Nghiên cứu về đặc điểm thực vật và tác dụng kháng khuẩn của cây trà hoa vàng (camellia sp ) thu hái ở huyện ba chẽ, tỉnh quảng ninh

DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Phân bố của một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam 4 – 7 2.1 Đặc điểm mô tả trong nghiên cứu đặc điểm thực vật 18 2.2 Khối lượng cắn thu được của mẫu nghiên cứu 20 2.

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS

Thiên Kim người thầy đã truyền cho tôi tình yêu khoa học, dìu dắt tôi từ những ngày

đầu làm nghiên cứu khoa học, cũng là người trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp

thắc mắc, khó khăn mà tôi gặp phải trong quá trình thực hiện khóa luận

- TS Đỗ Ngọc Quang – Bộ môn Vi sinh và Sinh học, Trường Đại học Dược Hà

Nội đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện khóa luận

- Các thầy cô giáo và các chị kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực nghiệm

- Ban Giám Hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tại đây

- Anh Nịnh Văn Trắng ở thôn Khe Sa, xã Đạp Thanh, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh đã hỗ trợ cung cấp mẫu ở địa phương để phục vụ nghiên cứu

- Các bạn sinh viên khóa 70 cùng nghiên cứu và làm đề tài ở Bộ môn Thực vật đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại Bộ môn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Phạm Thị Mai Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANG MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Camelia L 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Camellia L 3

1.1.3 Phân bố 4

1.1.4 Đặc điểm một số loài Trà hoa vàng phân bố ở Quảng Ninh 7

1.2 Thành phần hóa học 8

1.2.1 Nhóm polyphenol 9

1.2.2 Nhóm flavonoid 10

1.2.3 Nhóm saponin: 11

1.3 Tác dụng sinh học 11

1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 11

1.3.2 Tác dụng kháng vi sinh vật 12

1.3.3 Các tác dụng khác 13

1.4 Một số phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn 14

1.4.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar disk diffusion assay) 14

1.4.2 Phương pháp pha loãng thạch (Agar dilution assay) 15

1.4.3.1 Phương pháp pha loãng trên 96 đĩa giếng (Broth microdilution) 15

1.4.3.2 Phương pháp sinh học tự động (Bioautography) 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Thiết bị 17

2.1.3 Dung môi, hóa chất 18

2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 18

2.2.1.1 Phân tích hình thái 18

2.1.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học 19

2.1.1.3 Giám định tên khoa học 19

2.2.2 Nghiên cứu tác dụng sinh học 19

2.2.2.1 Chuẩn bị dịch chiết: 19

2.2.2.2 Thử tác dụng kháng VSV bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả thực nghiệm 24

3.1.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật 24

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái của Trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh 24

3.1.1.2 Đặc điểm vi phẫu 26

3.1.1.3 Đặc điểm bột lá 28

3.1.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn 29

3.2 Bàn luận 32

3.2.1 Về thực vật 32

3.2.2 Về tác dụng kháng khuẩn 35

KẾT LUẬN 38

ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B subtilis Bacillus subtilus

C albicans Candida albicans

C cruzei Candida cruzei

C parapsilosis Candida parapsilosis

C tropicalis Candida tropicalis

E coli Escherichia coli

MBC Minimum bactericidal concentration- Nồng độ diệt

khuẩn tối thiểu

MIC Minimum inhibitory concentration – Nồng độ ức chế tối

thiểu

vàng kháng methicilin

P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

PC Paper Chromatography - Sắc ký giấy

S aureus Staphylococcus aureus

S flexneri Shigella flexneri

TLC Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Phân bố của một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam 4 – 7 2.1 Đặc điểm mô tả trong nghiên cứu đặc điểm thực vật 18 2.2 Khối lượng cắn thu được của mẫu nghiên cứu 20 2.3 Chủng VSV và kháng sinh sử dụng làm chứng dương 21

3.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 30 3.2 So sánh đặc điểm hình thái của 3 loài Trà hoa vàng Camellia

nitidissima (vùng Quảng Tây, Trung Quốc), Camellia

nitidissima (vùng Ba Chẽ, Quảng Ninh) và Camellia

chrysantha (vùng Ba Chẽ, Quảng Ninh)

34 – 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Công thức cấu tạo một số loại cathechin 10

