khảo sát thành phần hóa học của loài địa y dirinaria applanata (fée) d. d. awasthi

Xin cảm ơn các bạn sinh viên lớp Hóa Dược K36 và những thành viên của phòng Hóa Sinh 1, Hóa Dược và Hữu Cơ 1, những người bạn đã cùng chúng tôi đi hết chặng đường sinh viên và đã nhiệt t

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA - -

NGUYỄN QUANG VĨNH NGUYÊN NGUYỄN THỊ NGỌC LỢI

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI ĐỊA Y

DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D D AWASTHI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA HỌC

Cần Thơ, 2013

BỘ MÔN HÓA - -

NGUYỄN QUANG VĨNH NGUYÊN NGUYỄN THỊ NGỌC LỢI

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI ĐỊA Y

DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D D AWASTHI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS NGUYỄN TRỌNG TUÂN ThS NGUYỄN THẾ DUY

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC Năm học 2013-2014

Đề tài: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LOÀI ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA

(FÉE) D D AWASTHI”

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi là Nguyễn Quang Vĩnh Nguyên và Nguyễn Thị Ngọc Lợi, tác giả

của Luận văn xin xác nhận đã chỉnh sửa hoàn chỉnh theo những ý kiến và góp

ý của các Thầy, Cô phản biện và Hội đồng chấm bảo vệ luận văn

Cần Thơ, ngày 22 tháng 12 năm 2013

Ký tên

Nguyễn Quang Vĩnh Nguyên Nguyễn Thị Ngọc Lợi

Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Cử Nhân Hóa Học

Đã bảo vệ và được duyệt Hiệu trưởng………

Trưởng khoa………

……… Nguyễn Trọng Tuân

LỜI CẢM ƠN



Trong suốt bốn năm đại học, chúng em đã nhận được sự chỉ dạy tận tình của thầy cô trên giảng đường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô ở khoa Khoa Học Tự Nhiên đã hết lòng giảng dạy, truyền đạt cho chúng em rất nhiều kiến thức quý báu, những kinh nghiệm cuộc sống, những kỹ năng nghề nghiệp

Đó chính là nền tảng, là hành trang để mai đây chúng em sẽ vững bước trên con đường tương lai của mình Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành tới:

TS Nguyễn Trọng Tuân – Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trường Đại học Cần Thơ, đã tin tưởng giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chúng em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

ThS Nguyễn Thế Duy – Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trường Đại học Cần Thơ, đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho chúng em những kiến thức và kinh nghiệm trong suốt thời gian chúng em thực hiện luận văn

Chúng em xin gửi cảm ơn sâu sắc đến cô Ngô Kim Liên, thầy Lê Hoàng Ngoan, đã luôn quan tâm, chỉ bảo và cho em những lời khuyên chân thành nhất trong suốt quá trình theo học tại trường

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng em trong những năm học vừa qua, cung cấp, hỗ trợ phương tiện để chúng em có thể hoàn thiện tốt đề tài luận văn

Xin cảm ơn các bạn sinh viên lớp Hóa Dược K36 và những thành viên của phòng Hóa Sinh 1, Hóa Dược và Hữu Cơ 1, những người bạn đã cùng chúng tôi

đi hết chặng đường sinh viên và đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, chúng con xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ, anh chị và những người thân yêu đã nuôi nấng dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng con vững bước trên con đường học vấn và trở thành người có ích cho xã hội

Xin chân thành cảm ơn!

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Trọng Tuân

2 Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y Dirinaria applanata

(Fée) D D Awasthi”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Quang Vĩnh Nguyên MSSV: 2102466

Nguyễn Thị Ngọc Lợi MSSV: 2102459 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 36

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Trọng Tuân

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

Tên đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y Dirinaria

applanata (Fée) D D Awasthi”.

2 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Quang Vĩnh Nguyên MSSV: 2102466

Nguyễn Thị Ngọc Lợi MSSV: 2102459 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 36

3 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

* Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

* Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Cán bộ phản biện

TÓM TẮT

Mục đích của luận văn là xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt

tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate từ loài địa y Dirinaria applanata (Fée)

D D Awasthi

Từ cao ethyl acetate của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D D

Awasthi, năm hợp chất đã được phân lập và được mã hóa: HP7, HP8, HP9, HP10, HP11

Nhóm chức của những hợp chất này được xác định bằng quang phổ hồng ngoại FT – IR Dữ liệu phổ FT – IR cho thấy, các dao động đặc trưng của hợp chất HP7: 3332 (O–H); 2962, 2931, 2870 (C–H); 1602, 1459 (C=C); hợp chất HP8: 3597, 3428 (-NH2); 2943, 2873 (C–H); hợp chất HP9: 3523, 3399 (N–H);

2937 (C–H); 1715 (C=O) và hợp chất HP10: 3404 (N–H); 2928 (C–H); 1628 (C=O)

Hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate từ địa y Dirinaria applanata

