LÃ THỊ THAO NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và tác DỤNG KHÁNG VI SINH vật của cây TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA SP ) THU hái tại HUYỆN yên THẾ, TỈNH bắc GIANG KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ hà nội – 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÃ THỊ THAO MÃ SINH VIÊN: 1501452 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA SP.. Từ thực tế đó, đề t

CỦA CÂY TRÀ HOA VÀNG

(CAMELLIA SP.) THU HÁI TẠI

HUYỆN YÊN THẾ, TỈNH BẮC GIANG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÃ THỊ THAO

MÃ SINH VIÊN: 1501452 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY TRÀ HOA VÀNG

(CAMELLIA SP.) THU HÁI TẠI

HUYỆN YÊN THẾ, TỈNH BẮC GIANG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS TS Trần Văn Ơn - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội và ThS Lê Thiên Kim - người thầy đã truyền cho tôi tình yêu khoa học, dìu dắt tôi từ những

ngày đầu làm nghiên cứu khoa học, cũng là người trực tiếp hướng dẫn và tận tình

chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

- TS Hoàng Quỳnh Hoa, ThS Phạm Thị Linh Giang - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp

đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn mà tôi gặp phải trong quá trình thực hiện khóa luận

- Các thầy cô giáo và các chị kĩ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn giúp

đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực nghiệm

- TS Đỗ Ngọc Quang - Bộ môn Vi sinh & Sinh học, đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

- Ban Giám Hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tại đây

- Các bạn sinh viên khóa 70 cùng nghiên cứu và làm đề tài ở bộ môn Thực Vật đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn

Cuối cùng, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020 Sinh viên

Lã Thị Thao

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Camellia L 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Camellia L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Camellia L 2

1.1.3 Phân bố 2

1.1.4 Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam 6

1.1.5 Thành phần hóa học 7

1.1.6 Tác dụng sinh học 9

1.1.7 Gíá trị kinh tế của Trà hoa vàng 11

1.2 Trà hoa vàng tại Bắc Giang 12

1.3 Tình trạng kháng kháng sinh và các nghiên cứu từ thực vật 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Thiết bị 14

2.1.3 Dung môi, hóa chất 15

2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 15

2.2.2 Nghiên cứu tác dụng kháng VSV 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Kết quả nghiên cứu 21

3.1.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật 21

3.1.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng VSV 26

3.2 Bàn luận 29

3.2.1 Về thực vật 29

3.2.2 Về tác dụng sinh học 32

KẾT LUẬN 35

ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

DPPH 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate

ECDC European Centers for Disease Control

EGCG Epigalo catechin gallat

ESBL Men beta-lactamase phổ rộng

HBe Ag Hepatitis B envelope Antigen

HBs Ag Hepatitis B surface Antigen

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số chất có trong Camellia L 8

Hình 3.1 Hình thái mẫu nghiên cứu 22

Hình 3.2 Vi phẫu lá mẫu nghiên cứu 24

Hình 3.3 Vi phẫu thân mẫu nghiên cứu 25

Hình 3.4 Bột lá mẫu nghiên cứu……….………25

Hình 3.5 Một số đặc điểm của bột lá mẫu nghiên cứu 26

Hình 3.6 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng VSV 28

Hình 3.7 Bột lá Trà hoa vàng Bắc Giang và Trà hoa vàng Quảng Ninh 32

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân bố một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam 3

Bảng 2.1 Đặc điểm mô tả trong nghiên cứu đặc điểm thực vật 16

Bảng 2.2 Khối lượng cắn thu được của mẫu nghiên cứu 17

Bảng 2.3 Chủng VSV và đối chứng dương được sử dụng 19

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế đối với 6 VSV 27

Bảng 3.2 Một số đặc điểm khác nhau giữa CA37 và Trà hoa vàng Quảng Ninh, Lạng Sơn 29

Ở Việt Nam, Trà hoa vàng lần đầu tiên được phát hiện ở miền Bắc vào năm 1910, nhưng chưa được nghiên cứu nhiều [12] Đến những năm gần đây, Trà hoa vàng mới được quan tâm nghiên cứu và khai thác để sử dụng Cho đến nay

đã có trên 40 loài Camellia L có hoa màu vàng được ghi nhận Trong chi Camellia

L có rất nhiều loài có hoạt tính sinh học đáng quan tâm như tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống ung thư, tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus,v.v [18], [23], [43], [46] Việc phát triển Trà Hoa Vàng ở Việt Nam đã thu hút nhiều nhà khoa học nghiên cứu, chủ yếu tập trung vào đa dạng sinh học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học Tuy nhiên, việc nghiên cứu Trà Hoa Vàng mới chỉ tập trung vào một số vùng như Ba Chẽ (Quảng Ninh), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), v.v [13], [14] , [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [36], [41], [43], [44], [45], [51], [55] Tại huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang, chúng tôi phát hiện một loài Trà hoa vàng có một số đặc điểm khác biệt với Trà hoa vàng Quảng Ninh, đặc biệt là màu sắc sau chế biến Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về loài Trà hoa vàng này ở huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang Hiện tại, ở Bắc Giang chưa phát hiện các loài Trà hoa vàng đã được ghi nhận ở Quảng Ninh trước đó