3.4 Một số đặc điểm của bột lá Trà hoa vàng 29

3.5 Vòng vô khuẩn của kháng sinh và các mẫu thử trên

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ lâu đời, Chi Trà (Camellia L.) với gần 300 loài phân bố đa dạng ở nhiều

nơi trên thế giới đã được sử dụng trong cuộc sống với những vai trò quan trọng trong làm thức uống và thực phẩm hoặc làm thuốc với các tác dụng sinh học tốt [54] Trà

hoa vàng là một nhóm trong số các loài thuộc chi Camellia L với màu vàng đặc trưng của hoa Được mệnh danh là “Nữ hoàng của các loài trà”, kim hoa trà đã được

người Trung Quốc sử dụng rộng rãi vì những nghiên cứu về tác dụng sinh học đáng quan tâm của nó như tác dụng chống oxi hóa, giảm đường huyết, giảm cholesterol,

hạ mỡ máu, chống u bướu, kháng vi sinh vật, v.v [53]

Việt Nam được các nhà khoa học xác định nằm trong khu trung tâm đa dạng

sinh học các loài Trà Đến nay đã xác định được có 58 loài Camellia, trong đó có hơn 40 loài Camellia có màu vàng phân bố rộng rãi từ Bắc vào Nam [9] Những năm

gần đây, các nghiên cứu về Trà hoa vàng bắt đầu phát triển mạnh mẽ, chủ yếu tập trung vào phần thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học Có thể nói, nhờ những nghiên cứu như vậy, Trà hoa vàng dần được quan tâm nhiều đến và phát triển thành những sản phẩm chăm sóc sức khỏe mang lại hiệu quả kinh tế cao Quảng Ninh

là một trong những vùng có sự phân bố đa dạng của các loài Trà hoa vàng ở miền bắc Việt Nam, đặc biệt là vùng núi Ba Chẽ Nhận thấy được tiềm năng của loài Trà này, ban lãnh đạo tỉnh Quảng Ninh đã có những hoạt động phát triển cũng như bảo tồn đối với các loài Trà hoa vàng Tuy nhiên, các loài Trà hoa vàng được tìm thấy và

nghiên cứu ở Quảng Ninh như: Camellia chrysantha (Hu) Tuyama, Camellia

euphlebia Merr ex Sealy, Camellia rosmannii Ninh vẫn còn rất khiêm tốn so với

những nơi khác [1], [7], [50] Do đó, việc nghiên cứu bổ sung là cần thiết, góp phần tìm hiểu và khai thác các giá trị của các loài Trà hoa vàng một cách hiệu quả

Từ thực tế đó, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác dụng kháng

khuẩn của cây Trà hoa vàng (Camellia sp.) thu hái tại Ba Chẽ (Quảng Ninh)”

được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau:

- Mô tả đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu và xác định tên khoa học của cây Trà hoa vàng thu hái tại Ba Chẽ - Quảng Ninh

- Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của lá mẫu nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L

1.1.1 Vị trí phân loại chi Camelia L

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan năm 2009 [48], vị trí phân loại

của chi Camellia L được ghi nhận như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Camellia L

Theo Trần Ninh & Hakoda Naotoshi và Võ Văn Chi, đặc điểm hình thái của

chi Camellia L được mô tả như sau:

Cây bụi hoặc cây nhỏ thường xanh, cành nhẵn hay có lông Lá thường có cuống; đơn mọc cách, không có lá kèm, kích thước lá thay đổi, dài từ vài cm đến 45 cm; chất lá dày mỏng khác nhau; chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép có răng cưa nhọn hay tù Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-5 hoa ở nách

lá hoặc đỉnh cành Hoa màu đỏ, trắng hay màu vàng Cuống hoa ngắn hoặc gần như không Lá bắc 2-10, mọc xoắn trên cuống hoa, tồn tại hoặc sớm rụng Lá đài 5 phiến, tồn tại hoặc sớm rụng Cánh hoa 4-19, hợp một phần ở gốc cùng với vòng nhị ngoài Nhị nhiều, những nhị ngoài thường dính nhau thành cái chén hay ống ở phía gốc; vòng nhị phía trong rời nhau; chỉ nhị dài Bầu trên, 1-5 ô; vòi nhụy 1-5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau ở mức độ khác nhau, bầu và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn Quả nang hình cầu, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; có trụ quả hay không; vỏ quả dày hay mỏng, hoá gỗ Hạt thường 1 đến

nhiều hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm, vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn [5], [9]

1.1.3 Phân bố

Trên thế giới, chi Camellia L có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở nhiệt đới và

á nhiệt đới, có nguồn gốc ở khu miền đông và miền nam châu Á, từ phía đông dãy Himalaya tới Nhật Bản và Indonesia Hiện nay, các loài của chi này đã được phát hiện ở nhiều châu lục trên thế giới

