HÀ THỊ LINH NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học của HOA TRÀ HOA VÀNG (camellia chrysantha (hu) tuyama) ở HUYỆN BA CHẼ , TỈNH QUẢNG NINH KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ hà nội 2020

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Bộ Môn Thực Vật – trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, em đã nhận được nhiều sự hư

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA HOA TRÀ HOA VÀNG

(Camellia chrysantha (Hu) Tuyama)

Ở HUYỆN BA CHẼ , TỈNH QUẢNG NINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LINH

Mã sinh viên: 1501264

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA HOA TRÀ HOA VÀNG

(Camellia chrysantha (Hu) Tuyama)

Ở HUYỆN BA CHẼ , TỈNH QUẢNG NINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Bộ Môn Thực Vật – trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, em đã nhận được nhiều sự hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, anh chị và bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn chân

thành đến: TS Phạm Hà Thanh Tùng, người đã tạo điều kiện, dẫn dắt em đến với

những ngày đầu tham gia nghiên cứu, hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

ThS Vũ Thị Diệp , người đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm, chỉ bảo và tạo

mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn cô PGS.TS Đỗ Thị Hà các anh chị Khoa Hóa Thực

vật – Viện Dược liệu đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất và nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu và các Thầy Cô Bộ môn Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Hà Thị Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại 2

1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.3 Phân bố và sinh thái 2

1.4 Thành phần hóa học 3

1.4.1 Polyphenol 5

1.4.2 Saponin 7

1.4.3 Polysaccharid 7

1.4.4 Acid amin và vitamin 8

1.4.5 Các hợp chất khác 8

1.5 Tác dụng sinh học 9

1.5.1 Tác dụng chống oxy hóa 10

1.5.2 Tác dụng độc tế bào ung thư 10

1.5.3 Tác dụng hạ đường huyết 11

1.5.4 Tác dụng hạ mỡ máu 11

1.5.5 Tác dụng kháng khuẩn 11

1.6 Công dụng 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Nguyên liệu, dụng cụ 12

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị, máy móc 12

2.2.2 Hóa chất, dung môi 13

2.3 Nội dung nghiên cứu 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1 Phương pháp định tính các nhóm chất 13

2.4.2 Phương pháp chiết xuất và phân lập 14

2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hóa học 17

3.1.1 Đinh tính các nhóm chất trong dịch chiết n-hexan 17

3.1.2 Định tính các nhóm chất trong dịch chiết ethanol 17

3.1.3 Định tính các thành phần trong dịch chiết nước 19

3.1.4 Định tính các nhóm chất khác 20

3.2 Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất 22

3.2.1 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 22

3.2.2 Phân lập các hợp chất 25

3.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất 27

3.3 Bàn luận 35

3.3.1 Về kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu 35

3.3.2 Về kết quả chiết xuất, phân lập các chất 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ

13C-NMR Carbon (13) nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt

HDL-C Lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao

IC50 Inhibit Cellular Proliferation by 50% - Nồng độ ức chế 50% sự phát

triển của tế bào

ORAC Oxygen radical absorbance capacity - Khả năng hấp thụ gốc peroxyl

RP Reverse phase chromatography - Sắc ký pha đảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng các thành phần hóa học trong hoa và lá loài C chrysantha 3

Bảng 1.2 Các hợp chất đã được phân lập từ loài C chrysantha 4

Bảng 1.3 Thành phần và hàm lượng của các acid amin tự do trong C chrysantha 8

Bảng 3.1 Phản ứng định tính các nhóm chất hoá học trong hoa C chrysantha 21

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của CC2 và (-)-epicatechin 28

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của CC3 và quercetin-7-O-β-ᴅ-glucopyranosid 32

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Cấu trúc các hợp chất flavonoid phân lập từ loài C chrysantha 6

Hình 1.2 Cấu trúc các hợp chất tanin và dẫn chất polyphenol đơn giản phân

lập từ loài C chrysantha

7

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất khác phân lập trong loài C chrysantha 9

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp chiết xuất và phân lập các chất 15

Hình 3.1 Sơ đồ chiết cao EtOH 70% và các cao phân đoạn từ hoa C

chrysantha

24

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất CC2 và CC3 từ phân đoạn EtOH 50% 26