Từ thực tế đó, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, tác dụng kháng vi

sinh vật của cây Trà hoa vàng (Camellia sp.) thu hái tại huyện Yên Thế, tỉnh

Bắc Giang” được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm vi học của cây Trà hoa vàng Bắc Giang

- Nghiên cứu tác dụng kháng vi sinh vật của lá Trà hoa vàng thu tại Bắc Giang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Camellia L

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Camellia L

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [17], chi Trà hoa

vàng (Camellia L.) có vị trí phân loại như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Camellia L

Theo các tài liệu của Võ Văn Chi [5], Trần Ninh [12] chi Camellia L có

đặc điểm:

Cây bụi hoặc cây nhỏ, thường xanh, cành nhẵn hay có lông Lá thường có cuống, đơn, mọc so le, không có lá kèm, chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuôi, gốc lá hình nêm hẹp hoặc nêm rộng, tròn hay hình tim, mép có răng cưa nhọn hoặc tù Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc hoặc tập trung 2 - 5 hoa ở nách lá hoặc đầu cành Hoa màu đỏ, trắng hoặc vàng Cuống hoa ngắn hoặc gần như không Lá bắc 2 - 10, mọc xoắn trên cuống hoa Cánh hoa 4 - 19, hợp một phần ở gốc cùng với vòng nhị ngoài Nhị nhiều, dính với nhau ở phía gốc, vòng nhị phía trong rời nhau, chỉ nhị dài Bầu trên, 1 - 5 ô, vòi nhụy 1 - 5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau, bầu và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn Quả nang, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khô chẻ ô từ trên xuống thành

3, 4 hay 5 mảnh, có trụ hay không, vỏ quả dày hay mỏng, hóa gỗ Hạt một đến nhiều hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm, vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn

1.1.3 Phân bố

Trên thế giới, chi Camellia L có khoảng 350 loài, phân bố chủ yếu ở nhiệt

đới và á nhiệt đới, có nguồn gốc ở khu vực miền đông và miền nam Châu Á, từ dãy Himalaya về phía đông tới Nhật Bản và Indonesia Cho tới nay, có rất nhiều

nơi trên thế giới có các loài thuộc chi này Đó là các nước ở Châu Á (Ấn Độ, Bangladesh, Đài Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri - lanka, Trung Quốc, Việt Nam), Châu Âu (Liên Xô, Thổ Nhĩ Kỳ), Châu Phi (Burundi, Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda), khu vực Nam

Mỹ (Argentina, Brazil, Ecuador, Peru) và Châu Đại Dương (Australia, New - Ghine) [12]

Ở Việt Nam, chi Camellia L có khoảng 77 loài, phân bố từ Bắc vào Nam

(Yên Bái, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Bình Phước, v.v.) [30], [31], [32], [33], [41], [43], [51]

Bảng 1.1 Phân bố một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

1 C aurea H.T.Chang Trà hoa vàng

9 C dilinhensis Tran &

10 C dongnaiensis Orel Trà hoa vàng

11 C dormoyana (Pierre)

Sealy

Trà vàng môi

13 C flava (Pitard) Sealy Trà hoa vàng

19 C hirsuta Hakoda &

23 C kirinoi Ninh Trà hoa vàng

24 C limonia C.F.Liang

& S.L.Mo

Trà hoa vàng

25 C luongii Tran et Le Thái Nguyên [45]

26 C luteocerata Orel Trà hoa vàng

34 C rosmannii Ninh Trà hoa vàng

38 C tienii Ninh.T Hải đường hoa

1.1.4 Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

Tại Việt Nam đã công bố và ghi nhận trên 40 loài Trà hoa vàng Một số loài Trà hoa vàng thường gặp ở các tỉnh lân cận tỉnh Bắc Giang như:

1.1.4.1 Camellia crassiphylla Ninh & Hakoda (Vĩnh Phúc)

Cây gỗ nhỏ, cao 3 - 5 m Lá có cuống dài, phiến lá hình bầu dục, dài 17,3 - 25,1 cm, rộng 9,1 - 13 cm, xanh đậm ở mặt trên, mặt dưới có nhiều điểm tuyến màu đen, gốc lá tròn hoặc tim, chóp lá tù, mép lá có răng cưa nông, gân bên 8 - 9 cặp Hoa màu vàng, lá đài 5, tràng hoa gồm 9 - 10 cánh, các cánh bên ngoài có lông mịn, các cánh bên trong hợp với bộ nhị khoảng 2 - 3 mm ở gốc Bộ nhị nhiều,

dài 1,6 - 1,7 cm, nhẵn Bộ nhụy gồm 3 lá noãn tạo thành bầu 3 ô, nhẵn, vòi nhụy

3, rời Quả 3 ô, 1 - 3 hạt trong mỗi ô [12]

1.1.4.2 Camellia indochinensis Merr (Lạng Sơn)

Cây bụi, cao từ 1 - 4 m, cành non màu nâu vàng, cành già màu nâu tím, nhẵn Cuống lá 5 - 8 mm, có rãnh, nhẵn Phiến lá hình elip hoặc hình trứng thuôn, dài 6 - 10,5 cm, rộng 2,5 - 4,5 cm, mặt trên lá màu xanh đậm, mặt dưới lá màu xanh nhạt, thường có nhiều điểm tuyến màu đen, hai mặt lá sáng bóng Có 6 - 7 cặp gân bên Hoa đơn độc, mọc ở nách lá, đài 3 - 4, tràng 8 hoặc 9, màu vàng nhạt, nhị 8 - 10 mm, nhẵn bóng, bầu trên 3 ô [50]