- Châu Á: Ấn độ, Bangladesh, Đài Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-lanka, Trung Quốc, Việt Nam

- Châu Âu: Thổ Nhĩ Kỳ, Liên Xô cũ

- Châu Phi: Burundi, Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda

- Khu vực Nam Mỹ: Argentina, Brazil, Ecuador, Peru

- Châu Đại Dương: Australia, New-Zeland

Ở Việt Nam, chi Camellia L có khoảng 58 loài [9], trong đó có hơn 40 loài có

màu vàng được phân bố từ phía Bắc (Yên Bái, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Bắc Giang, v.v) vào phía Nam (Lâm Đồng, Bình Phước, v.v) (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Phân bố của một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

Ghi chú

kim

2 Camellia bugiamapensis Orel,

Curry, Luu & Q.D Nguyen

Trà bù gia mập

VQG Bù Gia Mập, Bình Phước

Quang, Đồng Nai

6 Camellia crassiphylla Ninh &

Hakoda

Trà vàng lá dày

Tam Đảo, Vĩnh phúc

[34]

7 Camellia cucphuongensis Ninh

& rosmann

Trà hoa vàng Cúc Phương

VQG Cúc Phương, Ninh Bình

[35]

8 Camellia dalatensis Luong,

Tran et Hakoda

Trà mi Đà Lạt

Đà Lạt, Lâm Đồng

[34]

9 Camellia dilinhensis Tran &

Luong

Trà mi Di Linh

Di Linh, Lâm Đồng

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[34]

Hakoda

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[34]

17 Camellia hamyenensis

M.Sealy

Trà hoa vàng Hàm Yên

Hàm Yên, Tuyên Quang

[34]

18 Camellia hatinhensis Luong,

Tran & L T Nguyen

Vũ Quang, Hà Tĩnh

[33]

19 Camellia hirsuta Hakoda &

N.Tran

Trà vàng nhiều lông

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[34]

20 Camellia huulungensis

Rosmann & Ninh

Trà hoa vàng Hữu Lũng

Hữu Lũng, Lạng Sơn

[34]

22 Camellia inusitata Orel, Curry

& Luu

Trà mi cánh dẹt

Núi Bà, Lâm Đồng

27 Camellia luteopallida Luong,

T.Q.T Nguyen & Luu

Trà hoa vàng trắng

28 Camellia megasepala Hung

T.Chang & Tran Ninh

Trà hoa vàng

Ba Bể

Tuyên Quang, Bắc cạn

[34]

29 Camellia murauchii Ninh &

Hakoda

Trà hoa vàng Murô

Nam

[60]

32 Camellia oconoriana Orel,

Curry & Luu

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[34]

34 Camellia phanii Hakoda &

N.Tran

Trà vàng phan

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[34]

Yên Tử

Yên Tử, Quảng Ninh

[34]

36 Camellia sonthaiensis Luu,

Luong, Q.D.Nguyen & T.Q.T

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[34]

38 Camellia thanxaensa Hakoda

& kirino

Thái Nguyên [34]

39 Camellia thuongiana Luong,

Anna Le & Lau

Trà mi Thưởng

40 Camellia tienii Ninh.T Hải đường

hoa vàng

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

[34]

41 Camellia tonkinlii Cohen-(Pit.)

Cohen- Stuart

Trà hoa vàng Bắc Bộ

1.1.4 Đặc điểm một số loài Trà hoa vàng phân bố ở Quảng Ninh

Quảng Ninh là một tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Việt Nam Những năm gần đây, sản phẩm Trà hoa vàng ở Quảng Ninh đã trở thành một thương hiệu uy tín được nhiều người biết đến Hiện nay, có 3 loài trà ở Quảng Ninh đã được nghiên cứu đặc điểm hình thái và công bố trên các tạp chí khoa học nổi tiếng Không dừng lại ở đó, việc tìm hiểu các loài Trà hoa vàng ở nơi đây vẫn được tiếp tục thực hiện

- Camellia chrysantha (Hu) Tuyama

Loài này được thu thập tại tỉnh Quảng Ninh vào năm 1962 bởi một nhà thực vật học Trung Quốc Hiện nay, nó được tìm thấy và trồng nhiều ở huyện Ba Chẽ Cành con mảnh, không lông Lá có phiến tròn, dài 11-14 x 4-5 cm, không lông, bìa có răng nhỏ, gân-phụ khoảng 10 cặp; cuống 6-7 mm Hoa mọc đơn độc; hoa vàng đậm; lá bắc 5; lá dài 5; cánh hoa 8-10, dài 3 cm, nhị nhiều; bầu không lông, vòi 3-4 dính nhau một phần Quả nang to 3 cm, vỏ quả dày 3 mm [8], [51] Loài này có nhiều