Hình 0.3 Sắc ký đồ của các hợp chất phân lập từ cao EtOH 50% của hoa C

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm gần đây, vấn đề chống oxy hóa, chống lão hóa và chống ung thư đang

là đề tài nóng được rất nhiều người quan tâm Một trong những xu hướng đầu đó là các sản phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thiên nhiên, các loại thảo dược có lợi cho

sức khỏe, tiêu biểu là các loại trà hoa vàng thuộc chi Camellia L

Bên cạnh các loài trà thông thường khác thuộc chi Camellia L., với màu hoa giới

hạn trong đỏ, tím, hồng và trắng, thì nhóm Trà hoa vàng đã được xác định là có giá trị sinh học cao và đang được quan tâm nghiên cứu Việt Nam đã trở thành một trong những trung tâm đa dạng sinh học lớn của Trà hoa vàng với hơn 40 loài đã được công bố[4]

Loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1965 bởi

Hu và đã được chuyển đến chi Camellia L bởi Tuyama (1975) và sử dụng cái tên

Camellia chrysantha (Hu) Tuyama đến nay Loài này hiện được phát hiện tại nhiều nơi

ở Việt Nam như Quảng Ninh, Nghệ An, Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Đà Lạt, Tuyên Quang, Ba Vì, Hà Nội, Đồng Nai [4]

Theo các nghiên cứu đã công bố, dịch chiết từ loài C chrysantha cũng có rất nhiều

tác dụng tương tự như nhóm trà xanh thông thường như chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn… Nghiên cứu về thành phần loài này, xác định được các nhóm chất chủ yếu là các polyphenol, saponin, polysaccharid,… [18], [39]

Để hiểu rõ hơn về từng thành phần trong loài C chrysantha, hướng tới đặt cơ sở

cho việc sàng lọc và lựa chọn các chất đánh dấu (marker) phù hợp, tiến tới chuẩn hóa

dược liệu cho loài C chrysantha, chúng ta cần tiếp tục tiến hành tách chiết và xác định

cấu trúc các thành phần hóa học, đặc biệt là những thành phần có hàm lượng nhiều nhất

trong hoa loài C chrysantha, tạo tiền đề để tiếp tục nghiên cứu thêm về tác dụng, hoạt

tính sinh học của các hợp chất này

Vì vậy, giúp góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của của C chrysantha, đề

tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của hoa Trà hoa vàng (C chrysantha (Hu)

Tuyama) ở huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh” được thực hiện với 2 mục tiêu:

- Định tính các thành phần hóa học của hoa Trà hoa vàng

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ hoa của Trà hoa vàng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại

Trà hoa vàng hay còn gọi là Kim hoa trà, có tên khoa học là Camellia chrysantha

(Hu) Tuyama, được xếp trong Hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009) [37] như sau:

Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp: Sổ (Dillenniidae) Bộ: Trà (Theales) Họ: Trà (Theaceae)

Chi: Trà (Camellia) Loài C chrysantha (Hu) Tuyama

Tên Việt Nam: Trà hoa vàng

1.2 Đặc điểm thực vật

C chrysantha là loài có thân gỗ nhỏ, chồi và cành non có lông mịn thưa, cành già

màu nâu, nhẵn Lá bao chồi 5- 9, thường là 6, hình elip, lớn dần từ dưới lên, mặt ngoài màu hồng nhạt; mặt trong màu hồng nhạt hơn, nhẵn, mép nguyên Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm Cuống lá tương đối ngắn, dài khoảng 0,6 - 0,7 cm, lõm ở mặt trên Phiến lá (bánh tẻ) hình elip, cứng và dày, dai, dài 11 cm, rộng 5 cm, mặt trên màu xanh thẫm, nhẵn bóng, mặt dưới màu xanh nhạt, nhẵn, thường có nhiều điểm tuyến màu đen; gốc lá hình nêm; mép lá có khía răng cưa, khía răng nông nhỏ, ngọn lá nhọn, có mũi dài 0,4 – 0,5cm gân giữa lộ rõ, lõm sâu ở mặt trên, nổi rõ ở mặt dưới, có 10 - 12 cặp gân bên [2], [3], [5]

Hoa đều, lưỡng tính, mọc đơn độc ở đầu cành hoặc nách lá, màu vàng, đường kính khi nở khoảng 3 cm Cuống hoa rất ngắn, gần như không thấy Lá bắc 6 - 10, có dạng hình móng, xếp thành 2 dãy, phủ lên nhau, lớn dần từ dưới lên trên, kích thước 0,3 – 1,4

cm, mặt ngoài và mặt trong có lông trắng mịn Cánh hoa 10-20, các cánh phía trong dính với nhau và dính vào vòng bộ nhị dài khoảng 2,4 cm, không có lông, chỉ nhị màu vàng, mang bao phấn 2 ô Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu trên 3 ô, có dạng hình cầu, màu xanh nhạt, nhẵn; vòi nhụy 3, rời, màu vàng [2], [3], [5]