1.1.4.3 Camellia chrysantha (Hu) Tuyana (Quảng Ninh)

Cây gỗ nhỏ, chồi và cành non nhẵn, cành già màu nâu, nhẵn Lá đơn, mọc

so le, không có lá kèm Cuống lá ngắn, phiến lá (bánh tẻ) hình elip, cứng, dày và dai, dài 11 cm, rộng 5 cm, mặt trên màu xanh thẫm, mặt dưới màu xanh nhạt, thường có nhiều điểm tuyến màu đen, gốc lá hình nêm, mép lá có khía răng cưa,

ngọn lá nhọn, gân giữa lộ rõ, có 10 - 12 cặp gân bên Hoa đều, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, màu vàng Cuống hoa ngắn, lá bắc 6 - 10, phủ lên nhau, cánh hoa

10 - 20, các cánh phía trong dính với nhau và dính vào vòng nhị ngoài Bộ nhị nhiều, mang bao phấn 2 ô Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu trên 3

ô, vòi nhụy 3, rời, màu vàng Quả nhẵn, chia 3 ô, mỗi ô 2 hạt [13]

1.1.5 Thành phần hóa học

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của

chi Camellia L Các nhóm chất chính thường gặp trong chi Camellia L là:

Polyphenol, flavonoid, tanin, saponin và các tinh dầu, ngoài ra còn có alcaloid, acid hữu cơ, protein, acid amin, pectin và đường khử [15], [23], [36], [47], [57]

1.1.5.1 Nhóm polyphenol

Nhóm polyphenol được coi là nhóm chất quan trọng nhất trong Trà hoa vàng do các tác dụng sinh học nổi bật

Nghiên cứu năm 2013 của Jia-Ni Lin và cộng sự trên 6 loài Trà hoa vàng

là C murauchii, C impressinervis, C euphlebia, C tunghinensis, C nitidissima var microcarpa và C nitidissima đã phát hiện 8 loại catechin là epigallocatechin

gallat (EGCG), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallat (ECG), epicatechin (EC), catechin (C) (Hình 1.1), gallocatechin (GC), gallocatechin gallat (GCG), catechin gallat (CG) [57]

Trong Trà hoa vàng có các flavonoid như quercetin, kaempferol, vitexin và các glycosid của chúng như quercetin-7-O-ß-D-glucopyranoside, kaempferol-3-glucosid,… [57]

Năm 2011, Peng và cộng sự đã phân lập được các thành phần flavonoid từ

hoa của Camellia chrysantha bằng sắc ký cột bao gồm quercetin,

quercetin-7-O-ß-D-glucopyranoside, quercetin-3-O-ß-D-glucopyranoside, rutin, vitexin, kaempferol, kaempferol-3-O-ß-D-glucopyranoside [47] Năm 2013 Wei, J B và cộng sự đã xác định được sự có mặt của nhóm chất flavonoid trong lá Trà hoa vàng, bao gồm: Vitexin, isovitexin, quercetin-7-O-ß-D-glucopyranoside và kaempferol [36]

Nhóm saponin: Cho đến nay, chỉ có saponin triterpenoid pentacyclic được

báo cáo phát hiện từ chi Camellia L và hầu hết chúng là các saponin triterpenoid

loại oleanan Các saponin là nhóm chất được tìm thấy từ tất cả các bộ phận của cây, trong đó bộ phận phân lập được nhiều nhất là hạt Các saponin đại diện như camelliasid A, B, [21]

(-)- Epigallocatechin (EGC)

Vitexin (-)- Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)

Quercetin

Nhóm tinh dầu: Các tinh dầu chính là phytol, n-hexanal, metyl salicylat,

tạo nên hương thơm riêng của mỗi loại Trà Từ loài C nitidissima, các nhà khoa

học Trung Quốc đã phân lập được 56 chất tinh dầu từ lá và 34 chất từ hoa [56]

Ngoài ra, trong Trà hoa vàng còn có mặt các nhóm chất như: Nhóm chất đường (glucoza, fructoza, ), nhóm sắc tố (diệp lục, caroten, ), nhóm vitamin (B1, B2, C, ) v.v

1.1.6 Tác dụng sinh học

Hiện nay, Trà hoa vàng ngày càng được nghiên cứu rộng rãi do có nhiều công dụng trong sinh - dược học như: Tác dụng chống oxy hóa, giúp ổn định huyết

áp, giảm nguy cơ đột quỵ và bệnh tim mạch, ức chế và tiêu diệt vi sinh vật, bảo

vệ da khỏi tác dụng của tia UV, [23], [35], [36], [43]

1.1.6.1 Tác dụng chống oxy hóa

Các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các loài thuộc chi Camellia L., đặc biệt là Trà xanh Camellia sinensis đã được thực hiện từ lâu, cả trong nước

và quốc tế Từ kết quả các nghiên cứu cho thấy tác dụng chống oxy hóa của Trà

là do hoạt tính của các hợp chất nhóm polyphenol, đây cũng là nhóm chất đặc trưng của Trà hoa vàng [20], [35], [36], [38], [43], [49]