điểm tương đồng với loài Camellia nitidissima nên năm 1994 nhà thực vật Trung Quốc Chang Hung Ta cho rằng Camellia chrysantha là đồng nghĩa của Camellia

nitidissima [22] Tuy nhiên cho đến ngày nay tính tương đồng này vẫn còn gây nhiều

tranh cãi

- Camellia euphlebia Merr Ex Sealy

Loài trà này được tìm thấy ở huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh Là loài cây gỗ nhỏ, vỏ nhẵn màu xám mốc; lá có dạng hình trứng thuôn dài, mép lá có răng cưa dài,

mặt trên lá nhẵn bóng, có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, hơi ráp Gốc lá hình nêm hay tù, đầu lá hơi nhọn, lá dài bình quân 9-15 cm, rộng 4-7 cm Mỗi bên lá có 9-12 gân, gân lá hợp cách mép lá 0,2 – 0,6cm Hoa màu vàng tươi, đường kính hoa

5 – 6 cm, hoa nở vào tháng 10 đến tháng giêng năm sau; số lượng hoa trên cây nhiều, hoa mọc ở đầu cành hay nách lá.[7]

- Camellia rosmannii Ninh

Được công bố trên International Camellia Journal năm 1998, loài Trà này có nguồn gốc từ vùng núi Yên Tử, huyện Uông Bí, tỉnh Quảng Ninh Là loài cây bụi cao khoảng 3 m, cành nhẵn, tán lá hình elip, dài 10,5-13,5 cm x rộng 5-5,6 cm, có 9-11 cặp gân bên, cuống lá dài 6-7 Hoa, màu vàng mọc ở nách lá Đường kính 4,5-

5 cm, cuống ngắn (1,5 mm); lá đài 6; cánh hoa 15; nhị hoa dài 3-3,2 cm, vòng nhị ngoài dính ở gốc, noãn 3 ô, dài 2-2,2 cm, nhẵn; hạt hình cầu, hạt đơn ở mỗi vị trí, đường kính 1,8-2 cm Loài này mọc dọc theo bờ suối trong rừng thứ sinh, độ cao

khoảng 150 mét Thời kỳ ra hoa, tháng 11 đến tháng 1 Quả chín vào tháng Năm

Loài này gần giống với C ellphlebia Men Nhưng có những khác biệt: những bông

hoa có cuống rất ngắn, các hạt có lông măng [50]

1.2 Thành phần hóa học

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học trong các loài trà

thuộc chi Camellia L Đến nay người ta đã ghi nhận được hàng trăm các hợp chất

trong trà và chúng được chia thành các nhóm: alcaloid nhân purin (cafein, theobromin, theophylin, xanthin), nhóm polyphenol, nhóm flavonoid (kamepferol, quercetin), saponin triterpenoid, acid hữu cơ (acid oxalic, acid nicotinamic, acid ascorbic,v.v), acid béo (acid palmitic, acid stearic, acid oleic,v.v), protein, acid amin, pectin và tinh dầu (methyl salicylat, citronellon,v.v) [12], [31], [56] Trong đó, các nhóm sau được quan tâm nhiều nhất vì có các tác dụng sinh học quan trọng quyết

định tính chất của trà

1.2.1 Nhóm polyphenol

Thành phần polyphenol của lá Trà rất đa dạng, bao gồm chủ yếu là các

flavonoid và tanin [2], [10] Đối với lá Trà xanh, các hợp chất này có thể chiếm tới

30% sau khi sấy khô [31] Người ta đã phân lập được từ Trà xanh các chất polyphenol

có nhiều tác dụng đáng chú ý là: epicatechin (EC), galocatechin (GC), epicatechin

gallat (ECG), epigallocatechin gallat (EGCG) Trong đó, EGCG là thành phần chủ

yếu có nhiều nghiên cứu quan trọng, làm trung gian cho hầu hết các tác dụng sinh

học như giúp ổn định huyết áp, hạ đường huyết, hạ lipid máu, chống ung thư, kháng

khuẩn … [40], [42], [54] Năm 2011, Lixia Song và các cộng sự đã nghiên cứu thành

phần polyphenolic trong sáu loài Trà hoa vàng thu hái ở Trung Quốc: C

impressinervis, C euphlebia, C microcarpa, C nitidissima, C tunghinensis và C

chrysanthan, kết quả cho thấy rằng so với lá trà thường được tiêu thụ, lá Trà hoa

vàng chứa các hợp chất phenolic đa dạng hơn, bao gồm: ellagitannin,

proanthocyanidin, taxifolin deoxyhexose, dẫn xuất apigenin, dẫn xuất kaempferol,

dẫn xuất quercetin, glucosyl isorhamnetin, (epi)cate-chin-(epi)afezelechin polymers

và platphylloside [46]

