Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Trên Cao Etyl Acetat Cây Rau Má Lá Sen (Hydrocotyl Bonariensis L.)

-Lọc, rửa tủa với nước cất Dung dịch nước Trầm hiện Dung dịch nước Trầm hiện PbSO4 -Tận chiết lỏng lỏng với C -Dung dịch Na2SO4-Lọc, rửa tủa với nước cất Dung dịch nước -Tận chiết lỏng l

KHOA CÔNG NGHỆ

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETYL ACETAT CÂY RAU MÁ LÁ SEN

Hydrocotyle bonarienasis L HỌ NGÒ

(APIACEAE)

MSSV: 2064027 Ngành: Công Nghệ Hóa Học-Khóa 32

Tháng 11/2010

Bộ môn Công nghệ hóa học -

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

PHIẾU ĐỀ NGHỊ ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP CHO SINH VIÊN

NĂM HỌC: 2010 – 2011

1 Họ và tên của cán bộ hướng dẫn

Ths Tôn Nữ Liên Hương MCB: 1410

2 Tên đề tài: Khảo sát thành phần hóa học trên cao Etyl acetat cây rau má

lá sen (Hydrocotyl bonariensis L.), họ Ngò (Apiaceae)

3 Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Hữu cơ Bộ Môn Hóa học – Khoa Khoa học tự nhiên – Trường Đại Học Cần Thơ

4 Số lượng sinh viên thực hiện: 01 sinh viên

5 Họ và tên sinh viên: Phan Thị Trinh MSSV: 206407

Lớp: Công Nghệ Hóa Học Khóa: 32

6 Mục đích của đề tài

Khảo sát thành phần hóa học trên cao etyl acetat cây hydrocotyl bonariensis

họ ngò

7 Các nội dung chính và giới hạn của đề tài

 Điều chế cao tổng bằng phương pháp ngâm dầm, điều chế các cao có tính phân cực tăng dần bằng kĩ thuật trích ly rắn lỏng sắc kí cột nhanh

 Sắc kí cột các phân đoạn cao để tinh chế các hợp chất

 Đo phổ xác định cấu trúc của hợp chất tinh chế được

8 Các yêu cầu hỗ trợ cho việc thực hiện đề tài

Các hóa chất để thực hiện

9 Kinh phí dự trù cho việc thực hiện đề tài: 250.000 đồng

Để có nhiều điều kiện phấn đấu hoàn thành luận văn, trước hết em xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến toàn thể quý thầy cô trong trường, trong khoa đặc biệt quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ hóa học khoa Công nghệ Quý thầy cô đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu trong những năm học tập rèn luyện tại trường và cả trên đường đời sau này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc trân trọng nhất đến cô Tôn Nữ Liên Hương

không chỉ tận tình hướng dẫn, chỉ bảo những kiến thức chuyên sâu trong nghiên cứu

và ứng dụng, mà còn tạo điều kiện động viên dìu dắt em bước qua giai đoạn khó khăn nhất để hoàn thành luận văn của mình Cô là cầu nối cho em hiểu biết thêm về

lĩnh vực Hợp chất thiên nhiên và nhiều kinh nghiệm cuộc sống

Em xin gửi lời ghi ơn đến quý thầy cô Bộ môn Công nghệ hóa học – Khoa Công nghệ đã tạo điều kiện truyền đạt những kiến thức chuyên ngành

Tôi xin cảm ơn tất cả các bạn trong lớp Công nghệ hóa học K32 đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập rèn luyện Đặc biệt các anh chị và các bạn trong nhóm thực hiện luận văn đã hỗ trợ rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài

Con xin khắc ghi công ơn trời biển của cha mẹ đã cho con đến trường, cho con hậu phương vững chắc để vững bước trên con đường tiếp cận tri thức khoa học Con xin hứa sẽ phấn đấu nhiều hơn nữa để đạt được nhiều thành công hơn nữa trong tương lại

Xin chân thành cảm ơn!