1.3 Phân bố và sinh thái

Theo Sách Đỏ IUCN (The IUCN Red List of Threatened Species), loài C

chrysantha được tìm thấy ở tỉnh Quảng Tây, phía Tây Nam của Trung Quốc, mở rộng

tới Việt Nam [41], [50]

Ở Việt Nam, loài C chrysantha được tìm thấy ở Quảng Ninh, Nghệ An, Tam Đảo,

Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Đà Lạt, Tuyên Quang, Ba Vì, Hà Nội, Đồng Nai [4]

C chrysantha thường mọc ở trong các khu rừng ẩm ướt cao dưới 500 m [50] Ở

Trung Quốc, nó xuất hiện ở những cánh rừng rậm ẩm ướt và dọc theo sườn suối và núi

từ 50 - 500 m Đất chủ yếu là đá sa thạch và đá phiến Cây phù hợp với môi trường sống

có bóng râm với độ ẩm tương đối cao (78 - 83%) nhưng có thể chịu được ánh sáng mặt trời [49]

1.4 Thành phần hóa học

Các hợp chất đã được xác định trong loài C chrysantha được phân lập chủ yếu

trên lá và hoa của loài này Theo nhiều tài liệu được báo cáo, các nhóm chất có mặt trong

loài C chrysantha là các polysaccharid, polyphenol, flavonoid, saponin [18], [39]

Ngoài ra, kẽm hữu cơ tự nhiên, selen, molypden, gecmani, mangan, vanadi và các nguyên tố vi lượng khác, các acid amin thiết yếu và vitamin đã được báo cáo là có trong

loài C chrysantha [11], [39], [48]

Theo báo cáo của Lin và cộng sự (2010), hàm lượng các thành phần hóa học đã

được xác định trong hoa và lá của C chrysantha được phân tích ở Bảng 1.1 Theo nghiên

cứu này, hàm lượng tổng flavonoid, polyphenol, và saponin trong hoa tương ứng gấp

37; 2,1; và 1,4 lần so với lá của C chrysantha [18] Hàm lượng thành phần hóa học

trong hoa là khác biệt đáng kể so với lá, cho thấy hoa có giá trị khai thác và sử dụng

Bảng 1.1 Hàm lượng các thành phần hóa học trong hoa và lá loài C chrysantha

Bên cạnh đó, các báo cáo trước đó cũng chỉ ra rằng không phát hiện thấy caffein

trong lá và hoa của C chrysantha [23], [35] Điều này cho thấy sự khác biệt lớn của loài

C chrysantha nói riêng, và các loài trà hoa vàng nói chung đối với nhóm trà xanh thông

thường Đó cũng là cơ sở dùng lá và hoa của trà hoa vàng thay thế cho trà khử caffein hiện tại để có thể tránh được một số tác dụng phụ không mong muốn mà caffein tạo ra bên cạnh hàm lượng chất chống oxy hóa và lợi ích sức khỏe của chúng

Các hợp chất đã phân lập được từ loài C chrysantha được trình bày ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Các hợp chất đã được phân lập từ loài C chrysantha

Cấu trúc các flavonoid (chủ yếu là flavon), tanin và dẫn chất polyphenol đơn giản

đã được phân lập từ loài C chrysantha được trình bày ở Hình 1.1 và Hình 2.1

Hình 1.1 Cấu trúc các hợp chất flavonoid phân lập từ loài C chrysantha

Hình 1.1 Cấu trúc các hợp chất tanin và dẫn chất polyphenol đơn giản phân lập từ

loài C chrysantha

1.4.2 Saponin

Saponin là thành phần được báo cáo là có hàm lượng khá cao trong lá của loài C

chrysantha Theo báo cáo của Zeng và cộng sự, sau khi tinh chế sơ bộ, nồng độ saponin

và polyphenol trong trà là 23,79 mg/mL và 3,42 mg/mL, cho thấy nồng độ saponin gấp khoảng 7 lần so với polyphenol trong lá của của Trà hoa vàng [46] Tuy nhiên đến thời