(-) Epicatechin (-) Epigallocatechin

(-) Epicatechin gallate (-) Epigallocatechin gallate

Hình 1.1: Công thức cấu tạo một số loại cathechin

1.2.2 Nhóm flavonoid

Flavonoid tồn tại trong trà với một lượng đáng kể và có nhiều tác dụng sinh

học quan trọng Năm 2018, Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự đã phân lập thành

công và xác định cấu trúc hóa học của năm hợp chất flavonoid glycoside từ hoa của

Trà hoa vàng Camellia chrysantha gồm: vitexin (1),

quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (2), quercetin-7-O-β-D-quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (3),

3’-O-β-D-glucopyranoside (4) và 3-O-rutinose (5) [11] Trong đó hợp chất

quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside đã được nghiên cứu là có tác dụng oxy hóa cao [54] Một

nghiên cứu của Xiao Peng và các cộng sự năm 2012 cũng cho thấy được tác dụng

của hợp chất flavonoid được phân lập từ hoa của Camellia nitidissima ức chế tăng

sinh tế bào ung thư hạch [55]

1.2.3 Nhóm saponin:

Đến nay, một loạt các terpen và triterpenoid saponin đã được báo cáo từ lá, hạt

và hoa của các loài thuộc chi Camellia L Saponin từ lá của C sinensis được

Machida nghiên cứu lần đầu tiên vào năm 1938 Do hàm lượng thấp, nó không gây được nhiều sự chú ý cho đến khi một vài saponin hoạt tính sinh học trong lá trà được

tìm thấy Ví dụ, theasaponin B1, isotheasaponin B1 – B3, foliatheasaponin I-V từ C

sinensis; assamsaponin J từ C sinensis var assamica; camellioside A-B từ C japonica,… [15], [56] Nghiên cứu từ các saponin này đã cho thấy nhiều tác dụng

sinh học đáng quan tâm như: chống khối u, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng nấm, chống béo phì, [47], [56]

1.3 Tác dụng sinh học

1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động chống oxi hóa của Trà xanh

(Camellia sinensis) là do hoạt tính của các nhóm hợp chất như: polyphenol,

flavonoid, saponin,… Trong đó, polyphenol là nhóm có tác dụng chính [10], [12], [31], [56] Hoạt lực của các catechin trong Trà mạnh hơn vitamin E từ 1,3 đến 32 lần Nồng độ ức chế 50% tác dụng chống oxy hóa của epigalocatechin mạnh gấp 32 lần vitamin E, của epicatechin gấp 12,8 lần Đặc biệt EGCG chiếm 32% tiềm năng chống oxy hóa [12]

Những năm gần đây, các nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của Trà hoa vàng càng trở nên phổ biến [41], [46], [54], [59] Năm 2015 nghiên cứu về đặc tính

và thành phần chống oxy hóa trong lá của Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu)

Tuyama) của trường đại học y Quảng Tây, Trung Quốc đã được thực hiện Kết quả

là 16 biến đã được tìm thấy có hoạt động ức chế gốc DPPH picrylhydrazyl) Sáu trong số chúng được xác định là catechin (1), epicatechin (5), vitexin (8), isovitexin (10), quercetin-7-ObD-glucopyranoside (12) và kaempferol (16) và hoạt tính chống oxy hóa của chúng, tính theo tỷ lệ % ức chế DPPH trong

(1,1-diphenyl-2-dung dịch nước được sắp xếp như sau: (12) > (1) > (5) > (16) > (8) > (10) [54] Trước đấy, vào năm 2011, nghiên cứu của Lixia Song từ chiết xuất lá của 6 loài Trà

hoa vàng: C impressinervis, C euphlebia, C microcarpa, C nitidissima, C

tunghinensis, and C chrysantha cũng đã ghi nhận tác dụng chống oxy hóa trong các

loài này và đặc biệt là C impressinervis có mức độ oxy hóa cao nhất [46]

