học sản xuất ethanol từ phế thải nông nghiệp của giáo sư Trần Đình Toại (2012) được xem là một sáng chế tiêu biểu của khoa học Việt Nam Theo nghiên cứu thử nghiệm, cứ 1 kg rơm rạ sẽ thu được khoảng 0,4 kg cellulose, nếu chọn được các chủng vi sinh có hệ enzyme với hoạt tính cao thì hiệu suất của giai đoạn thủy phân có thể đạt 80-90%, có nghĩa là từ 0,4 kg cellulose sẽ thu được trung bình là 0,34 kg glucose, từ đó sản xuất ra ethanol Bằng phương pháp trên, với lượng lớn phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) hiện nay của nước ta, nếu sử dụng 30% để sản xuất ethanol với hiệu suất 15%, chúng ta đã có thể thu được

từ 3,6 đến 4,5 triệu tấn ethanol, vượt mục tiêu mà Chính phủ đặt ra tới năm 2015

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học ngoài nước

Keikhosro Karimi et al (2006) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ bằng phương pháp tiền xử lý với acid loãng, thủy phân và lên men đồng thời với

Mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae

Một nghiên cứu của Rajeev Sukumaran và cộng sự (2009) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ nguồn sinh khối bã mía Cơ chất bã mía được đường hóa với chủng

vi sinh vật là Trichoderma reesei RUT C30 và Aspergillus niger MTCC 7956, sau đó được lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên men rắn

Kết quả sản xuất được 0,093 g ethanol trên mỗi gram rơm

Năm 2010, M.Lever và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học thành

công từ rơm lúa mì bằng phương pháp lên men rắn với Saccharomyces cerevisiae, trước đó họ dùng dịch enzyme thô từ nấm mốc Trichoderma reesei để thủy phân vật

liệu lignocellulose

Nasim Shaibani (2011) nghiên cứu quá trình sản xuất ethanol sinh học từ bã mía

bằng nấm Aspergillus niger hiệu quả hơn so với nấm Trichoderma longibrachiatum Sau đó dùng phương pháp lên men rắn với Saccharomyces cerevisiae, kết quả có thể

chuyển hóa 81% cơ chất bã mía cho quá trình sản xuất ethanol

Công trình nghiên cứu của Firoz Ahmed và cộng sự (2012) đã tiền xử lý bã mía

bằng NaOH ở pH 4, 50°C trong 24 giờ, sau đó trích dịch enzyme thô từ Trichoderma viride cho quá trình thủy phân bã mía, nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử

dụng để lên men sau đó Quy trình này đã sản xuất ra ethanol với nồng độ 0,579 % và

1,15% Đây là báo cáo đầu tiên ở Bangladesh về sản xuất cellulose ethanol sử dụng các chủng vi sinh vật địa phương Mặc dù nồng độ sản xuất ethanol là rất thấp, nhưng đây là một động lực lớn trong lĩnh vực này có thể tối đa hóa sản xuất, qua đó đáp ứng

nhu cầu nhiên liệu trong tương lai

Hiện nay, tình hình sản xuất và sử dụng ethanol trên thế giới phát triển rất mạnh

mẽ, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất nhiên liệu sinh học là sản phẩm nông nghiệp, các loại hạt có dầu, rong tảo, cellulose và một phần nhỏ từ các loại mỡ cá, mỡ động vật nói chung

Tại Đông Nam Á, Thái Lan là nước đứng đầu về sản xuất và sử dụng ethanol làm nhiên liệu, khoảng 1,5-1,6 triệu tấn/năm

Brazil: sản lượng tiêu thụ ethanol đạt tới 14-15 triệu tấn/năm đứng đầu thế giới Mỹ: Hình thành vành đai nông nghiệp gồm nhiều ban chuyên sản xuất ngô, làm nhiêu liệu cho hơn 50 nhà máy sản xuất ethanol sinh học với sản lượng tiêu thụ 13 triệu tấn/năm

Các nước Canada, Mexico, Pháp, Thụy Điển, Úc, Nam Phi, Trung Quốc đều đã tùng bước phát triển công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học, chủ yếu là nhiên liệu hóa thạch pha ethanol sinh học

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện Nghiên cứu và Phát triển

Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: từ tháng 8.2013 đến tháng 12.2013

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm

Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật , tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi

Olympus CHT (Nhật), máy đo OD, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử

Nam), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

Dụng cụ: Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10,

P20, P200, P1000 (Đức), đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 500 ml, đĩa petri đường kính 10cm (Đức), ống nghiệm 10ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: ống Durham, que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…