Lá Camellia chrysantha có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện qua khả năng trung hòa gốc tự do [36] Các chất được xác định trong lá Camellia chrysantha có tác dụng dọn gốc tự do là: Quercetin-7-O-ß-D-glucopyranoside >

catechin > epicatechin > kaempferol > vitexin > isovitexin, khả năng chống oxy hóa giảm giần theo thứ tự trên [36] Khi đánh giá tác dụng chống oxy hóa của lá Trà xanh theo khả năng bảo quản dầu hạt cải, các polyphenol thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất chống oxy hóa đã biết như acid ascobic và tocopherol [38]

Gần đây, nhiều nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của Trà hoa vàng đã được thực hiện Lixia Song và cộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol trong 6 mẫu Trà hoa vàng (C impressinervis, C euphlebia,

C microcarpa, C nitidissima, C tunghinensis và C chrysantha) thu hái ở Trung

Quốc theo mô hình DPPH, được phân tích bằng phương pháp HPLC cho thấy có

phản ứng rõ rệt giữa các thành phần catechin trong trà với DPPH thể hiện rõ khi các đỉnh tương ứng tồn tại trong sắc ký đồ ban đầu của các chiết xuất ban đầu biến mất sau khi thêm DPPH [49]

1.1.6.2 Tác dụng kháng vi sinh vật

Gần đây, Trà hoa vàng còn được biết đến với tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus, tác dụng mà trước đó đã được nghiên cứu rất nhiều trên Trà

xanh (Camellia sinensis) C sinensis có chứa một số hợp chất tanin, polyphenol,

catechin bao gồm epicatechin (EC), epicatechin gallate (ECG), epigallocatechin (EGC) và epigallocatechin gallate (EGCG) có công dụng trong việc phòng chống ung thư, chống nhiễm trùng, chống oxy hóa, chống vi khuẩn và chống kí sinh trùng rất rõ rệt [10]

Nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng C sinensis có tác dụng kháng khuẩn tốt, flavonoid trong C sinensis có tác dụng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn và nấm với các mức độ khác nhau C sinensis thể hiện tác dụng mạnh nhất trên các chủng vi khuẩn gram (+) như S aureus (30 mm), B subtilis (18,5 mm), Listeria monocytogens (15 mm), có tác dụng tốt trên các chủng vi khuẩn gram (- ) như E coli (21 mm), S flexneri (24 mm), P aeruginosa (22 mm), Salmonella typhi (25 mm) và Klebsicla pneumoniae (21 mm) Trong khi đó tác dụng kháng

nấm tỏ ra rất yếu: C albicans (9 mm), C stellaloides (7,5 mm) [34] EGCG trong

C sinensis làm tăng hiệu quả của một loại kháng sinh thông thường Khi sử dụng kết hợp EGCG với kháng sinh aztreonam, có thể tiêu diệt P aeruginosa một cách

hiệu quả ở những xét nghiệm trong phòng thí nghiệm [37]

Hai vi khuẩn gram dương (S aureus và B subtilis) và hai vi khuẩn gram

âm (E coli và P aeruginosa) được chọn để đánh giá các hoạt động diệt khuẩn trong in vitro của tinh dầu và chiết xuất ethanol C nitidissima Các giá trị MIC

cho thấy hiệu quả kháng khuẩn đáng kể khi so sánh với Ampicillin và

Tobramycin, trong đó tinh dầu hiệu quả hơn với S aureus, B subtilis và E coli

(các giá trị MIC lần lượt là 1,25, 0,625 và 1,25 mg/ml), nhưng không có tác dụng

với P aeruginosa Chiết xuất ethanol thể hiện hiệu quả tốt hơn với hai chủng vi

khuẩn gram (+) [18]

Không chỉ có tác dụng kháng khuẩn tốt, C sinensis còn thể hiện tác dụng kháng nấm và kháng virus tương đối hiệu quả Chiết xuất cồn của C sinensis có tác dụng chống lại các chủng nấm như C albicans, Saccharomyces cerevisiae, Phanerochaete chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus flavus

và Candida krusei, còn dịch chiết nước thể hiện tác dụng kém hoặc không có tác dụng trên các chủng này [22], [40], [48] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, C sinensis có hoạt động chống lại virus, một số virus bị ức chế bởi C sinensis như: Laryngotrachietis, Adenovirus và virus viêm gan B EGCG có hoạt tính chống virus viêm gan B mạnh thông qua việc giảm bài tiết HBs Ag và Hbe Ag trong ống nghiệm (kháng nguyên bề mặt và kháng nguyên viêm gan B) Ngoài ra, C sinensis còn có tác dụng đối với các chủng virus: Viêm gan C, virus cúm, virus Herpes,…

[39], [42]

1.1.7 Gíá trị kinh tế của Trà hoa vàng

Một số quốc gia trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản đã nghiên cứu phát triển nhiều sản phẩm từ Trà hoa vàng như: (Superior tea, Golden Camellia, ) với các loại trà túi lọc, trà bột, viên nang, đóng chai,… Giáo sư Trần Ninh cho biết, trong một lần tham gia hội thảo quốc tế về Trà hoa vàng tại Quảng Tây, ông