Phan Thị Trinh

Bộ Môn: Công nghệ Hóa học

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ths Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học trên cao etyl acetat cây rau má lá

sen (Hydrocotyle bonariensis L.), họ Ngò (Apiaceae)

3 Sinh viên thực hiện: Phan Thị Trinh MSSV: 2064027

Lớp Công nghệ Hóa học – Khóa 32

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN:

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2010

Cán bộ hướng dẫn

Tôn Nữ Liên Hương

Bộ Môn: Công nghệ Hóa học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1 Cán bộ chấm phản biện:

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học trên cao etyl acetat cây rau má lá

sen (Hydrocotyle bonariensis L.), họ Ngò (Apiaceae)

3 Sinh viên thực hiện: Phan Thị Trinh MSSV: 2064027

Lớp Công nghệ Hóa học – Khóa 32

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2010



Xuất phát từ sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và nhu cầu của con người, các biệt dược đi từ nguồn tổng hợp làm giảm tác dụng miễn dịch và nhiều tác dụng phụ khác, nên xu hướng hiện nay là tìm các hoạt chất thiên nhiên từ nguồn thảo mộc có tác dụng như thuốc tổng hợp nhưng ít độc và dễ dung nạp, nhất là đối với người cao tuổi và người có bệnh mạn tính Để ứng dụng tốt hơn hoạt chất thiên nhiên thì việc tìm hiểu về thành phần hóa học là cần thiết Ngoài việc nghiên cứu biết rõ tổng thể từng nhóm chất thì việc làm rõ thành phần cũng như nhận danh cụ thể từng hợp chất là nhu cầu rất quan trọng Đó cũng chính là nhiệm vụ của ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Thuộc khu vực nhiệt đới nên Việt Nam có nguồn thực vật rất phong phú và đa dạng và được con người sử dụng để làm thức ăn, chữa bệnh Trong đó cây rau má là loài cây rất thân thuộc, chúng hiện diện ở khắp nơi từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi Theo Trung y, rau má có tính hàn (lạnh), tân (cay), khổ (đắng) Khi ăn ở dạng tươi như một loại rau, người ta cho rằng nó giúp cho việc duy trì sự trẻ trung Nước sắc từ lá rau má được coi là có tác dụng hạ huyết áp Loại nước sắc này cũng được coi là một loại thuốc bổ dưỡng để có sức khỏe tốt (tăng trí nhớ, thị lực) Loại thuốc đắp từ lá cũng được dùng để điều trị những chỗ đau, hạ sốt Nó còn được dùng trong điều trị các chứng phù, viêm thanh quản, tĩnh mạch, phế quản, các bệnh trĩ, phong, eczema hay vẩy nến, giải ngộ độc sắn và lợi tiểu Tuy nhiên rau má lá sen là loài mới phát hiện gần đây, chưa có nghiên cứu hóa học nào

Nhằm góp một phần nhỏ vào nghiên cứu khoa học, chúng em chọn đề tài

“Khảo sát thành phần hóa học cao etyl acetat cây rau má lá sen hydrocotyl bonariensis L thuộc họ ngò (Apiaceae)” để thực hiện

PHIẾU ĐỀ NGHỊ ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP CHO SINH VIÊN i

LỜI CẢM ƠN ii

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN iii

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN iv

LỜI MỞ ĐẦU v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ PHỤ LỤC x

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TỪ xi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT 1