điểm hiện tại, chưa có saponin nào được công bố là phân lập từ loài C chrysantha

1.4.3 Polysaccharid

Theo Lin và cộng sự, một polysaccharid tinh khiết đã được phân lập có tên là

tính cao gấp 2 lần acid galacturonic (galA) Tỷ lệ của rha, ala và gal là 1: 4.2: 3.0: 0.4 Ngoài ra, 62,58% GalAs là dạng của metyl este Quá trình thủy phân một phần acid cho thấy khoảng 73% carbohydrat trung tính được giải phóng vào dung dịch TFA 0,01 mol/L, bao gồm glucan, alabinan và galactan Trong khi đó, 5% carbohydrat trung tính được giải phóng vào dung dịch TFA 0,05 mol/L, bao gồm các oligosacarid là chuỗi nhánh bao gồm Ala Ngoài ra, 13% carbohydrat trung tính được giải phóng vào dung dịch TFA 0,5 mol/L, được tạo thành từ oligosaccharid như chuỗi nhánh bao gồm Ala,

có hai vùng như vùng trơn với acid polygalacturonic methyl ester hóa và vùng có lông chứa ba mảnh với các đặc điểm cấu trúc hóa học khác nhau, bao gồm glucan, alabinan

và galactan [19]

1.4.4 Acid amin và vitamin

Tổng số acid amin tự do trong hoa C chrysantha là 80,8 mg/100 g và prolin là

acid amin có hàm lượng cao nhất trong tổng số acid amin tự do, chiếm 38,7% tổng số acid amin tự do Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra hàm lượng hai vitamin chính trong

và 520 mg/100g [18]

Bảng 1.3 Thành phần và hàm lượng của các acid amin tự do trong hoa C chrysantha

Năm 2011, Peng và cộng sự tìm thấy trong hoa của C chrysantha hai hợp chất

nhóm phytosterol được là daucosterol và β-sitosterol [28]

Năm 2012, Zou và cộng sự bằng phương pháp phân tích sắc ký khí đã xác định

trong tinh dầu của lá loài C chrysantha có chứa 61 hợp chất [48] Trong đó, thành phần

chiếm tỷ lệ cao nhất là 2-(oxo-18 alkyl) ethanol, 2-pentadecan, 1-iodo-hexadecan, [48]

Một diarylheptanoid là platyphyllosid đã được phân lập trong lá của C chrysantha

[35] Đây là một loại hợp chất không phổ biến, không có trong lá trà xanh thông thường Ngoài ra, một carotenoid là neoxanthin đã được phát hiện trong hoa của loài này

là yếu tố góp phần tạo ra sắc tố cho hoa trà hoa vàng [32]

Cấu trúc các hợp chất khác phân lập trong loài C chrysantha được trình bày ở

1.5.1 Tác dụng chống oxy hóa

Có rất nhiều nghiên cứu đã khẳng định tác dụngchống oxy hóa của loài C

chrysantha là nhờ vào hoạt tính của các hợp chất polyphenol [11] Theo nghiên cứu của

595,0 ± 14,4 µmol TE/g Trong khi đó, theo các báo cáo trước đây, trà xanh thường có giá trị ORAC là 700 - 1600 µmol TE/g [35]

Nghiên cứu của Song tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol

trong 6 mẫu trà hoa vàng thu hái ở Trung Quốc, trong đó có loài C chrysantha, theo mô

hình DPPH, được phân tích bằng phương pháp HPLC.Kết quả cho thấy phản ứng rõ rệt giữa các thành phần chống oxy hóa trong các mẫu với DPPH thể hiện rõ khi mà các đỉnh tương ứng tồn tại trong sắc ký đồ ban đầu của các chiết xuất ban đầu biến mất sau khi thêm DPPH [35] Đồng thời, báo cáo cũng chỉ ra sự có mặt của các chất chống oxy hóa

6-C-pentosyl-8-C-hexosyl apigenin (14), ellagitannin (17), proanthocyanidin dimer (18) [35]

Jin và cộng sự tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa của lá C chrysantha

dựa vào hoạt động quét gốc DPPH của các chất đã được phân lập từ lá của loài này Trong số 6 chất đã được xác định là catechin (15), epicatechin (16), vitexin

(7), isovitexin (8) , quercetin-7- O - β -ᴅ-glucopyranoside (2) và kaempferol (9) Tác

dụng dọn gốc DPPH được tìm thấy là 2 > 15 > 16 > 9 > 7 > 8 [40].