(Fée) D D Awasthi được xác định bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết ethyl acetate (IC50 = 0,0769 mg/mL) có khả năng kháng oxi hóa cao hơn so với vitamin C (IC50 = 0,0860 mg/mL)

Các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của những hợp chất phân lập được vẫn đang được tiến hành

Từ khóa: Dirinaria Applanta (Fée) D D Awasthi, IC50, DPPH

ASBTRACT

The aim of this thesis is to investigate chemical composition and to test

for antioxidant activity of ethyl acetate extract of the lichen Dirinaria applanata

(Fée) D D Awasthi

From the ethyl acetate extract of lichen Dirinaria applanata (Fée) D D

Awasthi, five pure compounds were isolated and named including: HP7, HP8, HP9, HP10, HP11

Functional groups of all these isolates were determined by infrared spectroscopy method The FT – IR data showed that HP7 contains: 3332 (O–H); 2962, 2931, 2870 (C–H); 1602, 1459 (C=C); HP8 contains: 3597, 3428 (-NH2); 2943, 2873 (C–H); HP9 contains: 3523, 3399 (N–H); 2937 (C–H); 1715 (C=O) and HP10 contains: 3404 (N–H); 2928 (C–H); 1628 (C=O)

The ethyl acetate extract of lichen Dirinaria applanat (Fée) D D Awasthi

was tested for antioxidant activity by the use of DPPH hydrazyl)free radical method The result showed that ethyl acetate extract (IC50

(2,2-diphenyl-1-picryl-= 0,0769 mg/mL) has higher antioxidant activity than vitamin C (IC50 = 0,0860 mg/mL) as positive control

Studies on the structure and biological activity of isolated compounds have been continued

Keywords: Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi, IC50, DPPH

TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Quang Vĩnh Nguyên Nguyễn Thị Ngọc Lợi

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn ii

Nhận xét đánh giá của cán bộ hướng dẫn iv

Nhận xét đánh giá của cán bộ phản biện v

Tóm tắt vi

Asbtract vii

Trang cam kết kết quả viii

Mục lục ix

Danh sách bảng xii

Danh sách hình xiii

Danh mục từ viết tắt xiv

Chương 1: Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2: Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tổng quan thực vật học 3

2.1.1 Tên gọi 3

2.1.2 Đặc điểm 3

2.1.3 Công dụng của địa y 4

2.1.4 Thành phần hóa học 5

2.2 Sơ lược về địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi 13

2.2.1 Tên gọi 13

2.2.2 Phân loại 13

2.2.3 Mô tả thực vật 14

2.2.4 Thành phần hóa học 14

2.2.5 Phân bố 14

2.2.6 Đặc điểm 15

2.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất trong cây 15

2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm 15

2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 15

2.4 Phương pháp làm khô mẫu 16

2.5 Phương pháp kết tinh phân đoạn 16

2.6 Phương pháp sắc ký 16

2.6.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 16

2.6.2 Phương pháp sắc ký cột 20

2.7 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH 22

2.7.1 Nguyên tắc 22

2.7.2 Cơ chế 22

2.7.3 IC50 và cách xác định 23

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 24

3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện 24

3.1.1 Địa điểm và thời gian 24

3.1.2 Thu hái mẫu cây 24

3.1.3 Dụng cụ 24

3.1.4 Hóa chất 24

3.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ cao chiết 25

3.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 25

3.4 Điều chế các loại cao 25

3.4.1 Xử lý mẫu 25

3.4.2 Điều chế cao methanol tổng 25

3.4.3 Điều chế các loại cao chiết 26

3.5 Khảo sát cao ethyl acetate 27

3.5.1 Sắc ký cột cao ethyl acetate 27

3.5.2 Khảo sát phân đoạn E3 30

3.5.3 Khảo sát phân đoạn E7 34

3.5.4 Khảo sát phân đoạn E8 37

3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH 38

3.6.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate 38

3.6.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C 39

Chương 4: Kết quả và thảo luận 41

4.1 Khảo sát đặc điểm của các hợp chất cô lập được 41

4.1.1 Hợp chất HP7 41

4.1.2 Hợp chất HP8 42

4.1.3 Hợp chất HP9 43

4.1.4 Hợp chất HP10 43

4.1.5 Hợp chất HP11 44

4.2 Hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH 45

4.2.1 Hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate 45

4.2.2 Hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C 46

4.2.3 So sánh hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate và vitamin C 46

Chương 5: Kết luận và kiến nghị 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

Tài liệu tham khảo 48

Phụ lục 50

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình sắc ký lớp mỏng 18

Bảng 3.1: Kết quả SKC trên cao ethyl acetate 28

Bảng 3.2: Kết quả SKC phân đoạn E3 31

Bảng 3.3: Kết quả SKC phân đoạn E7 34

Bảng 3.4: Kết quả SKC phân đoạn E7.3 35

Bảng 3.5: Kết quả SKC phân đoạn E7.3.1 36

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate 39

Bảng 3.7: Kết quả đo OD dịch chiết cao ethyl acetate (λ = 517 nm) 40

Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C 40

Bảng 3.9: Kết quả đo OD vitamin C (λ = 517 nm) 40

Bảng 4.1: So sánh khả năng ức chế gốc tự do DPPH của dịch chiết cao ethyl acetate và vitamin C 46