1.1 Sơ lược về chi Hydrocotyle 1

1.2 Giới thiệu về rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis L 3

1.2.1 Tên gọi và phân loại 3

1.2.2 Đặc điểm, xuất xứ và phân bố 3

1.2.3 Thành phần hóa học 4

CHƯƠNG 2 GIỚI THIỆU Về STEROID GLYCOSID 5

2.1 Steroid 5

2.2 Glycosid 7

2.2.1 Khái niệm về glycosid 7

2.2.2 Phân loại glycosid 8

2.2.3 Lý tính của glycosid 9

2.2.4 Steroid glycosid 9

2.2.4.1 Glycosid trợ tim 9

2.2.4.2 Saponin 10

2.2.5 Quy trình tách chiết glycosid ra khỏi cây 10

2.2.6 Phương pháp thủy giải glycosid 12

2.2.6.3 Thủy phân bằng dung dịch kiềm 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Dụng cụ 14

3.2 Hóa chất 14

3.3 Phương pháp sắc kí 14

3.3.1 Phương pháp sắc kí cột 14

3.3.1.1 Chuẩn bị cột sắc kí 14

3.3.1.2 Giải ly sắc kí cột pha thường 16

3.3.1.3 Theo dõi quá trình giải ly cột sắc kí 16

3.3.2 Sắc kí lớp mỏng 17

3.3.2.1 Nguyên tắc 17

3.3.2.2 Giải ly bản mỏng 18

3.4 Phương pháp chuẩn bị cao 19

3.4.1 Dung môi 19

3.4.1.1 Dung môi để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây 19

3.4.1.2 Lựa chọn dung môi để chiết tách 20

3.4.1.3 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất 20

3.4.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây 21

3.4.2.1 Kỹ thuật chiết rắn lỏng 21

a Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 21

b Kỹ thuật chiết ngâm dầm 22

c.Kỹ thuật chiết bằng máy Soxlet 23

3.4.2.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng 24

3.5 Phương pháp xác định cấu trúc 27

4.1.2 Điều chế cao metanol tổng 29

4.1.3 Điều chế cao PE 30

4.1.4 Điều chế cao DC 30

4.1.5 Điều chế cao Ea 30

4.1.6 Điều chế cao Me 30

4.2 Sắc kí cột cao Ea3 32

4.2.1 Khảo sát phân đoạn Ea3.3 33

4.2.2 Biện luận cấu trúc của Ea8 36

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 49

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 59



Hình 1.1 Một số cây thuộc chi Hydrocotyle Trang 2

Hình 1.2 Lá và hoa Hydrocotyle bonariensis 3

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tách chiết glycosid ra khỏi cây 11

Hình 3.4 Triển khai SKLM 18

Hình 3.5 Cách tính giá trị Rf 19

Hình 3.6 Kỹ thuật chiết ngâm dầm 22

Hình 3.7 Kỹ thuật chiết bằng máy Soxhlet 23

Hình 3.8 Bình lóng 24

Hình 3.9 Sơ đồ tổng quát quá trình điều chế các cao 26

Hình 4.10 Sắc kí cột nhanh 29

Hình 4.11 Sơ đồ điều chế cao bằng phương pháp trích ly rắn lỏng sắc kí cột nhanh 31

Hình 4.12 SKLM cao Ea được giải ly trong Ea:Me = 9:1 32

Hình 4.13 SKLM kết quả xử lý Ea3.12 35

Hình 4.14 SKLM hợp chất Ea8 35

Hình 4.15 SKLM Ea8 với 3 hệ dung môi khác nhau 35

Hình 4.16 Tinh thể của hợp chất Ea8 35

Hình 4.17 Cấu trúc hỗn hợp hợp chất Ea8 45



Bảng 1: Kết quả khảo sát cao Ea3 33 Bảng 2: Kết quả xử lý phân đoạn Ea3.3 34 Bảng 3: Kết quả phổ 13C-NMR spinasterolglycosid 37 Bảng 4: So sánh số liệu phổ của spinasterol glycosid với tài liệu [13] và [14] 39 Bảng 5: Kết quả phổ 13C-NMR stigmasterol glycosid 41

Bảng 6: So sánh số liệu phổ của stigmasterol glycosid với tài liệu [15] và [19] 43 Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất Ea8 49 Phụ lục 2: 13C-NMR của hợp chất Ea8 53 Phụ lục 3: Phổ DEPT của hợp chất Ea8 56