Hóa chất: Ethanol 95%, agar, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Xylose,

(C8H18O) octilic alcohol, acetone, sodium hidroxide (NaOH), K2Cr2O7 , Na2S2O3,

H2SO4, KI,

3.1.3 Nguyên vật liệu

trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,1 mm Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc nhiều lần để loại đường

Nguồn vi khuẩn: 3 dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ bò Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus subtilis FS321 do phòng thí nghiệm

Công nghệ Enzyme, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ cung cấp

Nguồn men rượu: men rượu được mua tại 3 tỉnh (thành phố) Cần Thơ (71/2, phường An Bình, quận Ninh Kiều, TP.Cần Thơ), Hậu Giang (ấp Tân Phú, xã Tân Bình, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang), Bến Tre (209, xã Phú Lễ, huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre) Viên men được nghiền mịn thành bột trước khi chủng vào môi trường

3.1.4 Xử lý số liệu, phân tích thống kê

Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Stagraphic XV

Kết quả ghi nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2007

3.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1)

Bảng 2 Thành phần môi trường PGA

Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)

(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003)

Môi trường Potato Glucose (PG) (M2)

Bảng 3 Thành phần môi trường Potato Glucose (PG)

Hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)

Bảng 4 Thành phần môi trường cải tiến nuôi vi khuẩn dạ cỏ bò (M3)

Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)

(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh., 2010)

Bảng 5 Thành phần môi trường cải tiến nuôi sinh khối vi khuẩn dạ cỏ bò (M4)

Tên hóa chất Khối lượng/ Thể tích

Bột bã mía (NH 4 ) 2 SO 4

KH 2 PO 4

K 2 HPO 4 MgSO 4 7H 2 O NaCl Nước

10 (g)

1 (g)

1 (g)

1 (g) 0,5 (g) 0,001 (g)

1000 (ml)

(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng nấm men từ men rượu

Mục đích: Phân lập các dòng nấm men từ nguồn men

Vật liệu: Bột viên men rượu thu về từ một số tỉnh (thành phố): Cần Thơ, Bến

Tre, Hậu Giang

Tiến hành:

- Chủng 1 g men rượu vào 100 ml môi trường M2, ủ lắc 38°C, lắc ngang 45 lần/phút, 48h

- Tiếp tục cấy ria trên đĩa petri đến khi xuất hiện khuẩn lạc rời rạc, quan sát trên kính hiển vi quang học ở vật kính 40X

Chỉ tiêu theo dõi

- Quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước, dạng bìa,… của khuẩn lạc nấm men

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men

Mục đích: Khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sinh tổng

hợp exoglucanase để có thể sử dụng cơ chất cellulose

Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (dòng nấm men), 3 lần lặp

lại, mẫu đối chứng không chủng nấm men

Tiến hành thí nghiệm:

kính lỗ đục 5 mm của môi trường M3 Ủ lắc ở 38°C, 24 giờ

- Khảo sát đường kính vòng tròn phân giải bã mía bằng cách nhuộm màu với Congo red

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng tròn phân giải bã mía

Đường kính vòng tròn phân giải bã mía = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men

Mục đích: khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sinh tổng

hợp endoglucanase để có thể sử dụng cơ chất cellulose

Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (dòng nấm men), 3 lần lặp

lại, mẫu đối chứng không chủng nấm men

Tiến hành thí nghiệm:

kính lỗ đục 5mm của môi trường M3 (cơ chất CMC) Ủ ở 38°C, 24 giờ

- Khảo sát đường kính vòng tròn phân giải CMC bằng cách nhuộm màu với Congo red

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng tròn phân giải CMC

Đường kính vòng tròn phân giải CMC = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục

3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men một số loại đường

Mục đích: tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng lên men tốt nhất 4 loại đường tìm nguồn carbon nào là phù hợp nhất cho các dòng nấm men

Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (nấm men:), 3 lần lặp lại Tiến hành thí nghiệm:

dịch các loại đường (D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Xylose) (2% w/v) vào ống nghiệm Ủ ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao (mm) cột khí trong ống Durham sau 12 giờ, 24 giờ,

36 giờ, 48 giờ, 60 giờ

3.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với vi khuẩn

Mục đích: tuyển chọn được một số dòng nấm men có khả năng phối hợp với vi khuẩn để lên men cho hiệu suất cao