1.5.2 Tác dụng độc tế bào ung thư

Nghiên cứu của Dai và cộng sự chỉ ra rằng dịch chiết lá của C chrysantha có tác

dụng ức chế sự phát triển của tế bào Eca109 phụ thuộc vào liều lượng - thời gian và gây

ra hiện tượng apoptosis trong các tế bào ung thư Eca109 [12]

Trên mô hình in vivo ngắn hạn về ung thư gan chuột gây ra bởi DEN (diethylnitrosamine), xác định được dịch chiết lá C chrysantha với nồng độ 5% có tác

dụng ức chế DEN trên gan chuột ung thư Từ đó tạo tiềm năng thử tác dụng ức chế ung

thư của chiết xuất dung dịch C chrysantha trên dòng tế bào ung thư gan người BEL

[38]

Nghiên cứu của Shi và cộng sự cũng chỉ ra rằng dịch chiết ethanol (EtOH), phân

đoạn n-butanol từ cao chiết EtOH và phân đoạn nước từ cao chiết EtOH của hạt loài C

chrysantha có khả năng ức chế sự tăng sinh của hai dòng tế bào ung thư phổi A549 và

tế bào ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 tương ứng là 95,2, 99,06, 107,72 g/ml; 215,7,

200,35, 203,24 g/ml, tác dụng phụ thuộc liều Kết quả này cho thấy phân đoạn n-butanol

và phân đoạn nước từ cao EtOH của hạt C chrysantha là các phân đoạn có tác dụng độc

tế bào ung thư A549 tốt nhất [34]

1.5.3 Tác dụng hạ đường huyết

Để nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của lá C chrysantha trên chuột bị mắc đái tháo đường typ II, Wang và cộng sự đã đánh giá tác dụng hạ đường huyết của 3 phân

đoạn chiết ethyl acetat/dichloromethan, n-butanol và dịch chiết thô của lá C chrysantha

Kết quả cho thấy phân đoạn chiết ethyl acetat/dichloromethan có tác dụng hạ đường huyết hiệu quả nhất nhưng không có tác dụng đối với thử nghiệm dung nạp glucose

đường uống của chuột mắc bệnh tiểu đường [39]

1.5.4 Tác dụng hạ mỡ máu

Năm 2004, Ning và cộng sự báo cáo tác dụng của dịch chiết nước từ lá C

chrysantha trong điều hòa lipid máu là tương đương với Lovastatin Báo cáo cũng chỉ

ra liều cao và liều trung bình của dịch chiết nước từ lá C chrysantha có tác dụng làm

giảm TC, TG, LDL-C ở nhóm chuột bị tăng lipid máu Kết quả ở nhóm được điều trị có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng [26] Kết quả này là tương đồng với kết quả của Lu và cộng sự (năm 2012) khi chỉ ra có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê trên giá trị TC, TG, LDL-C và HDL-C của nhóm chuột được dung nạp liều cao dịch

chiết nước lá loài C chrysantha với nhóm chứng và cả nhóm chuột dung nạp liều thấp dịch chiết nước lá C chrysantha [20]

1.5.5 Tác dụng kháng khuẩn

Nghiên cứu của Trường Cao đẳng Y học cổ truyền Quảng Tây trên thí nghiệm

kháng khuẩn của dịch chiết lá C chrysantha, cho thấy hiệu quả chống Staphylococcus

albicans, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus B và trực khuẩn

bạch hầu có hiệu quả [11]

1.6 Công dụng

Các bộ phận trên loài C chrysantha đều có thể được sử dụng Lá của loài này được

biết đến là một loại thuốc truyền thống của người Zhuang ở tỉnh Quảng Tây (Trung Quốc), có thể dùng để pha trà hoặc nấu chín để ăn Hoa của nó dùng để làm thuốc nhuộm

và điều trị đi ngoài ra máu và kinh nguyệt không đều Hơn nữa, loài này cũng được sử dụng trong điều trị viêm họng, viêm thận, viêm gan, phòng ngừa khối u, tăng huyết áp, kiết lỵ, tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu [39], [48]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là hoa của cây Trà hoa vàng C chrysantha thu hái ở huyện

Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh vào tháng 10/2019 Mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội Mã số tiêu bản: HNIP/18156/16