PE Eter dầu hỏa

1.1 Sơ lược về chi Hydrocotyle [8]

Chi Hydrocotyle, tập hợp hơn 30 loài, có đặc điểm chung là cây thảo, sống

nhiều năm, vùng phân bố rộng Ở Việt Nam, người dân quen gọi là rau má và có

hơn mười loài Hydrocotyle asiatica, Hydrocotyle chevalieri (Chern) Tard,

Hydrocotyle chinensis (Dunn) Craib, Hydrocotyle nepalensis Hook, Hydrocotyle petelotii Tard, Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss, Hydrocotyle siamica Craib, Hydrocotyle sibthorpioides Lamk, Hydrocotyle tonkinensis Tard, Hydrocotyle wilfordii Maxim

Những loài cây thuộc chi Hydrocotyle rất dễ sống ở các vùng đất ẩm, có

bóng râm, khí hậu mát mẻ, có thể sống cả trong môi trường nước và đặc biệt có loài sống được trong môi trường đất cằn, ngay cả nước mặn chúng cũng có khả năng sinh sống và phát triển (những loài này có ở Hà Tiên, Ninh Thuận…) Trong đó,

Hydrocotyle asiatica L và Hydrocotyle sibthorpioides (rau má lá nhỏ) là hai loài

thường gặp nhất và rất quen thuộc với người dân Việt Nam

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện thêm vài loài mới xuất hiện Dược

sĩ Phan Đức Bình, phó biên tập của Tạp chí thuốc và sức khỏe Thành phố Hồ Chí Minh đã định danh hai loài rau má có hình dạng khác biệt so với rau má thường là

lá giống lá sen, phát hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, đó là Hydrocotyle

bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L thường quen gọi là rau má Thái, rau má

Nhật Do đó tiến hành khảo sát thành phần hóa học trên cây Hydrocotyle

bonariensis, loài cây mới phát hiện, là mục tiêu chủ yếu của đề tài

Hydrocotyle asiatica Hydrocotyle verticillata Thunb

Hình 1.1 Một số cây thuộc chi Hydrocotyle

1.2 Giới thiệu về rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis L

1.2.1 Tên gọi và phân loại

Tên khoa học: Hydrocotyle bonariensis L

Tên khác: Penywort, large leaf penywort paraguita, rau má lá sen

1.2.2 Đặc điểm, xuất xứ và phân bố

Hydrocotyle bonariensis L là loại cây sống dễ trong nước, nơi ẩm ướt, đất cát,

và cả môi trường khô Cây thuộc loại cỏ lưu niên nhẵn, dạng thân rễ mọc bò, tại mỗi đốt có nhiều rễ và cho ra 1 – 2 lá vươn thẳng lên từ cọng lá Lá mỏng, hình lọng, phiến tròn, rộng, có thùy cạn, mép lá khía tai bèo, cuống lá mọc ở giữa Hoa nhỏ, năm cánh, có màu trắng hoặc vàng kem, tán hoa đường kính 1 – 6 cm gồm nhiều tia

Hình 1.2 Lá và hoa

Hydrocotyle bonariensis

tụ tạo thành vòng tròn, cây ra hoa từ mùa xuân đến đầu mùa thu Quả hình bầu dục, dày 0,5 – 2 cm, rộng 2,5 – 3 mm, đáy và đỉnh có khía sống lưng và phần bên gân nổi rõ Xuất xứ từ Nam Mỹ, gần đây phát hiện mọc hoang ở Việt Nam

1.2.3 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về cây Hydrocotyle bonariensis L chỉ mới tập trung về đặc

điểm sinh thái của cây Trong báo cáo về sinh hóa có ghi nhận về khả năng hấp thụ muối NaCl của lá cây này ở những vùng đất mặn có ảnh hưởng đến hàm lượng

chlorophyl và làm thay đổi hàm lượng protein trong lá So với cây Foeniculum

vulgare L thì cây Hydrocotyle bonariensis L nhận NaCl nhiều hơn Chưa có sự

nghiên cứu nào về thành phần hóa học trên loài cây này (ngoài nhóm nghiên cứu của cô Th.s Tôn Nữ Liên Hương)