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Các dạng địa y thường gặp 3

Hình 2.2: Cấu tạo của địa y 4

Hình 2.3: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi 13

Hình 2.4: Cấu tạo địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi 14

Hình 2.5: Cách tính giá trị Rf 18

Hình 3.1: Quy trình điều chế các loại cao 27

Hình 3.2: SKLM khảo sát cao ethyl acetate 28

Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP9 30

Hình 3.4: SKLM khảo sát hợp chất HP11 32

Hình 3.5: SKLM phân đoạn E3.2 33

Hình 3.6: SKLM khảo sát hợp chất HP10 33

Hình 3.7: SKLM khảo sát hợp chất HP7 36

Hình 3.8: SKLM khảo sát hợp chất HP8 37

Hình 3.9: Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate 38

Hình 4.1: SKLM cao EA, HP7, HP8, HP9, HP10 và HP11 41

Hình 4.2: SKLM hợp chất HP7 42

Hình 4.3: Hợp chất HP7 42

Hình 4.4: SKLM hợp chất HP8 42

Hình 4.5: Tinh thể hợp chất HP8 42

Hình 4.6: SKLM hợp chất HP9 43

Hình 4.7: Tinh thể hợp chất HP9 43

Hình 4.8: SKLM hợp chất HP10 44

Hình 4.9: Tinh thể hợp chất HP10 44

Hình 4.10: SKLM hợp chất HP11 44

Hình 4.11: Tinh thể hợp chất HP11 44

Hình 4.12: Thể tích cao ethyl acetate và khả năng bắt DPPH 45

Hình 4.13: Thể tích vitamin C và khả năng ức chế gốc tự do DPPH 46

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

IC50 Half maximal Inhibitory Concentration

ED50 Effective Dose required for 50% inhibition of growth

HPLC High-performance liquid chromatography

FT – IR Fourier Transform Infrared Spectroscopy

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Việt nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với một mùa nắng và một mùa mưa hằng năm Bên cạnh đó, lãnh thổ Việt Nam có địa hình phức tạp từ Bắc vào Nam và từ Đông sang Tây Vì thế, thiên nhiên Việt Nam rất phong phú và

đa dạng về thực vật, trong đó có nhiều loài cây chứa dược chất có thể dùng làm thuốc chữa bệnh

Địa y là loài thực vật cộng sinh giữa tảo và nấm, có thể sống ở hầu hết các nơi: đất, đá và thậm chí trên thân cây

Địa y, xuất hiện cách đây 400 triệu năm, được biết đến như là một loại dược liệu dùng để chữa bệnh cho con người Trên thế giới, các công trình về

sự tách chiết các hợp chất từ địa y cho thấy nó chứa một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm depside, depsidone, dibenzofuran, xanthone, terpene….[1] Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học, những công trình khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy các chất từ địa y có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, kháng HIV,…[2-3]

Năm 2006, khoảng 275 loài địa y ở Việt Nam đã được thống kê, trong đó

122 loài mới lần đầu tiên được ghi nhận [4] Ở Việt Nam, hiện có một số nghiên cứu về việc định danh địa y của tác giả Võ Thị Phi Giao (2003) và khảo sát thành phần hóa học địa y của nhóm tác giả Nguyễn Kim Phi Phụng thực hiện tại Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh Bên cạnh đó, cũng có thêm một số nghiên cứu về hóa sinh học và hoạt tính sinh học của địa y do tác giả Lê Hoàng Duy (2012) thực hiện Nghiên cứu trên đối tượng địa y đang là một hướng đi mới mẻ trong hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta

Việt Nam có khí hậu rất thích hợp cho sự phát triển của địa y Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, địa y có nhiều hoạt tính sinh học quý giá nhưng nó chưa được quan tâm nghiên cứu đúng mức ở Việt Nam trong khi nước ta có nguồn địa y rất phong phú và dồi dào Với nguồn địa y phong phú nhưng chưa

được sử dụng hiệu quả, việc “Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y

Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi” là thực sự cần thiết với mong muốn phát hiện các hoạt tính sinh học của loài địa y này, đồng thời góp phần định hướng sử dụng nguồn địa y vào y học cổ truyền tại Việt Nam

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn “Khảo sát thành phần hóa học

của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi” có các mục tiêu sau:

- Tách chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất từ địa y

- Xác định nhóm chức của các hợp chất cô lập được

- Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Tìm hiểu về loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi

- Thu và xử lý nguyên liệu địa y tươi, nghiền mịn nguyên liệu thành bột

- Tiến hành chiết cao methanol, petroleum ether, ethyl acetate, nước

- Khảo sát, phân lập hợp chất tinh khiết từ cao ethyl acetate bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