đã được một doanh nghiệp Trung Quốc giới thiệu loại “Golden Camellia” dạng nước có giá tiền Việt là 4,76 triệu đồng/chai Công ty Zhonggang Gaoke Camellia Tea Industry Co., Ltd là một công ty ở tỉnh Quảng Tây - Trung Quốc đã cho ra thị trường hai dòng sản phẩm là trà uống và các sản phẩm làm đẹp từ cây Trà hoa vàng (Yellow Camellia Reviving and Cleansing Mousse) v.v

Ở Việt Nam, các sản phẩm từ Trà hoa vàng chủ yếu ở dạng thô, bán cho thị trường Trung Quốc, có rất ít sản phẩm hoàn thiện từ Trà hoa vàng Trà thanh nhiệt

do Học viện Quân Y sản xuất có thành phần Trà hoa vàng Sản phẩm dưới dạng trà túi lọc 1,2 g chứa: Trà hoa vàng (0,3g), La hán quả (0,4g), Kim ngân hoa (0,2g), Lược vàng (0,1g), Sinh địa (0,1g), Mẫu đơn bì (0,1g) Ở Quảng Ninh, công

ty Cổ Phần kinh doanh lâm sản Đạp Thanh đã chế biến sản xuất ba sản phẩm OCOP là trà túi lọc, hoa khô và lá, các sản phẩm này đều có giá trị kinh tế cao

Ngoài ra, Trà hoa vàng còn được sử dụng làm cây cảnh chơi tết do nở hoa vào đúng dịp tết

Về giá trị kinh tế, Trà hoa vàng được bán với giá dao động từ 10 - 17 triệu VNĐ/kg hoa khô và 80 - 300 VNĐ/kg lá khô Giá trị doanh thu từ trồng Trà hoa vàng có thể đạt đến hàng tỉ VNĐ/ha Do có giá trị kinh tế cao nên việc trồng và phát triển được quan tâm đặc biệt, như ở Ba Chẽ, Quảng Ninh, Trà hoa vàng đang được phát triển và trở thành sản phẩm OCOP [13]

1.2 Trà hoa vàng tại Bắc Giang

Ở tỉnh Bắc Giang, Trà hoa vàng phân bố chủ yếu ở một số khu rừng, đồi cây lâu năm tại các huyện: Yên Thế, Lục Nam, Sơn Động, Lục Ngạn

Năm 2011, Ngô Thị Minh Duyên và cộng sự đã xác định được một loài

Trà hoa vàng ở Sơn Động, Bắc Giang có tên khoa học là C euphlebia Merr ex

Sealy [45]

Trà hoa vàng Yên Thế, Bắc Giang đang được bán trên thị trường với giá 9

- 17 triệu VNĐ/kg hoa khô và 100 - 300 VNĐ/kg lá khô Do giá trị cao nên loại dược liệu quý này bị người dân khai thác triệt để, chưa có biện pháp nghiên cứu bảo tồn, phát triển bền vững Từ thực tế đó, các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển vùng thực hiện đề tài khoa học “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển cây trà hoa vàng trên địa bàn tỉnh Bắc Giang”

Từ đó đưa ra các giải pháp để bảo tồn và phát triển cây Trà hoa vàng Bắc Giang

1.3 Tình trạng kháng kháng sinh và các nghiên cứu từ thực vật

Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hay bán tổng hợp thường có độc tính cao, nhiều tác dụng phụ không mong muốn và dễ xảy ra tình trạng kháng thuốc Theo báo cáo của trung tâm phòng chống bệnh tật Châu Âu (ECDC), hằng năm ở Châu Âu có trên 25.000 bệnh nhân chết vì nhiễm phải vi khuẩn đa kháng thuốc

Các vi khuẩn kháng thuốc như MRSA, vi khuẩn tiết ESBL,… tăng lên rõ rệt hằng

năm

Tại Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh cũng đang ngày càng gia tăng Chi phí cho việc sử dụng thuốc kháng sinh chiếm gần 30% tổng chi phí thuốc và đang có chiều hướng gia tăng

Thống kê tại các bệnh viện lớn như bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện QĐTW 108, bệnh viện Chợ Rẫy,… một số loại vi khuẩn như

S.pneumoniae, E.coli, tụ cầu vàng có tỷ lệ kháng kháng sinh rất cao Cụ thể:

- Chủng S.pneumoniae đã kháng Penicillin ~ 70%, kháng Erythromycin ~

90%

- Chủng E.coli kháng Gentamicin và Cefotaxim với tỷ lệ trên 50%

- Tụ cầu vàng kháng Methicilline với tỷ lệ ~ 40%

Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt từ các bài thuốc dân gian,

có hoạt tính kháng khuẩn luôn được quan tâm vì tính an toàn, ít tác dụng phụ của chúng

Một số nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của cây thuốc:

- Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu

gừng (Zingiber officinale roscoe) và tinh dầu tiêu (Piper nigrum L.) [9]

- Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá

trầu không (Piper betel L.), họ hồ tiêu (Piperaceae) [6]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu Trà hoa vàng thu hái tại huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang tháng 2/2019 được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội Mã số tiêu bản: HNIP/18616/20

Thiết bị nghiên cứu đặc điểm thực vật:

- Kính lúp soi nổi leica EZ4

- Kính hiển vi A Kruss Optronic GmbH

- Máy ảnh kĩ thuật số Canon EOS 60D + Tamron 60mm f2.8 Macro

- Rây 355, rây 1400

- Dụng cụ khác: Phiến kính, lá kính, dao lam

- Địa điểm thực hiện: Bộ môn Thực vật

Thiết bị nghiên cứu tác dụng sinh học:

- Cân phân tích AC ADAPTER

- Bếp cách thủy WiseBath

- Tủ sấy Memmert

- Tủ ấm nuôi cấy VSV

- Tủ an toàn sinh học cấp II

- Nồi hấp tiệt trùng HIRAYAMA HV50

- Máy lắc votex

- Máy ly tâm Centrifuge 5415 R

- Các dụng cụ thủy tinh: Cốc có mỏ, bình định mức, bình nón, ống đong, pipet các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, đĩa petri, dụng cụ đục thạch

Các dụng cụ đều được rửa, tiệt trùng ở 121ᴼC trong 30 phút trước và sau khi làm thí nghiệm

- Các dụng cụ khác: Micropipette, đầu côn, ống eppendorf, kim mũi mác, quả bóp, giá ống nghiệm, đều được tiệt trùng bằng cồn 90ᴼ sau mỗi lần tiến hành thực nghiệm

- Địa điểm thực hiện: Bộ môn Thực vật và Bộ môn Vi sinh & Sinh học (TS

Đỗ Ngọc Quang)

2.1.3 Dung môi, hóa chất

- Dung môi: Ethanol, nước cất, DMSO 2%

- Hóa chất: Cao nấm men, pepton, NaCl, agar, glucose, cao Malt, xanh methylen, đỏ son phèn, acid acetic, nước javen

- Các chủng VSV kiểm định: B subtilis (ATCC 6633), E coli (ATCC 8739),

P aeruginosa (ATCC 9027), S aureus (ATCC 6538), S flexneri (DT112),

C albicans (ATCC 10231) do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và bộ môn Vi sinh & Sinh học, Đại học Dược Hà Nội cung cấp

- Mẫu đối chứng: Penicillin G, Gentamicin, Nystatin (kháng sinh thương

mại)

2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

2.2.1.1 Phân tích hình thái

Mô tả mẫu nghiên cứu theo phương pháp mô tả phân tích [1], [4] Trong nghiên cứu các đặc điểm được mô tả thuộc các nhóm: Dạng sống, thân, lá (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Đặc điểm mô tả trong nghiên cứu đặc điểm thực vật

2.2.1.2 Giám định tên khoa học

Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu về thực vật trong nước (Cây cỏ Việt Nam, Các loài trà ở Vườn Quốc gia Tam Đảo) và các tài liệu ngoài nước (Flora of China)

2.2.1.3 nghiên cứu đặc điểm vi học

- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu:

• Chọn mẫu: Lá (bánh tẻ) và cành được ngâm trong cồn 70ᴼ

• Cắt tiêu bản bằng phương pháp cắt trực tiếp

• Tẩy và nhuộm tiêu bản theo phương pháp tẩy nhuộm kép

• Lên tiêu bản theo phương pháp giọt ép và soi dưới kính hiển vi để phân tích đặc điểm giải phẫu của lá và cành mẫu nghiên cứu [4]

- Nghiên cứu đặc điểm bột:

• Quan sát hình dạng, màu sắc, ngửi, nếm, nhận biết mùi vị của bột

• Bột lá Trà hoa vàng Bắc Giang được nghiên cứu bằng phương pháp soi bột [3]

2.2.2 Nghiên cứu tác dụng kháng VSV

2.2.2.1 Chuẩn bị mẫu thử

- Chuẩn bị mẫu thử: Lá mẫu nghiên cứu được chiết trong các dung môi: Ethanol 96%, ethanol 50%, H20

• Cân chính xác 3 phần bột dược liệu, mỗi phần khoảng 30,0 g Thấm

ẩm mỗi phần với các dung môi trên trong 1h

• Với dung môi ethanol 96%, ethanol 50%: Chiết siêu âm 3 lần với mỗi phần Thể tích chiết lần lượt là 250, 150, 150 ml trong 30 phút, mỗi lần

• Với dung môi H20: Chiết nóng 3 lần Thể tích chiết lần lượt là 250,

Ethanol 50%

(CA37-L3)

Ethanol 96% (CA37-L5)

Kí hiệu: CA37: Trà hoa vàng thu tại Bắc Giang

CA37-L1: Cắn chiết bằng nước CA37-L3: Cắn chiết bằng ethanol 50%

CA37-L5: Cắn chiết bằng ethanol 96%

- Mẫu thử: Cân 200 mg cắn mỗi loại, hòa tan trong 2,0 ml DMSO 2% (100 mg/ml)

2.2.2.2 Thử tác dụng kháng VSV

- Hoạt tính ức chế các chủng VSV thử nghiệm được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Sử dụng mẫu thử đã chuẩn bị ở trên

- Nguyên tắc: Hoạt chất có trong chế phẩm thử khuếch tán vào môi trường

dinh dưỡng có VSV chỉ thị tại các vùng ức chế tỷ lệ thuận với logarid nồng

độ Mẫu thử được cho vào các giếng thạch đã được đục sẵn trong đĩa môi trường nuôi cấy Sau thời gian nuôi cấy thích hợp (18h), đo đường kính vùng

ức chế để đánh giá khả năng ức chế VSV của mẫu nghiên cứu [7]

- Tiến hành:

• Môi trường nuôi cấy:

Môi trường Luria - Bertani thạch (nuôi cấy vi khuẩn):