2.1 Steroid [1], [4], [5]

Steroid là những hợp chất thiên nhiên có chung đặc điểm cấu tạo phân tử có chứa hệ vòng cyclopentanoperhyphenantren hoặc trong trường hợp rất hiếm là sự biến đổi của hệ vòng đó Phép phân tích tia X cho thấy các phân tử steroid dài và mỏng, điều phù hợp với cấu hình vòng B và C ở vị trí trans với nhau, còn A/B, C/D

có thể cis hoặc trans Tất cả các steroid bão hòa thuộc 2 loại là cholestan và

coprostan Khung cholestan là sự kết hợp A/B trans, B/C trans, C/D trans, được gọi

là allo Khung coprostan là sự kết hợp A/B cis, các vòng khác là trans gọi là

normal

Steroid có nhiều trong thiên nhiên như: các sterol, các nội tiết tố (hormon) như nội tiết tố sinh dục, axít mật, hormon tuyến thượng thận, các glycosid, đặc biệt là glycosid trợ tim, các sapogenin,…

Sterol là những alcol có nguồn gốc động vật hoặc thực vật, có cấu trúc từ

27-29 nguyên tử cacbon và một nhóm thế alkyl mạch nhánh ở C17 Sterol phân bố rất rộng, thường có mặt song song với alkaloid hoặc saponinsterol Chúng được tìm thấy trong động vật có xương sống, không xương sống và sau đó được tìm thấy trong thực vật Nhóm sterol động vật (zoosterol): cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan--ol, desosterol, coprostanol, cerebrosterol, lathosterol

Nhóm sterol của động vật biển không xương sống: spongesteol, clionasterol, 24-methylencholesterol, fucosterol

Nhóm sterol thực vật (phytosterol): sitosterol (có các đồng phân α, β), stigmasterol, α-spinasterol, brassicasterol Các sterol thực vật có trong tất cả các

bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu, dưới dạng tự do, ester hoặc ở dạng glycosid

Nhóm sterol nấm men: ergosterol, zymosterol, acosterol

DCBA

1 2 3

8

9 10 11

12 13

16 17

Các hormon trong cơ thể người, và trong các động vật khác cũng đã được nghiên cứu Sinh tố D cũng là một hợp chất steroid

Các steroid có tác dụng đặc biệt đối với cơ tim thường tồn tại dưới dạng glycosid, trong tự nhiên gọi là các glycosid trợ tim

Các sapogenin steroid phân lập chủ yếu từ sự thủy phân glycosid thực vật còn gọi là saponin

Các sterol trong thiên nhiên

Khả năng hấp thụ của phytosterol là 2-5% so với cholesterol là 60%, nhưng có cấu trúc tương tự nhau nên phytosterol ức chế hấp thụ cholesterol ở ruột và làm giảm nồng độ của chất béo này trong máu Do đó phytosterol có tác dụng chống xơ vữa động mạch, chống viêm, chống sự oxy hóa Ngoài ra phytosterol còn có tác dụng chuyển hóa cholesterol nên giảm nguy cơ với bệnh tim, mạch vành, kiềm hãm

sự phát triển của tế bào ung thư, kháng nấm [16], [17]

2.2 Glycozit [1], [4], [21]

2.2.1 Khái niệm về glycosid

Glycozit là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, chất tạo thành do sự ngưng tụ giữa một phần là đường và một phần không phải là đường, được gọi là

“heterosid” Phần đường, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin Phần đường

và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid

dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzim (men) có chứa trong cây Phần aglycon của glycosid rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất thiên nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid, quinonoid, polyphenol…

Phần đường trong glycosid chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose Tác dụng của các glycosid lên cơ thể phụ thuộc vào phần aglycon và phần đường làm tăng hoặc giảm tác dụng của chúng

O H

OH

H

OH H

OH

H

OH H

OH

CH2OH

H

OAr(R)

Một số glycozit

2.2.2 Phân loại glycosid

Phân loại glycosid dựa theo phần đường và phần aglycon

Phân loại theo tên của đường: tùy theo nhóm glycon mà glycozit có tên gọi tương

ứng như glucozit, rhamnozit, galactozit, rutozit…

Phân loại theo mạch đường: phần glycon gồm một hoặc nhiều đơn vị đường nối với nhau theo di hoặc trisaccarid Nếu aglycon có 2 nhóm OH trở lên thì có diglycozit

hay bidesmozit (desmos có nghĩa là mạch)