- Xác định nhóm chức các hợp chất tinh khiết thu được

- Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate

- Tổng hợp, đánh giá kết quả và viết báo cáo

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan thực vật học

2.1.1 Tên gọi

 Tên khoa học: Lichene

 Tên tiếng Anh: Lichene

 Tên tiếng Việt: Địa y

cơ tổng hợp từ quang hợp hay từ các tế bào chết [5]

Các hình dạng của địa y: dạng khảm (crustose) dính chặt và dán vào giá thế, dạng phiếm (foliose) với nhiều thùynhư lá cây hay dạng bụi (fruticose) như bụi cây [5]

Địa y dạng khảm Địa y dạng phiếm Địa y dạng bụi

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Lichen) Hình 2.1: Các dạng địa y thường gặp Trong địa y, thành phần nấm thường là nấm túi, đôi khi là nấm đảm Thành phần tảo thường là tảo lục, đôi khi là vi khuẩn lam Tế bào tảo phân tán giữa các khuẩn ty Một số khuẩn ty dán chặt vào rong để hấp thu carbohydrate

và những chất hữu cơ từ tảo, còn nấm thì cung cấp nước và khoáng chất cho tảo Ðịa y là một dạng thích nghi đặc biệt của vùng khô hạn cho phép chúng có thể sống trong những điều kiện khắc nghiệt [5]

(Nguồn: http://vietsciences1.free.fr/vietscience/giaokhoa/biology/

virologie/nammocnamnhaydiay.htm) Hình 2.2: Cấu tạo của địa y Ðịa y hiện diện trên thân cây, đất và đá Trên đá chúng là những sinh vật tiên phong, là những tộc đoàn đầu tiên chiếm cứ môi trường mới vì chúng có thể phá hủy đá dần dần do các acid mà chúng tiết ra và sẽ tạo ra những hạt đất nhỏ Những vật chất hữu cơ từ địa y thối rữa làm tăng thành phần của đất được tạo ra Các acid được tiết ra thay đổi theo loài và thường được dùng để định danh địa y

Ðịa y tăng trưởng với một tốc độ rất chậm: địa y dạng khảm tăng trưởng 0,1 – 10 mm/năm, địa y dạng phiếm tăng trưởng 2 – 4 cm/năm Ðịa y dễ bị tổn hại do chất ô nhiễm không khí và có thể được xem là sinh vật chỉ thị về chất lượng không khí Thường phải đi xa vài dặm cách xa thành phố mới có thể tìm được địa y

Địa y sống kí sinh khi môi trường không cung cấp đủ nhu cầu sống, chúng hút các chất từ cây chủ nhờ các sợi nấm đâm sâu vào mô cây chủ

Thường địa y có màu xám, xanh xám, thỉnh thoảng có màu vàng, da cam hay đen Màu của địa y được quyết định bởi sự kết hợp màu của tảo, màu của chất màu trong sợi nấm và màu của lichenic acid nếu có

2.1.3 Công dụng của địa y

Địa y rất phổ biến trong thiên nhiên và sống được ở nơi khô cằn nên chúng đóng vai trò "tiên phong mở đường" Chúng phân hủy đá thành đất và khi chết

đi tạo thanh lớp đất mùn nhiều dinh dưỡng là nguồn thức ăn cho các thực vật

đến sau Một số loài địa y như Cladonia rangiferina là thức ăn chủ yếu của loài

hươu Bắc cực[5]

Địa y đã được con người sử dụng trong nhiều thế kỷ với nhiều mục đích khác nhau như: thực phẩm, thuốc nhuộm, nguyên liệu cho nước hoa và là

phương thuốc chữa bệnh trong y học dân gian [2] Evernia prunastri Var

prunastri (oakmoss) và Pseudevernia furfuracea (treemoss) là hai loài địa y

được sử dụng trong ngành công nghiệp nước hoa Khoảng 700 tấn oakmoss được sử dụng hàng năm bởi nhà máy Pháp [6-7] Một số dịch chiết từ địa y đã được dùng trong y học dân gian để chữa nhiều bệnh khác nhau, chẳng hạn như

Lobaria pulmonaria chữa bệnh phổi, Xanthoria parientina trị vàng da , Usnea spp trị rụng tóc, Cetraria islandica (rêu Iceland) trị bệnh lao, viêm phế quản

2.1.4.1 Aliphatic acid

Bên cạnh các acid béo thông thường, nhiều địa y tích lũy các acid béo với mạch nhánh và có 17, 19, 20 nguyên tử carbon Các acid béo bất bão hòa như achidonic acid được tìm thấy trong dịch chiết của địa y

Protolichesterinic acid (1) là một monobasic acid Protolichesterinic acid không bền về mặt hóa học, dễ dàng tái sắp xếp lại cấu trúc để hình thành tautomeric gọi là lichesterinic acid