Giống nấm men: các dòng nấm men lên men tốt từ các thí nghiệm trước

Vi khuẩn: 3 dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis

S20, Bacillus subtilis FS321

Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 14 nghiệm thức, 3 lần lặp lại

-VK không bổ sung vi khuẩn

+ VK: Vi khuẩn nuôi trong môi trường M4 trong 3 ngày, ủ ở điều kiện kỵ khí, nhiệt độ 38°C + VK (121°C): Vi khuẩn nuôi trong môi trường M4 trong 3 ngày, ủ ở điều kiện kỵ khí, nhiệt độ 38°C Sau đó đem khử trùng ở 121°C, 20 phút

- NM: không bổ sung nấm men

Tiến hành thí nghiệm:

M3 Ủ ở điều kiện kỵ khí ở 38°C, 3 ngày vào các NT được phân bố như Bảng 6

các NT được phân bố như Bảng 6

- Tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng (22°C (đêm), 32°C (ngày))

Chỉ tiêu theo dõi:

giờ

- pH môi trường trước và sau khi lên men

- Hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men bằng phương pháp Nelson

- Đo độ cồn bằng cồn kế

- Định lượng ethanol bằng Kali dicromat

- Hàm lượng DM, CF giảm của bã mía sau khi lên men

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập các dòng nấm men từ men rượu

Mười tám dòng nấm men được phân lập từ các nguồn men rượu ở ba tỉnh (thành phố) Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang Các dòng nấm men phân lập không có sự khác biệt lớn về hình thái, kích thước khuẩn lạc: kích thước nhỏ (từ 1 đến 4 mm) đa số đều

có bìa nguyên, trừ dòng H1, H5, H6, H15 (bìa gợn sóng), H7 (bìa răng cưa); màu trắng đục hoặc trắng trong; độ nổi phẳng (H12, H15, H16, H17), lài (H7, H8, H9, H10, H11, H18), 8 dòng nấm men còn lại khuẩn lạc mô Khi quan sát qua kính hiển vi (ở vật kính 40X), tế bào nấm men có kích thước nhỏ, từ 1,01 đến 4,05 µm, các hình dạng quan sát được có sự khác biệt không lớn, đa số là hình tròn hoặc ovan, một số dòng hinh elip (H2, H7, H15) (Bảng 7)

Bảng 7 Đặc điểm của các dòng nấm men phân lập

STT Tên

mẫu

Nguồn phân lập

Đường kính khuẩn lạc (mm)

Kích thước

tế bào (µm) Dạng bìa Độ nổi Màu sắc

Hình dạng

tế bào

4.2 Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men

Kết quả khảo sát định tính khả năng phân giải bã mía bằng phương pháp đo đường kính vòng tròn phân giải bã mía trên đĩa thạch có cơ chất bã mía của các dòng nấm men cho thấy hoat tính thủy phân khác nhau giữa các dòng nấm men (Hình 4) Cụ thể, 8 dòng nấm men H1, H2, H3, H4, H8, H11, H14, H17 không thể hiện hoạt tính thủy phân trên cơ chất bã mía, 10 dòng nấm men còn lại đều thể hiện đường kính tròn halo khác biệt có ý nghĩa thống kê Dòng nấm men H13 có đường kính thủy phân lớn nhất 34,67mm, kết quả này có khác biệt ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại ở mức độ 5% Bên cạnh đó, các dòng H10, H16, H5, H9, H12 cũng thể hiện hoạt tính thủy phân mạnh với đường kính vòng halo lần lượt là 30,33 mm, 29,33 mm, 29,33 mm, 28,67

mm và 27 mm Ba dòng H7, H6, H15 có khả năng phân giải bã mía yếu hơn, đường kính vòng tròn halo nhỏ, có giá trị lần lượt là 24,67 cm, 22,33 cm và 20,67 cm Hoạt tính phân giải yếu nhất là dòng H18 (3,33 cm) Theo Lj-Jung et al (2010) ủ dịch enzyme cellulase với cơ chất cellulose là cách để xác định hoạt tính enzyme exoglucanase trong phức hệ enzyme cellulase Điều này chứng tỏ H13, H10, H16, H5, H9, H12 là những dòng nấm men có hoạt tính exoglucanases mạnh

Hình 4 Đường kính vòng halo trên cơ chất bã mía của các dòng nấm men

*Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng ký tự thể hiện sư khác biệt không có ý

nghĩa thống kê ở mức 5%, CV= 7,22%

bc

f e

i

e b

i

d a

i

g bc

i h

0.00 5.00 10.00