1.3.2 Tác dụng kháng vi sinh vật

Từ xa xưa, Trà được biết đến như là một vị thuốc có khả năng sát khuẩn tốt trong dân gian Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được tác dụng kháng vi sinh vật của Trà thông qua các nghiên cứu thực nghiệm Từ đó, người ta nhận thấy

rằng polyphenol trong Trà xanh Camellia sinensis đặc biệt là EGCG đóng vai trò

quan trọng trong tác dụng sinh học này [20], [23], [30], [45] Cụ thể, nghiên cứu về

tiềm năng kháng khuẩn của dịch chiết nước Camellia sinensis đã cho thấy những kết

quả khả quan [28] Sử dụng các phương pháp đánh giá tác dụng kháng khuẩn như: phương pháp khuếch tán đĩa thạch, phương pháp tại chỗ, xác định MIC và MBC của

dịch chiết nước Camellia sinensis, … nghiên cứu đã cho thấy được tác dụng của Trà

xanh lên cả vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương Đặc biệt, phát hiện quan trọng nhất của nghiên cứu này là tác dụng ức chế đối với các vi sinh vật kháng thuốc,

ví dụ: MRSA và P aeruginosa [27] Tác dụng ức chế của polyphenol trong trà đối

với sự phát triển và tăng trưởng của bào tử vi khuẩn được nghiên cứu Polyphenol

trong trà, đặc biệt là EGCG cho thấy tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ đối với Bacillus

stearothermophilus, là một vi khuẩn hình thành bào tử ưa nhiệt và Clostridium thermoaceticum, vi khuẩn kỵ khí hình thành bào tử Khả năng chịu nhiệt của các bào

tử vi khuẩn này đã giảm nhiều hơn khi bổ sung polyphenol trong trà ở nhiệt độ cao [45] Ngoài tác dụng kháng vi khuẩn thì Trà xanh cũng được ghi nhận là có tác dụng

kháng một số loại virus và nấm như: HBV, HCV, Candida albicans,… [23], [30],

[56] Năm 2003, Masatomo Hirasawa và Kazuko Takada đã đăng tải một bài báo nghiên cứu tác dụng của catechin trà xanh khi phối hợp với các thuốc kháng nấm

điển hình chống lại Candida albicans Kết luận của bài báo chỉ ra rằng EGCG tăng

cường tác dụng kháng nấm của amphotericin B hay fluconazole để chống lại C albicans nhạy cảm với thuốc và kháng thuốc Điều trị kết hợp với catechin cho phép

sử dụng liều thấp hơn của thuốc kháng nấm nhưng vẫn có nhiều hiệu quả trong điều trị chống nấm, từ đó có thể giúp tránh các tác dụng phụ của thuốc [23]

Gần đây nhất, năm 2018, nhận thấy được tác dụng kháng khuẩn của Trà hoa

vàng Camellia nitidissima trên các vi khuẩn gram (-) và gram (+) đặc biệt là

Pseudomonas aeruginosa trong các nghiên cứu trước đó [21], [53], Rui Yang và các

cộng sự của mình đã tiến hành nghiên cứu sâu hơn tác động các nhóm hợp chất từ

Trà hoa vàng Camellia nitidissima lên sự sản xuất pyocyanin của Pseudomonas

aeruginosa Được biết rằng pyocyanin là độc tố được tiết ra từ trực khuẩn mủ xanh,

quá trình tổng hợp pyocyanin chủ yếu được kiểm soát bởi quá trình QS (QS: Quorum sensing, là một dạng “ngôn ngữ giao tiếp của vi khuẩn”) Mục tiêu của nghiên cứu

là phát triển những chất ức chế (QSI) có thể làm giảm các yếu tố độc nhưng không

tiêu diệt vi khuẩn, do đó tránh sự kháng kháng sinh Kết quả là các hợp chất của hoa

Camellia nitidissima có thể là chất ức chế đại biểu tiềm năng của P aeruginosa [44]

Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của các loài Trà hoa vàng Vì vậy đây cũng chính là hướng

đi chính của đề tài này

1.3.3 Các tác dụng khác

- Tác dụng chống ung thư: Đây là tác dụng được tập trung nghiên cứu nhiều

năm trở lại đây của các nhà khoa học Nhiều báo cáo đã chứng minh được tác dụng chống ung thư của các loài Trà nói chung và Trà hoa vàng nói riêng, đặc biệt là thành

phần EGCG [15], [31], [36], [56], [59] Nghiên cứu in-vitro cũng đã cho thấy kết quả

có tác dụng ức chế khối u của các flavonoid từ Trà hoa vàng [36] Tuy nhiên, chúng

ta vẫn cần phải nghiên cứu sâu hơn về hoạt động cũng như cơ chế chống ung thư của loài trà này