1 (+)- Protolichesterinic acid

Me

(+)-Protolichesterinic acid được phân lập từ Cetraria islandica L và

Parmelia nepalensis Tayl (+)-Protolichesterinic acid là một chất ức chế

enzyme 5-lipoxygenase trên bạch cầu lợn tại IC50 là 20 µM [9] và trên bạch cầu

bò tại IC50 là 9 µM [2] Tại ED50 cho thấy (+)-protolichesterinic acid có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư vú và ức chế sự kích thích

sự phân chia của tế bào lymphocyte tại nồng độ IC50 tương tự[2] Ngoài ra, protolichesterinic acid cũng cho thấy có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào Protolichesterinic acid là một thành phần trong dịch chiết có trong rêu ở

Iceland có khả năng chống lại Helicobacter pylori trong ống nghiệm [10]

Những phát hiện này cho thấy sự nỗ lực trong việc tìm kiếm kiếm phương thuốc truyền thống để làm giảm loét dạ dày và tá tràng của Iceland

2.1.4.2 Dẫn xuất pulvinic acid

Nhiều địa y có chứa sắc tố màu vàng hoặc da cam Các sắc tố này bao gồm hai đơn vị phenylpropane, tại đó đơn vị C3 của các acid bắt nguồn từ địa

y là isopropyl thay vì propyl Các dẫn xuất của vulpinic acid (2) và methyl ester pulvinic acid (3), được xác định là một tác nhân kháng viêm trong thử nghiệm viêm ở chuột cống [2] Vulpinic acid cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi sinh vật hiếu khí và kị khí Đây là một chất chuyển hóa thứ cấp gây

ra sự tách cặp trong phản ứng phosphoryl oxi hóa

CO2R

O O OH

2 R= Me

3 R = H

2.1.4.3 Dẫn xuất của hydroxybenzoic acid

Các ester của 4-hydroxybenzoic acid như: metylparaben được sử dụng như một chất bảo quản các chế phẩm dược Chất này nhanh chóng được thủy phân trong cơ thể tương tự như là một acid, sản phẩm liên hợp ngay sau đó sẽ được bài tiết ra khỏi cơ thể, cho nên độc tính của chúng thường thấp Vì vậy, đây không phải là điều ngạc nhiên đối với hợp chất phenolic có nguồn gốc từ địa y Methyl và ethyl orsellinate (5,6), methyl β-orsellinate (7) [11-12] và methyl hematommate (8) [13] thể hiện hoạt tính kháng sinh có khả năng chống lại nhiều loại vi sinh vật

HO

OH

Me HO

CO2R

Me HO

Me OH

OH OHC

β-orcinol như β-orsellinic acid

Các β-orcinol depside như: atranorin (9), diffractaic acid (10) và barbatic acid (11) là chất ức chế ở mức trung bình của arachidonate 5-lipoxygenase, trái ngược với monomeric (8), (9) có chứa nhóm chức benzaldehyde Đặc biệt, ethyl 4-O-demethyl barbatate (12) và propyl 4-O-demethyl obtusate (13) lại là các chất ức chế 5-lipoxygenase mạnh nhất của nhóm depside với giá trị IC50

thấp hơn µM [2] Diffractaic acid được xem như là một thuốc giảm đau và hạ sốt

Atranorin là một hợp chất phổ biến có trong địa y Atranorin có dạng tinh thể, màu vàng với nhiệt độ nóng chảy 192 – 194ºC Phương pháp cổ điển để chiết xuất atranorin là dựa vào độ tan khác nhau của các chất hữu cơ trong địa

y Atranorin tan trong benzene nóng, chloroform, xylene, tan rất ít trong ethanol nóng, diethyl ether, không tan trong nước, ethanol và diethyl ether lạnh Hơn thế nữa, confluentic acid (14) là một loại orcinol depside được chứng minh có khả năng ức chế chọn lọc enzyme monoamine oxidase B tại IC50 là 0,22 µM Enzyme này chịu trách nhiệm cho sự khử amin hóa của chất dẫn truyền thần kinh Trong khi đó, chất ức chế MAO-A như là một thuốc hữu ích trong việc chống lại chứng trầm cảm trong lâm sàng, chất ức chế chọn lọc cho MAO-B như selegillin được sử dụng hiệu quả trong bệnh Parkinson

Trong số các depside, có các chất có khả năng ức chế sự tăng sinh quá mức của tế bào Một vài chất chuyển hóa của địa y được dùng thử nghiệm, cho thấy rằng tridepside gyrophoric acid (15) có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào sừng ở người, điều này có tác động tích cực trong việc chống lại những bệnh liên quan đến sự tăng sinh quá mức tế bào ở da như là bệnh vẩy nến Hoạt tính ức chế sự tăng sinh quá mức của tế bào có thể liên quan đến khả năng can thiệp vào hệ thống vận chuyển điện tử