Nước cất vừa đủ Môi trường Yeast - Malt thạch (nuôi cấy vi nấm):

1 Gram (+) B subtilis ATCC 6633 Penicillin G

2 S aureus ATCC 6538 Penicillin G

3 Gram (-) E coli ATCC 8739 Gentamicin

4 P aeruginosa ATCC 9027 Gentamicin

5 S flexneri DT112 Gentamicin

6 Nấm men C albicans ATCC 10231 Nystatin

DMSO 2%: đối chứng âm

- Cách tiến hành:

• Cân đầy đủ các hóa chất môi trường cho vào bình nón, lắc đều cho hóa chất tan hoàn toàn Điều chỉnh PH về 7,0 bằng HCl và NaOH 1N Hấp tiệt trùng tại 121ᴼC trong 20 phút

• Chuẩn bị đĩa thạch: Đổ môi trường thạch vào các hộp petri (20ml/hộp)

• Các chủng VSV được nuôi trong môi trường dịch thể ở 37ᴼC đối với

vi khuẩn và 32ᴼC đối với nấm men trong 18h trước khi thử hoạt tính

• Pha loãng môi trường dịch thể chứa VSV đến khi đạt độ đục trong khoảng 0,5 McFarland Dùng tăm bông vô trùng cấy VSV lên bề mặt môi trường thạch chứa trong đĩa petri

• Trên đĩa môi trường thạch, tạo các giếng có đường kính 6 mm sau đó nhỏ vào mỗi giếng 100 μl mẫu thử (10 mg/giếng) Đối chứng dương:

Penicillin G (2,5 μg/giếng), Gentamicin (5 μg/giếng), Nystatin (2,5 μg/giếng), đối chứng âm: 100 μl DMSO 2%

• Các đĩa được ủ ở 37ᴼC đối với vi khuẩn và 32ᴼC đối với nấm men

• Đánh giá hoạt tính kháng VSV sau 18h: Quan sát đĩa thạch xem có vòng vô khuẩn hay không Nếu có, đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác ± 0,1 mm

• Thử nghiệm được lặp lại 3 lần với mỗi chủng VSV

• Đường kính vòng vô khuẩn được xác định bằng phương pháp thống

kê

d = x̅ ± SD (mm) Trong đó:

𝑥̅ = ∑𝑛𝑖=1,𝑛𝑥𝑖

SD = √∑𝑛𝑖=1,𝑛(𝑥𝑖−𝑥̅)

d: đường kính trung bình vòng vô khuẩn

𝑥̅: trung bình cộng các đường kính vòng vô khuẩn của mẫu thử

𝑆𝐷: độ lệch chuẩn

𝑛: cỡ mẫu nghiên cứu

𝑥𝑖: đường kính vòng vô khuẩn thứ i (i: 1→ n, n Є N*)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu

3.1.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu

Cây gỗ nhỏ, chồi và cành non nhẵn, màu nâu tím, cành và thân trưởng thành màu trắng, nhẵn, có đường kính từ 5 - 9 cm Cành mọc nghiêng 30 - 45ᴼ so với

thân

Lá bao chồi 7 - 9, hình elip, lớn dần từ dưới lên, mặt ngoài màu hồng nhạt, nhẵn, mặt trong màu hồng đậm hơn, nhẵn, mép nguyên, ngọn thuôn nhọn Lá non màu xanh nhạt, lá già màu xanh đậm hơn

Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm Cuống lá tương đối ngắn, dài 0,8 - 1,0

cm, lõm ở mặt trên, nhẵn Phiến lá (bánh tẻ) hình elip, cứng, dày và dai, dài 10,5

- 18 cm, rộng 5,7 - 7,8 cm, gốc lá thuôn, mép lá có khía răng cưa, khía răng cưa nông, nhỏ, phía gốc lá gần như không có khía, mật độ khía răng cưa tăng dần về phía ngọn lá, chỗ rộng nhất khía răng cưa cách nhau 6 mm, ngọn lá nhọn có mũi dài 1 - 1,5 cm, mặt trên lá màu xanh thẫm, nhẵn bóng, mặt dưới màu xanh nhạt, nhẵn, thường có nhiều điểm tuyến màu đen, gân giữa lộ rõ, hơi lồi ở mặt trên, nổi

rõ ở mặt dưới, gân hình lông chim, có 9 - 10 cặp gân bên

Dựa trên các đặc điểm hình thái, sơ bộ xác định mẫu nghiên cứu thu hái tại

huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang là Trà hoa vàng thuộc chi Camellia L., họ

Theaceae, chưa xác định được đến loài do chưa thu được hoa, quả và hạt

Hình 3.1 Hình thái mẫu nghiên cứu

Chú thích:

3 Cành non mang lá bao chồi 4 Lá có kích thước khác nhau

đa giác, có thành dày ở góc, xếp xít nhau Trên lớp mô dày là các tế bào mô mềm (3) có thành mỏng, hình đa giác hoặc gần tròn, bắt màu hồng khi nhuộm Mô cứng (5), gồm 2 - 5 lớp tế bào, bắt màu xanh, có màng dày hóa gỗ ít nhiều, xếp xít nhau

tạo thành cung bao quanh các bó libe gỗ Có một bó libe gỗ lớn ở gân chính, libe

ở dưới, gỗ ở trên, bó libe (6) là các đám tế bào nhỏ, vách mỏng, hình đa giác kích thước đều, bắt màu hồng, xếp lộn xộn thành từng đám, bó gỗ (7) là đám có chứa các mạch gỗ (là lỗ thủng lớn) và mô mềm gỗ (tế bào nhỏ, thành dày, bắt màu xanh) Trong mô mềm có các thể cứng (4) bắt màu xanh và rải rác có tinh thể calci oxalat (12) hình cầu gai