- Tác dụng hạ đường huyết: Tác dụng này của Trà xanh đã được ghi nhận

trong quyển Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [12] Đối với Trà hoa vàng, Lai Wang và cộng sự đã tiến hành điều tra tác dụng hạ đường huyết của

Camellia chrysantha trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường loại 2 So với nhóm

mẫu, cả ba nhóm chiết xuất C chrysantha gồm: chiết thô, chiết ethyl

acetate/dichloromethane và chiết n-butyl alcohol đều cho tác dụng hạ đường huyết, trong đó chiết xuất ethyl acetate / dichloromethane thể hiện tác dụng hiệu quả nhất [57]

- Tác dụng hạ huyết áp: Cũng như tác dụng hạ đường huyết, tác dụng này

cũng đã được ghi nhận ở nhiều nghiên cứu các loài Trà Tuy nhiên đến nay người ta cũng chưa biết rõ được cơ chế tác dụng của nó Có nhiều giả thuyết cho rằng nhờ vào tác dụng của EGCG trong việc cải thiện chức năng tim mạch mà làm giảm được huyết áp, tuy nhiên thì tác dụng này vẫn cần phải nghiên cứu thêm [40], [56]

1.4.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar disk diffusion assay)

Thử nghiệm khuếch tán đĩa Agar được phát triển vào năm 1940, được sử dụng rộng rãi để thử hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất thực vật mặc dù có nhiều sự hạn chế

Nguyên lý: Hoạt chất có trong chế phẩm thử khuếch tán vào môi trường dinh dưỡng có VSV chỉ thị tại các vùng ức chế tỷ lệ thuận với logarid nồng độ Mẫu thử được cho vào các giếng thạch đã được đục sẵn trong đĩa môi trường nuôi cấy Sau thời gian nuôi cấy thích hợp (18h), đo đường kính vùng ức chế để đánh giá khả năng

ức chế VSV của mẫu nghiên cứu [6], [14], [16], [32], [43]

1.4.2 Phương pháp pha loãng thạch (Agar dilution assay)

Là một phương pháp được các nhà nghiên cứu sử dụng để xác định nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh Đây là phương pháp pha loãng được sử dụng thường xuyên nhất để kiểm tra hiệu quả của kháng sinh mới khi một vài loại kháng sinh được thử nghiệm trên một nhóm lớn các vi khuẩn khác nhau

Nguyên lý: Phương pháp pha loãng thạch bao gồm việc kết hợp các nồng độ khác nhau của chất chống vi trùng vào thạch tan chảy, pha loãng hai lần nối tiếp, sau

đó cấy vào môi trường cấy vi khuẩn xác định trên bề mặt đĩa thạch Điểm cuối MIC được ghi nhận là nồng độ thấp nhất của chất chống vi trùng ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng trong điều kiện ủ thích hợp [14], [32]

1.4.3 Một sô phương pháp khác

1.4.3.1 Phương pháp pha loãng trên 96 đĩa giếng (Broth microdilution)

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để thực hiện thử nghiệm này tại Hoa Kỳ

Nguyên lý: Trong quá trình thử nghiệm, nhiều đĩa microtiter chứa đầy nước dùng gồm Brucella và chất bổ sung máu Nồng độ khác nhau của mẫu thử và vi khuẩn được kiểm tra sau đó được thêm vào đĩa Sau đó, tấm được đặt vào lò ấp không CO2 và được nung nóng ở nhiệt độ 35°C trong 16 đến 20 giờ Sau thời gian quy định, tấm được lấy ra và kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn Nếu nước dùng trở nên đục hoặc một lớp tế bào hình thành ở đáy, thì sự phát triển của vi khuẩn đã xảy ra Các kết quả của phương pháp vi lọc nước dùng được báo cáo nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), hoặc nồng độ kháng sinh thấp nhất đã ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn [16], [32]

1.4.3.2 Phương pháp sinh học tự động (Bioautography)

Năm 1946, Goodall và Levi đã kết hợp phương pháp sắc ký giấy (PC) với phương pháp sinh học tiếp xúc để phát hiện các loại penicillin khác nhau Sau đó, Fischer và Lautner đã giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Kỹ thuật này

kết hợp TLC với cả phương pháp phát hiện sinh học và hóa học Một số nghiên cứu

đã được thực hiện trên sàng lọc các chất chiết xuất hữu cơ, chủ yếu là chiết xuất từ thực vật, cho hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm bằng phương pháp sinh học TLC Phương pháp này bao gồm 3 kỹ thuật: khuếch tán agar, sinh học trực tiếp và xét nghiệm lớp phủ agar [14], [16], [32]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