OH OHC

O O

Me

CO2Me

Me OH

OR Me

O O

Me

CO2Me

Me OH

OH Me

O O

OH Me

O O

OH

Me O O

có cấu trúc căn bản là hệ vòng 11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-one Đây là

đặc trưng hóa học quan trọng của các chất chuyển hóa có trong địa y cho thấy

có hoạt tính ức chế HIV-1 intergrase [14] Các β-orcinol depsidone như:

virensic acid (16) được phân lập từ Alectoria tortuosa Merr., methyl ester

granulatine (17), tetrecylic stictic acid (18) và chloroparallic acid (21) tất cả đều cho thấy có hoạt tính ức chế HIV-1 intergrase tại IC50 là 3 µM Các orcinol depsidone như: physodic acid (22) và norlobaric acid (23) cùng với β-orcinol depsidone khác như: salazinic acid (19) và parellic acid (20) cũng có hoạt tính tại nồng độ µM

Physodic acid là một chất kết tinh không màu với nhiệt độ nóng chảy

199 – 202ºC Physodic acid tan tốt trong ethanol, diethyl ether và acetone, ít tan trong choloroform, benzene và hầu như không tan trong nước Hàm lượng

physodic acid trong địa y Pseudevernia furfuracea chiếm khoảng 3 – 5%

Lobaric acid (24) là một orcinol depsidone được phân lập từ Stereocaulon

alpinum Laur có khả năng ức chế 5-lipoxygenase ở bạch cầu của lợn tại IC50

là 7 µM [2] Ngoài ra, lobaric acid cũng có khả năng ức chế sự hình thành

cysteinyl – leukotrienos (chất trung gian gây viêm nhiễm và co cơ trơn ở người) với liều có hiệu lực là 5,5 µM [15]

Một depsidone có chứa chloro có nguồn gốc từ địa y như là pannarin (25), cùng với depside atranorin (9) cho thấy có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại các tác hại của ánh sáng UVA, UVB

CO 2 R Me

O

R2

O HO

O

Me

HO CHO O O

Me OMe

2.1.4.6 Dẫn xuất của dibenzofuran

Các hợp chất bắt nguồn từ địa y thuộc nhóm này có khối lượng phân tử thấp, usnic acid được nghiên cứu rộng rãi nhất Nhiều loại địa y được dùng để sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn vào đầu kỷ nguyên của thuốc kháng sinh trong những năm 1950 Nhiều chất chuyển hóa có nguồn gốc từ địa y cho thấy có khả năng chống lại các chủng trực khuẩn lao và vi khuẩn gram dương Trong

đó, usnic acid là kháng sinh mạnh [16]

Hoạt tính kháng lại Staphylococcus và Enterococcus trong ống nghiệm

của usnic acid cũng đã được xác nhận Usnic acid cũng nhạy cảm đối với loài

vi khuẩn Bacteroides và Clostridium Ngoại trừ có một vài sự khác biệt nhỏ đối với Enterococcus faecalis Đồng phân đối quang của usnic acid cũng cho

tác dụng kháng sinh tương tự Hơn nữa, trong một cuộc điều tra tính nhạy cảm

của các nhóm chất chuyển hóa có nguồn gốc từ địa y đối với Mycobacterium

aurum cho thấy, (+)-usnic acid (26) được cô lập từ Cladonia arbuscula (Wallr) Rabenh [17] có hoạt tính kháng lại Mycobacterium là cao nhất Tuy nhiên, khả năng kháng lại Mycobacterium của (+)-usnic acid còn thấp hơn so với các thuốc kháng vi khuẩn lao như rifampicin và streptomycin Ngoài ra, usnic acid được xem như một chất có tác dụng hạ sốt, giảm đau

Usnic acid là một chất kết tinh, hình kim, màu vàng Nhiệt độ nóng chảy

184 – 185ºC Usnic acid tan tốt trong benzene, chloroform, alcohol, acetic acid băng Tan ít trong ethanol, petroleum ether, diethyl ether, không tan trong nước Hàm lượng usnic acid trong địa y chiếm khoảng 2% (Cladonia sylvatica) đến

4% (Alectoria achroleuca).

Me O HO

O

Me O O Me OH

(+)- Usnic acid (Diphenyl ether) 26

2.1.4.7 Anthraquinone, naphthoquinone và các hợp chất liên quan

Anthraquinone, xanthone và chromone là các hợp chất màu có ở phần vỏ của địa y Anthraquinone phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là một nhóm đặc biệt nổi bật trong thực vật bậc cao và nấm Ngoài ra, chúng là thành phần quan trọng của địa y [18-19] Anthraquinone được quan tâm như các thuốc kháng virus HIV Đặc biệt, hypericin (27) được dùng như dược phẩm vì hoạt tính kháng virus mạnh [20] Các dẫn xuất 7,7'-dichlorohypericin (28) cũng như anthraquinone 5,7-dichloroemodin (31), cả hai đều được cô lập từ địa y