- Phần phiến lá:

Biểu bì dưới (1) là một hàng tế bào hình chữ nhật tương tự gân lá Mô khuyết (8), gồm những tế bào không đều, để hở những khoảng trống chứa đầy khí Mô giậu (9), gồm 1 - 2 hàng tế bào hình trụ, xếp cạnh nhau, chứa nhiều lạp lục Trong mô mềm có thể cứng và rải rác có tinh thể calci oxalat hình cầu gai Biểu bì trên (11) có cấu tạo tương tự biểu bì dưới

Hình 3.2 Vi phẫu lá mẫu nghiên cứu Chú thích:

1 Biểu bì dưới, 2.Mô dày dưới, 3 Mô mềm, 4.Thể cứng, 5 Mô cứng,

6 Libe, 7 Mạch gỗ, 8 Mô khuyết, 9 Mô giậu, 10 Mô dày trên,

11 Biểu bì trên, 12 Calci oxalat

b Vi phẫu thân (Hình 3.3)

Mặt cắt ngang thân cây có thiết diện gần tròn, gồm:

Ngoài cùng là lớp biểu bì (1), gồm một lớp tế bào hình chữ nhật tương đối

đều nhau Ngay sát lớp biểu bì là mô mềm vỏ (2), gồm nhiều tế bào hình đa giác,

kích thước không đều, sắp xếp lộn xộn, các góc có khoảng gian bào Mô cứng (3)

gồm 3 - 4 lớp tế bào sợi, kích thước không đều, thành dày hóa gỗ, bắt màu xanh

Bó libe (4) gồm các tế bào bị ép bẹp màu đỏ sẫm, nhìn không rõ hình dạng tế bào,

nằm trong mô mềm vỏ, xếp thành dãy xuyên tâm Phía trong libe là tầng phát sinh

libe-gỗ (5), gỗ cấp 2 (6) là các tế bào xếp đều đặn thành từng dãy xuyên tâm, kích

thước phần này khá lớn, bắt màu xanh khi nhuộm, gỗ cấp 1 (7) hình tam giác có

đỉnh quay vào tâm Ở giữa là mô mềm ruột (8), gồm các tế bào hình tròn hoặc

hình đa giác, thành mỏng, có các khoảng gian bào Trong mô mềm ruột có chứa các tinh thể calci oxalat (9) hình cầu gai nằm rải rác

Hình 3.3 Vi phẫu thân mẫu nghiên cứu Chú thích

1 Biểu bì, 2 Mô mềm vỏ, 3 Mô cứng, 4 Libe, 5 Tầng phát sinh libe - gỗ,

6 Gỗ cấp 2, 7 Gỗ cấp 1, 8 Mô mềm ruột, 9 Calci oxalat

c Đặc điểm bột lá Trà hoa vàng Bắc Giang

Bột dược liệu màu xanh lục, mùi thơm nhẹ, vị hơi chát Soi dưới kính hiển vi quan sát thấy: Lỗ khí (1) hình hạt đậu, dạng hỗn bào, đường kính khoảng 25 - 30 μm, khí khổng có đường kính bằng 1/3 lỗ khí, khoảng 8 - 10 mm, mảnh biểu bì mang lỗ khí (2) Thể cứng (3) có nhiều hình dạng

và kích thước khác nhau: hình khối, hình sao, từ 100 - 250 μm Mảnh mạch xoắn (4), (8) Mảnh biểu bì (9) gồm các tế bào hình chữ nhật xếp khít Hạt tinh bột (5), (6) gần tròn có rốn rõ, đường kính khoảng 20 - 25 μm Rải rác có tinh thể calci oxalat (7) hình cầu gai, đường kính từ 15 - 20 μm Tế bào sợi (10) dài, đứng riêng Hình 3.4 Bột lá mẫu nghiên cứu

lẻ hay tạo thành từng bó, có đường kính khoảng 20 μm

Hình 3.5 Một số đặc điểm của bột lá mẫu nghiên cứu Chú thích:

1 Lỗ khí 2 Mảnh biểu bì mang lỗ khí 3 Thể cứng

9 Mảnh biểu bì 10 Sợi

3.1.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng VSV

Kết quả thử nghiệm cho thấy, hoạt động của các chất làm đối chứng dương

ổn định ở tất cả các đĩa trong các lần lặp lại thí nghiệm Đối chứng âm DMSO 2% hoàn toàn không có vòng ức chế vi sinh vật xuất hiện Các dịch chiết đã thể hiện hoạt tính ức chế khác nhau đối với mỗi loài vi sinh vật sử dụng trong thí nghiệm Với hàm lượng: 100 µl dịch thử nồng độ 100 mg/ml (khối lượng cắn/1ml DMSO

2%), các mẫu thể hiện hoạt tính ức chế với các VSV: B subtilis, S aureus và C albicans (Bảng 3.1)