Phân loại theo dây nối aglycon-đường: phần đường và phần không đường của các

glycozit thường nối với nhau bằng các cầu nối: O-glycozit, S-glycozit, N-glycozit,

C-glycozit Một số trường hợp phần đường và không đường liên kết với nhau bằng

dây nối ester, loại này được gọi là pseudoglycozit

Phân loại theo cấu trúc của aglycon: Hệ thống phân loại thường dùng hiện nay là phân loại theo cấu trúc của phần không đường Dựa vào cấu trúc của phần không đường người ta chia thành các nhóm chất như: steroid glycozit, terpenoid glycozit, polyphenol glycozit, alkaloid glycozit,…

Spirostan

O O

Sitosterol glucopyranozit

O O

H

OH

OH H

H HO HO

CH3

2.2.3 Lý tính của glycozit

Kết tinh, dạng vô định hình hoặc lỏng sánh Đa số không màu (trừ anthraglycozit có màu đỏ, flavonoid có màu vàng), có vị đắng Aglycon thân dầu nên ít tan trong nước Ở dạng glycozit dễ tan hơn, nhờ phần đường, nên tan được trong dịch tế bào

do vừa có tác dụng trên dây thần kinh phế vị, vừa làm giảm tính tự động của nút xoang, giảm dẫn truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất, tính kích thích của cơ tâm nhĩ cũng giảm Ngược lại, glycozit trợ tim làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất, gây lợi tiểu nhẹ do giảm tái hấp thu natri ở ống lượn gần

Sự hấp thu glycozit qua dạ dày, ruột non phụ thuộc vào số lượng nhóm -OH của aglycon Một điển hình cụ thể như sau digitoxin có 1 nhóm -OH dễ hấp thu qua đường tiêu hóa, tích luỹ trong cơ thể Còn ouabain có 5 nhóm -OH, khó hấp thu qua đường tiêu hóa nên tiêm tĩnh mạch được thải trừ nhanh Đa số glycozit tim có vòng

A/B là cis, A/B ít gặp hơn Người ta ghi nhận là nếu vòng A/B có cấu tạo trans thì hoạt tính giảm hơn so với cấu tạo cis

Glycozit tim

O O

Duong-O

Ouabain

CH2OH OH

OH Duong-O

OH

OH

O O

2.2.4.2 Saponin

Saponin là một glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng là khi hòa vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt, có tính phá huyết vì làm vỡ hồng cầu Saponin thường ở dạng

vô định hình, có vị đắng, khó tinh chế có điểm nóng chảy thường cao hơn 2000C trở lên và có thể cao hơn 3000C Saponin bị tủa bởi chì, hydroxid barium,… có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin

2.2.5 Quy trình tách chiết glycozit ra khỏi cây

Cấu trúc hóa học của glycozit rất đa dạng nên tính chất phân cực của mỗi phân

tử thay đổi tùy theo cấu trúc của aglycon và số phân tử đường gắn aglycon, vì thế không thể có một phương pháp chung nào cho tất cả các glycozit Các glycozit có tính phân cực khá mạnh, nên không tan trong ete dầu hỏa, hexan, benzen nhưng tan được trong cloroform, dietyl ete (các monoglycozit), tan tốt trong alcol, nước Người ta thường chiết glycozit bằng nước nóng, etanol, metanol hoặc hỗn hợp alcol-nước 50-90%

Trước tiên bột cây được loại béo bằng hexan hoặc ete dầu, bột cây còn lại

O O

O O

OH

H3C O O

H3C

OH

O O

H3C

OH

HO

một ít nước và được loại tạp bằng dung dịch acetate chì 20% Cũng có thể loại tạp bằng Pb(OH)2, Al(OH)3, Fe(OH)3 Lọc bỏ tủa Dung dịch nước trong này được cho thêm dung dịch nước bão hòa Na2SO4 để tủa acetate chì Lọc lấy phần nước trong Dung dịch nước này được làm khan với Na2SO4 hoặc MgSO4, rồi đuổi dung môi sẽ thu được cao

-Làm khan, thu hồi dung môi

(chứa chất béo, clorophyl, các

chất có màu,…)

Bột cây

Tận chiết với eter dầu hỏa để loại béo.