Heterodermia obscurata, cho thấy có hoạt tính ức chế lại virus Herpes simplex

tuýp 1 [21] Emodin (29), 7-chloroemodin (30) và 7-chloro-1-O-methykemodin

(32) cũng cho thấy có khả năng làm bất hoạt một phần của virus Hoạt tính kháng virus tăng khi tăng nhóm thế chloro trong nhân anthraquinone [21] Hơn nữa, các dẫn xuất emodin (29) và chrysophanol (33), được tìm thấy

trong Asashinea chrysantha, thể hiện hoạt tính kháng ung thư chống lại tế bào

ung thư bạch cầu và kích thích sự hình thành phức hợp enzyme topoisomerase II-DNA tại liều dùng 0,5 – 60 µM Điều đáng quan tâm là, bên cạnh nhóm anthraquinone, các hợp chất thuộc nhóm anthrone cũng đã được tìm thấy trong một số loài địa y Ví dụ: khi có nhóm thế 2-chloro (35) và 2,4-dichloro (36) là dẫn xuất của emodin anthrone (34) Các chất trị vẩy nến như anthrone chrysarobin (37) là một dạng đơn giản của chryophanol 1,8-dihydroxy-

9(10H)-anthracenone là chất ức chế sự tăng sinh quá mức của tế bào và được

sử dụng làm thuốc kháng viêm mạnh trong điều trị bệnh vẩy nến [22]

Napthoquinone naphthazarin (38) là một trong các dẫn xuất được phân

lập từ Cetraria islandica, cho thấy có hoạt tính gây độc tế bào đối với tế bào

ung thư biểu bì và cũng là một chất ức chế mạnh dòng tế bào sừng ở người Vì vậy, nó được sử dụng như một chất trong điều trị bệnh vẩy nến Một dimer của

naphthazarin là pentacyclic hybocarpone (39), được phân lập từ Mycobiont có

khả năng gây độc tế bào tại IC50 0,27 µM [2] Ngoài ra, euplectin

naphthopyrone (40), một chất chuyển hóa từ loại địa y Flavoparmelia euplecta,

cũng có hoạt tính ở mức trung bình trong thử nghiệm này

2.1.4.8 Terpene và steroid

Terpene và steroid là sản phẩm của con đường chuyển hóa mevalonic acid Đây là những hợp chất đặc biệt xuất hiện nhiều ở địa y cũng như thực vật bậc cao

Me O

Me Me

Fukinanolide (Sesquiterpenoid)

Me

H Me

HO2C Me

CH2

(-)-Sandaracopimaric acid (Diterpenoid)

Me Me OH

Me

OH OH Me

Me Me

Me

Me Me

Me Me

HO

(Triterpen)

Ergosterol (Steroid)

2.2 Sơ lược về địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi

2.2.1 Tên gọi

Hình 2.3: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi

 Tên khoa học: Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi

 Tên gọi khác: Parmelia applanata, Placodium flavostramineum,

Lecanora flavostraminea, Parmelia redacta

2.2.2 Phân loại

Giới: Nấm

Phân giới: Ascomycota

Ngành: Pezizomycotina Lớp: Lecanoromycetes Thứ: Lecanorales Bộ: Lecanorineae Họ: Physciaceae

Chi: Dirinaria Loài: Dirinaria applanata

2.2.4 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chủ yếu của địa y Dirinaria applanata (Fée) D D

Awasthi là divaricatic acid Bên cạnh đó còn có atranorin, chloroatranorin, 3β-acetoxyhopane-1β,22-diol và một số loại terpen [23]

2.2.5 Phân bố

Loài địa y này phân bố xung quanh vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và mở rộng sang cả vùng ôn đới Nó xuất hiện trên vỏ cây, gỗ và đá từ khu vực ven biển đến rừng núi Thường được tìm thấy trên đảo Lord Howe và đảo Norfolk, một số đảo tại Thái Bình Dương, miền Bắc, Trung và Nam Mỹ, Châu Á và Châu Phi [23]

2.2.6 Đặc điểm

Đặc điểm đặc trưng của địa y Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi

là: các thùy gấp nếp, nằm liền kề nhau và sắp xếp dọc theo chiều gấp nếp với đỉnh, hình quạt Bào tử dạng bột màu trắng và tiết ra divaricatic acid [23]

2.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất trong cây

2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không

rỉ, bình có nắp đậy Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất

tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau [24]

2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (Liquid – liquid extraction)

Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc: dung môi có tính phân cực khác nhau (yếu, trung bình, mạnh)

sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực tương ứng với nó Đây là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất tan vào hai pha và hai pha lỏng này không

hòa tan vào nhau Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng Trong

đó, cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt bàng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần Với mỗi loại dung môi, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới chuyển sang dung môi khác [24]

2.4 Phương pháp làm khô mẫu

 Sấy khô bằng khí trơ trong máy cô quay chân không: khi cô quay chân không đến lúc mẫu đã khô hoàn toàn, cho một luồng khí trơ đi vào máy, đi nhè nhẹ từ đầu trên của máy cô quay (tại đầu trên của máy, chỗ đóng – mở áp suất