Thiết bị nghiên cứu đặc điểm thực vật:

- Kính lúp soi nổi Leica EZ4

- Kính hiển vi A Kruss Optronic GmbH

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D + Canon 100mm f2.8 Macro

Thiết bị nghiên cứu tác dụng sinh học:

- Cân phân tích AC ADAPTER

- Bếp cách thủy WiseBath

- Tủ sấy Memmert

- Tủ ấm nuôi cấy VSV

- Tủ an toàn sinh học cấp II

- Nồi hấp tiệt trùng HIRAYAMA HV50

- Máy lắc votex

- Máy ly tâm Centrifuge 5415 R

- Các dụng cụ thủy tinh được rửa, tiệt trùng ở 121ᴼC trong 30 phút trước và sau

khi làm thí nghiệm

- Các dụng cụ khác bằng nhựa và kim loại được tiệt trùng bằng cồn 90ᴼ sau mỗi

lần tiến hành thực nghiệm

2.1.3 Dung môi, hóa chất

- Dung môi: ethanol, DMSO, nước cất, HCl, NaOH

- Hóa chất: cao nấm men, pepton, NaCl, agar, glucose, cao Malt, xanh methylene, đỏ son phèn, acid acetic, nước javen

- Các chủng VSV kiểm định: Bacillus subtilus (ATCC 6633), Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Shigella flexneri

(DT112)

- Kháng sinh đối chứng dương: Penicillin G, Gentamicin, Nystatin (kháng sinh thương phẩm)

2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

2.2.1.1 Phân tích hình thái

Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp

mô tả phân tích [1], [3] Trong nghiên cứu các đặc điểm được mô tả thuộc các nhóm: Dạng sống, thân, lá, hoa (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Đặc điểm mô tả trong nghiên cứu đặc điểm thực vật

1 Dạng sống Dạng sống, chiều cao

2 Thân Hình dạng thân già, bề mặt cành non

3 Lá Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng mép,

số cặp gân chính, kích thước, bề mặt trên, bề mặt dưới

4 Hoa Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, lá bắc, đài (hịnh dạng, bề

mặt), tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (số lượng, hình

dạng, kích thước, liền/rời), bộ nhụy (hình dạng kích thước

lá noãn, vòi nhụy)

2.1.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học

- Đặc điểm vi phẫu: Lá (bánh tẻ) và cành ngâm trong cồn 70°, được làm theophương pháp tiêu bản thực vật thông thường, bao gồm: cắt, tẩy và nhuộm kép Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi Kruss ở các vật kính x4, x10, x40

sử dụng máy ảnh kỹ thuật số Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được

mô tả và phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [1]

- Đặc điểm bột: Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô, nghiền mịn thành bột, rây cho bột có kích thước thích hợp Tiếp theo Bột dược liệu được đặt trên phiến kính có sẵn giọt nước cất, đậy lá kính và quan sát các đặc điểm dưới kính hiển vi Tiến hành chụp ảnh và mô tả các đặc điểm của bột dược liệu [4]

2.1.1.3 Giám định tên khoa học

Tên khoa được xác định dựa trên khóa luận phân loại và mô tả loài trong các tài liệu về thực vật trong và ngoài nước “Cây cỏ Việt Nam” [8], “Các loài trà ở Vườn Quốc Gia Tam Đảo” [9] và “Flora of China” [49]

2.2.2 Nghiên cứu tác dụng sinh học

2.2.2.1 Chuẩn bị dịch chiết:

Lá trà sau khi rửa sạch, sấy khô ở 55°C, xay thành bột dược liệu, rây (355 – 1400) được chiết trong 3 dung môi: H2O, Ethanol 50% và Ethanol 96% Cân chính xác thành 3 phần bột dược liệu, mỗi phần 30 g Thấm ẩm mỗi phần với mỗi dung môi ở trên trong 1h

- Với dung môi là H2O: Thêm dung môi đến 250 ml, đun sôi trong 1h, lọc lấy dịch chiết Tiếp tục chiết lần 2, 3 với thể tích dung môi mỗi lần là 200ml

- Với dung môi là Ethanol 50% và Ethanol 96%: Thêm dung môi đến 250ml, chiết siêu âm trong 30 phút, lọc lấy dịch chiết Tiếp tục chiết lần 2, 3 với thể tích dung môi mỗi lần là 150ml