-Tận chiết với hỗn hợp etanol hoặc methanol-nước

Eter dầu hỏa Dung dịch nước alcol

-Dung dịch nước acetal chì 2-5% -Lọc, rửa tủa với nước cất

Dung dịch nước Trầm hiện

Dung dịch nước Trầm hiện PbSO4

-Tận chiết lỏng lỏng với C

-Dung dịch Na2SO4-Lọc, rửa tủa với nước cất

Dung dịch nước

-Tận chiết lỏng lỏng với Ea Dung dịch nước

-Tận chiết lỏng lỏng với n-butanol

Dung dịch C -Làm khan, thu

hồi dung môi

-Làm khan, thu hồi dung môi Polyglycosid Polyglycoside Polyglycosid monoglycosid

Glycosid toàn phần

-Làm khan, thu hồi dung môi

(chứa chất béo, clorophyl, các

chất có màu,…)

Bột cây

Tận chiết với eter dầu hỏa để loại béo.

-Tận chiết với hỗn hợp etanol hoặc methanol-nước

Eter dầu hỏa Dung dịch nước alcol

-Dung dịch nước acetal chì 2-5% -Lọc, rửa tủa với nước cất

Dung dịch nước Trầm hiện

Dung dịch nước Trầm hiện PbSO4

-Tận chiết lỏng lỏng với C

-Dung dịch Na2SO4-Lọc, rửa tủa với nước cất

Dung dịch nước

-Tận chiết lỏng lỏng với Ea Dung dịch nước

-Tận chiết lỏng lỏng với n-butanol

Dung dịch C -Làm khan, thu

hồi dung môi

-Làm khan, thu hồi dung môi Polyglycosid Polyglycoside Polyglycosid monoglycosid

Glycosid toàn phần

2.2.6 Phương pháp thủy giải glycozit

Rất khó xác định cấu trúc của glycozit bằng phương pháp phổ nghiệm, đối với hợp chất glycozit có nhiều phân tử đường gắn vào aglycon, vì các proton –CH-OH hoặc cacbon –CH-OH của các phân tử đường cho các mũi cộng hưởng với độ dịch chuyển hóa học cùng tập trung vào một vùng, người ta thường thủy phân glycozit

để khảo sát riêng từng phần aglycon và phần đường

Có thể thủy phân glycozit bằng enzym hoặc bằng dung dịch acid Việc thủy phân bằng dung dịch acid tương đối phức tạp: tùy thuộc vào nồng độ của dung dịch acid, nhiệt độ, thời gian thủy phân sao cho có thể thủy phân triệt để mà đồng thời đảm bảo thời gian bảo toàn được cấu trúc aglycon không bị phá hủy hay biến đổi

Do cấu trúc của glycozit đa dạng: số phân tử đường của mỗi glycozit khác nhau, các nối hóa trị giữa đường- đường cũng như giữa aglycon- đường không giống nhau

vì thế không thể có một điều kiện chung nào cho các glycozit, phải xét từng trường hợp cụ thể

Trong nghiên cứu, trước khi tiến hành thủy phân một lượng lớn glycozit (cần phải có phổ NMR toàn thể glycozit để dự đoán trước cấu trúc của hợp chất) cần phải có bước nghiên cứu thăm dò với những lượng mẫu nhỏ Bắt đầu với nồng độ acid thấp và thời gian thủy phân ngắn và sẽ nâng dần lên cho đến khi đạt các thông

số tối ưu cho phản ứng thủy phân trên hợp chất cần khảo sát

Theo dõi quá trình thủy phân bằng SKLM Khi thực hiện SKLM phải chấm đồng thời trên cùng một bản: dung dịch đang thủy phân (khảo sát phản ứng theo thời gian), mẫu glycozit ban đầu và chất chuẩn aglycon, nếu có