Mẫu thực vật được giám định bởi PGS.TS Trần Văn Ơn Kết quả cho thấy mẫu

dược liệu có tên khoa học là Camellia chrysantha (Hu) Tyuama), thuộc chi Camellia L.,

họ Chè – Theaceae

Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu hoa C chrysantha

2.2 Nguyên liệu, dụng cụ

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị, máy móc

+ Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

+ Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, phễu lọc, giấy lọc,

+ Máy cô cách thủy GLF

+ Cân kỹ thuật Precisa BJ 610, cân phân tích Precisa 262SMA- FR

+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm và 366 nm

+ Nhựa macroporous D101 dùng trong sắc ký trao đổi ion

+ Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck), (0,040 – 0,063 mm, Merck) Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm) + Sắc ký cột: các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Phổ khối được đo trên máy đo phổ khối lượng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap, tại Viện Dược liệu

+ Góc quay cực được đo trên máy đo độ phân cực MCP100 ANTON PAAR , tại Viện Dược liệu

2.2.2 Hóa chất, dung môi

+ Hóa chất dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học: n-hexan, EtOH 96%, acid sulfuric, acid formic, acid chlohydric, anhydrid acetic, chloroform, NaOH 10%, KOH 10%, NH4OH 6N, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 10%, chì acetat 30%, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha, TT Legal, TT Lugol, TT Baljet, TT natri nitroprussiat 1%, TT ninhydrin 3%, TT Fehling A, TT Fehling B, tinh thể natri carbonat, bột magie kim loại,

+ Dung môi, hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập: EtOH 96%, n-hexan, ethyl

acetat (EA), methanol (MeOH), dicloromethan (DCM), aceton, nước… đạt tiêu chuẩn tinh khiết

+ Thuốc thử hiện màu dùng trong chiết xuất và phân lâp: dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96%, dung dịch acid boric/acid oxalic

2.3 Nội dung nghiên cứu

+ Định tính các nhóm chất trong hoa C chrysantha bằng các phản ứng hóa học + Chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ hoa C chrysantha

+ Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ phân đoạn EtOH 50%

từ hoa C chrysantha

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp định tính các nhóm chất

Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong hoa trà hoa vàng C chrysantha: tiến hành

định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo tài liệu tham khảo [1]

2.4.2 Phương pháp chiết xuất và phân lập

2.4.2.1 Phương pháp chiết xuất

Dược liệu được xay thô và tiến hành chiết xuất với các điều kiện sau:

+ Phương pháp chiết: Chiết siêu âm

+ Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng

+ Dung môi: EtOH 70%

+ Số lần chiết: 3 lần

+ Thời gian chiết: 45 phút/ lần

Lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng EtOH 70%

Lưu một phần cao tổng, sau đó phân tán trong nước và tạo các phân đoạn hóa học bằng nhựa macroporous D101 lần lượt với các dung môi nước, EtOH 50% và EtOH 90% Các phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn tương ứng

+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng chất đưa lên cột, rửa sạch, tráng cột bằng aceton, để khô, cố định trên giá theo phương thẳng đứng Cho một lớp bông vào đáy cột

+ Nhồi cột: Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải phù hợp, khuấy đều cho đến khi hết bọt thu được hỗn dịch Cho hỗn dịch vào cột

đã chuẩn bị Mở khóa cột, rót tiếp dung môi để cột hết bọt khí và ổn định Giữ lại 1 ít dung môi để cột không bị khô trước khi khóa cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột

+ Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến khi tan hoàn toàn, sau đó trộn đều với một lượng silica gel (tối thiểu); loại dung môi đến khi thu

được bột khô và tơi hoặc có thể dùng chày sứ nghiền thành bột mịn

+ Nạp mẫu: Đưa từ từ mẫu lên cột tránh vón thành cục và xuất hiện nhiều bọt khí Sau khi nạp mẫu xong, thêm một lớp bông hoặc cho một lượng nhỏ silica gel lên cột để tránh xáo trộn lớp bề mặt khi tiếp dung môi

+ Rửa giải: Cho hệ dung môi rửa giải thích hợp vào cột đã được nạp mẫu Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô

+ Thu dịch: Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm với thể tích phù hợp

Theo dõi các phân đoạn bằng TLC pha thường và pha đảo

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại hoặc dùng TT, sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện màu

Kiểm tra độ tinh khiết của chất bằng TLC và NMR

Phương pháp chiết xuất và phân lập các chất từ hoa C chrysantha được thể hiện

Phân lập bằng sắc ký

Phân lập 1- 2 hợp chất phân đoạn tiềm năng

Xác định cấu trúc hợp chất

2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các tính chất lý hóa (cảm quan, độ tan), góc quay cực, các dữ liệu phổ (phổ cộng hưởng từ hạt nhân NRM (1H, 13C, DEPT ), phổ khối (ESI-MS)), kết hợp so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp bằng phản ứng hóa học