để tạo chân không cho máy, có một ống để châm dung dịch vào bình cô quay

mà không cần tắt ngưng máy, cho khí vào bằng ngõ này)

 Sấy khô bằng bình hút ẩm: mẫu cần làm khô được đặt trong một becher, miệng của becher được đậy bằng một tờ giấy lọc, trên bề mặt tờ giấy lọc tạo một số lỗ nhỏ Đặt becher vào bình hút ẩm, đậy nắp bình lại Cho máy bơm hút hoạt động cho đến khi thấy mẫu chất khô thì ngừng máy

2.5 Phương pháp kết tinh phân đoạn (Fraction recrystallization)

Trong một vài trường hợp đặc biệt, người ta có thể tách riêng một hợp chất ra khỏi hỗn hợp là nhờ vào độ tan khác nhau trong một dung môi nào đó,

kỹ thuật này được gọi là kết tinh phân đoạn

Thí dụ có một hỗn hợp gồm ba hợp chất A, B và C Giả sử có thể tìm một dung môi hòa tan vô hạn B và C ở bất kì nhiệt độ nào và chỉ hòa tan A bình thường Thực hành bằng cho hỗn hợp vào dung môi nóng, lọc nóng qua tờ giấy lọc Để yên cho dung môi nguội từ từ, hợp chất A sẽ kết tinh lại thành chất rắn (dĩ nhiên là có kết tinh lẫn theo nó một ít B và C), trong khi đó lượng lớn B và

C vẫn còn lại ở trong dung dịch Lọc để lấy riêng tinh thể A Thực hành việc kết tinh như thế thêm vài lần nữa bằng dung môi tinh khiết sẽ có tinh thể A tinh khiết

Thực hiện như thế có nhược điểm là hao hụt sản phẩm chính, có thể khắc phục bằng cách nhập hai lần dung dịch nước cái của lần kết tinh một và hai, cô quay để thu hồi hợp chất và thực hiện kết tinh lại

2.6 Phương pháp sắc ký

2.6.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

2.6.1.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ như: silica gel hoặc aluminium oxyde, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm

plastic Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy

Pha tĩnh: một lớp mỏng, thường khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp phụ, thí dụ như silica gel, Al2O3,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm placstic Chất hấp phụ dính trên tấm giá đỡ nhờ calcium sunfate khan, tinh bột hoặc một loại polymer hữu cơ Với chất hấp phụ là silica gel hoặc Al2O3, các hợp chất kém phân cực

sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm hoặc không

di chuyển Silica gel là chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất, silica gel

có cấu trúc hóa học như sau:

O O

Si O

O O

H H

H

Mẫu cần phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 – 5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi

di chuyển đi lên cao nhờ vào lực mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi Chất cần phân tích sẽ được phân bố trên pha tĩnh, sau đó cho pha động di chuyển ngang qua Tùy vào ái lực giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động

mà các cấu tử trong hỗn hợp chất sẽ được tách ra và di chuyển đến các vị trí khác nhau trên bản mỏng

Vị trí của mỗi cấu tử trên bản mỏng được tính bằng giá trị Rf

Bảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình sắc ký lớp mỏng

H2SO4đđ Vàng đậm đến da cam Flavon, Flavonol

H2SO4đđ Màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ Chalcon, Auron

 Đèn chiếu tia UV 254 nm: Ánh sang này để nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm

 Đèn chiếu tia UV 366 nm: Ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất có phát huỳnh quang Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bảng mỏng sẫm màu

Các chất khác nhau thường sẽ có giá trị Rf khác nhau trong cùng điều kiện thử Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định

Dung môi giải ly: nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại Dung môi không được quá

dễ bay hơi, thí dụ như diethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35ºC, gần bằng nhiệt

độ của phòng thí nghiệm vào mùa nóng (miền nam Việt Nam)

Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly Muốn thay đổi khả năng tách, người thay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly, thông thường ta sử dụng hệ hai dung môi

Nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha khi có sự thay đổi nhiệt độ

Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau tùy thuộc vào kinh nghiệm cá nhân, những hiểu biết về các đặc tính của chất cần phân tích sẽ giúp ích cho người nghiên cứu [24]

2.6.1.2 Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

a Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng một chiều

Dung môi chạy cùng một chiều từ đầu dưới bản mỏng lên đầu trên bản mỏng Lưu ý các vết mẫu chấm trên bản mỏng không được ngập vào dung môi trong bình triển khai vì mẫu chất sẽ bị khuếch tán ngay lập tức ra dung môi làm cho các vết bị lem

b Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hai chiều

Trong hợp chất phân tích có nhiều cấu tử nên kỹ thuật sắc ký một chiều không đủ độ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật sắc ký hai chiều để kết quả tách được rõ ràng hơn