3.1.1 Đinh tính các nhóm chất trong dịch chiết n-hexan

Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón, chiết hồi lưu bằng n-hexan Dịch

chiết đem cất thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu, phytosterol và carotenoid

3.1.1.1 Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết n-hexan trên giấy lọc, hơ khô giấy phản ứng dương tính

nếu để lại vết mờ trên giấy

Kết quả: không xuất hiện vết mờ trên giấy

Kết luận: dược liệu không có chất béo

3.1.1.2 Định tính carotenoid

Cô 5 ml dịch chiết tới cắn Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh ve

Kết quả: xuất hiện màu xanh ve

Kết luận: dược liệu có carotenoid

3.1.1.3 Định tính phytosterol

Cô 1 ml dịch chiết tới khô Cho vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm

1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu nếu xuất hiện vòng màu tím đỏ giữa 2 lớp chất lỏng, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh

Kết quả: xuất hiện vòng màu tím đỏ đỏ giữa 2 lớp chất lỏng, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh

Kết luận: dược liệu có phytosterol

3.1.2 Định tính các nhóm chất trong dịch chiết ethanol

Bã dược liệu sau khi chiết bằng n-hexan để bay hơi dung môi đến khô Chiết hồi

lưu với EtOH 90% trong 30 phút Dịch chiết được lọc và cô còn 10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, saponin, acid hữu cơ, acid amin

3.1.2.1 Định tính saponin

+ Phản ứng tạo bọt: Cho 0,5 g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm vào đó 5 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm 5 ml nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút

Kết quả: xuất hiện bọt bền sau 10 phút

+ Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml EtOH 90% đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn Hòa tan cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách

Kết quả: xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách

Kết luận: dược liệu có saponin

3.1.2.2 Định tính coumarin

+ Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nhiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết EtOH, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun cả 2 ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút Ống thứ nhất có màu vàng xuất hiện Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ hai, nhưng sau khi acid hóa thì cả 2 ống đều đục như nhau (Phản ứng dương tính)

Kết quả: ống 1 và ống 2 không đục như nhau

+ Phản ứng với TT diazo: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết EtOH, thêm vào

đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt TT diazo mới pha Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa màu đỏ gạch

Kết quả: không xuất hiện tủa đỏ gạch

Kết luận: dược liệu không chứa coumarin

3.1.2.3 Định tính flavonoid

+ Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt acid hydrochloric đặc, đun nóng cách thủy Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu tím đỏ

Kết quả: xuất hiện màu tím đỏ

+ Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2 ml dịch chiết EtOH vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu dung dịch có màu xanh thẫm Kết quả: dung dịch thu được có màu xanh thẫm

+ Phản ứng với kiềm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính nếu màu vàng của dung dịch tăng thêm

Kết quả: ống thử có màu vàng hơn ống chứng

Kết luận: dược liệu có chứa flavonoid

3.1.2.4 Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết EtOH và cô tới cắn Hòa cắn trong 1 ml nước

và thêm vài tinh thể natri carbonat Phản ứng dương tính nếu có bọt khí nổi lên

Kêt quả: không có bọt khí nổi lên

Kết luận: không có acid hữu cơ

3.1.2.5 Định tính acid amin

Lấy 3 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm 1-3 ml ninhydrin, đun sôi 2 phút Phản ứng dương tính nếu dung dịch chuyển màu tím

Kết quả: dung dịch chuyển màu tím

Kết luận: dược liệu có chứa acid amin

3.1.3 Định tính các thành phần trong dịch chiết nước

Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 30 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

+ Ống 1: xuất hiện tủa xanh đen

+ Ống 2: xuất hiện tủa bông

+ Ống 3: xuất hiện tủa bông trắng

Kết luận: dược liệu có chứa tanin

3.1.3.2 Định tính đường khử tự do

Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm Thêm vào đó 0,5 ml TT Fehling A

và 0,5 ml TT Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch

Kết quả: xuất hiện màu đỏ gạch

Kết luận: dược liệu có chứa đường khử tự do

3.1.3.3 Đinh tính polysaccharid

Cho vào 2 ống nghiệm:

+ Ống 1: 4 ml nước cất + 5 giọt TT Lugol

+ Ống 2: 4 ml dịch chiết nước + 5 giọt TT Lugol

Quan sát màu ống 2 đậm hơn ống 1 thì phản ứng dương tính

Kết quả: ống 2 đậm màu hơn ống 1

Kết luận: dược liệu có chứa polysaccharid

3.1.4 Định tính các nhóm chất khác

3.1.4.1 Định tính alcaloid

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch

H2SO4 2% đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng DCM 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết DCM được gộp lại và lắc với H2SO4 2 % Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml để làm các phản ứng sau:

+ Ống 1: Phản ứng với TT Mayer Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt

+ Ống 2: Phản ứng với TT Bouchardat Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa màu nâu

+ Ống 3: Phản ứng với TT Dragendorff Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa vàng cam hoặc đỏ

Kết quả:

+ Ống 1: không xuất hiện tủa

+ Ống 2: không xuất hiện tủa

+ Ống 3: không xuất hiện tủa

Kết luận: dược liệu không chứa alcaloid

3.1.4.2 Định tính anthranoid

Cho vào ống nghiệm 5 g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml DCM Lấy 1 ml dịch DCM cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10% Phản ứng dương tính nếu màu của dung dịch KOH chuyển màu đỏ

Kết quả: màu của dung dịch không chuyển đỏ

Kết luận: dược liệu không chứa anthranoid

3.1.4.3 Định tính glycosid tim

Lấy 10 g bột dược liệu loại tạp bằng n- hexan Thêm 100 ml EtOH 25% rồi ngâm trong 24 h Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3 ml chì acetat 15% khuấy đều Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1 ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với chloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml, gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi đến khô Cắn còn lại để làm các phản ứng:

+ Phản ứng Liebermann-Bouchard: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 1 ml anhydrid acetic, lắc đều Nghiêng ống 45o cho từ từ theo thành ống 1 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Quan sát nếu mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá thì phản ứng dương tính

+ Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1 ml EtOH 90%, lắc đều, nhỏ từng giọt TT Baljet mới pha Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ cam

+ Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong 0,5 ml EtOH 90%, lắc kỹ Nhỏ 1 giọt TT natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ cam

Kết quả:

+ Phản ứng Liebermann- Bouchard: không nhìn thấy vòng màu tím đỏ giữa 2 lớp chất lỏng

+ Phản ứng Baljet: không xuất hiện màu đỏ cam

+ Phản ứng Legal: không xuất hiện màu đỏ cam

Kết luận: Dược liệu không chứa glycosid tim

Kết quả các phản ứng định tính của Trà hoa vàng được tóm tắt trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Phản ứng định tính các nhóm chất hoá học trong hoa C chrysantha

Phản ứng với dung dịch gelatin 1% ++

9 Đường khử Phản ứng với TT Fehling A và

Chú thích:

3.2 Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất

3.2.1 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

Hoa trà hoa vàng đã được sấy đông khô (89 g), xay thô, và chiết siêu âm ở nhiệt

độ phòng với EtOH 70% (45 phút/lần x 3 lần), tỉ lệ dung môi/dược liệu là 10:1 (ml/g) Lọc và gộp dịch chiết, cất loại bỏ dung môi thu được cao EtOH 70% (CCE, 20,86g) Cao EtOH 70% hòa tan trong nước rồi hấp phụ lên cột nhựa D101, sau đó giải hấp phụ lần lượt qua các dung môi: nước, EtOH 50%, EtOH 90% Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được các phân đoạn tương ứng là phân đoạn nước

(-): phản ứng âm tính (+): phản ứng dương tính (++): phản ứng dương tính (+++): phản ứng dương tính rất rõ

(CCW, 7,04g), phân đoạn EtOH 50% (CC50, 9,32g), phân đoạn EtOH 90% (CC90, 0,72g)

Quy trình chiết xuất cao EtOH 70% và các cao phân đoạn được thể hiện ở Hình

3.1

Cất thu hồi dung môi

Cao phân đoạn nước

(7,04 g)

Phân đoạn EtOH

Phân đoạn EtOH 90%

Nhựa rửa giải qua EtOH 90%

Cao phân đoạn EtOH 50%

(9,32 g)

Cất thu hồi dung môi

Cất thu hồi dung môi

Cao phân đoạn EtOH 90%

(0,72 g)

Giải hấp phụ bằng nước

Giải hấp phụ bằng EtOH 50%

Giải hấp phụ bằng EtOH 90%

Hình 3.1 Sơ đồ chiết cao EtOH 70% và các cao phân đoạn từ hoa C chrysantha