2.2.6.1 Thủy phân bằng men (enzym)

Thông thường men thủy phân có sẵn trong cây tươi, đủ để tự thủy phân glycozit Để thực hiện thủy phân glycozit, người ta thường sử dụng enzym là β-glucosidase

(enzym lấy từ con sên Helix pomatia), cách tiến hành như sau: mẫu glycozit

(10mg), dung dịch đệm acid acetic- acetat natri pH = 4-5 (2ml), enzym glucosidase (10mg), nước cất (1ml) Ủ yên ở nhiệt độ phòng khoảng 28oC trong 1-2 ngày Theo quá trình thủy phân bằng SKLM Sau khi thủy phân hoàn tất, thêm vào 5ml nước cất chiết lỏng-lỏng với dietyl ete Lớp dietyl ete này được làm khan nước

β-và được đuổi dung môi ở áp suất thấp cho đến khô thu được aglycon Phần nước còn lại được làm đậm đặc để phân tích đường

2.2.6.2 Thủy phân bằng dung dịch acid (HCl, H 2 SO 4 )

Để cắt đứt nối của phần đường gắn vào aglycon qua nhóm –OH của aglycon, thu được aglycon và đường Nếu phần aglycon bền vững với acid, có thể sử dụng các dung dịch acid mạnh như dung dịch 5-18% HCl, dung dịch 5-70% H2SO4, với thời gian 5-6 giờ ở nhiệt độ 100oC Nếu phần aglycon dễ bị biến đổi với acid, cần sử dụng điều kiện nhẹ nhàng với CH3COOH 50% với thời gian 5-6 giờ, ở nhiệt độ

70oC hoặc tốt nhất là thủy phân bằng enzym

Thủy phân bằng dung dịch Kiliani: dung dịch acid gồm (HCl đậm đặc:

CH3COOH: H2O = 10:35:55) Với điều kiện thủy phân: 4mg hợp chất glycozit/ 1ml dung dịch acid Đun hoàn lưu trong một giờ, ở nhiệt độ 1000C Thêm vào một lượng nước gấp đôi, đuổi dung môi ở áp suất thấp cho đến khô Thực hiện như thế 2 lần để đuổi hết acid acetic Cắn còn lại được hòa vào một ít nước, thực hiện việc chiết lỏng – lỏng với cloroform thu lấy phần aglycon Phần còn lại được sử dụng để phân tích đường

Thủy phân theo phương pháp được đề nghị bởi Mizou Mizou: cho mẫu

glycosid (10mg) vào dung dịch HCl 10% trong metanol 50% (5ml) Đun hoàn lưu cách thủy trong 2-5 giờ Đuổi metanol Thêm một ít nước và chiết lỏng – lỏng với etyl acetat Phần etyl acetat được làm khan với Na2SO4 và đuổi dung môi ở áp suất thấp thu được aglycon Phần nước còn lại được trung hòa bằng cách cho thêm

Na2CO3 hoặc BaCO3 cho đến khi pH trung tính Lọc, dung dịch qua lọc được cô đặc

để phân tích đương

2.2.6.3 Thủy phân bằng dung dịch kiềm

Để cắt đứt các nối ester hoặc nối của đường với aglycon ngang qua nhóm chức ester của aglycon, thu được aglycon-COOH và đường Cho mẫu glycozit (10mg) vào dung dịch 5% NaOH (10ml) Đun hoàn lưu trong 2-5 giờ Thêm 5ml nước cất

và acid hóa với HCl 1N đến pH = 6 Chiết lỏng – lỏng với butanol, phần butanol được làm khan nước với Na2SO4 và đuổi dung môi ở áp suất thấp thu được aglycon – COOH Lớp nước được cô đặc để phân tích đường

là cột hấp phụ Chất hấp phụ thường được sử dụng là silica gel, oxyt nhôm, CaCO3, than hoạt tính, polyamid, pha động là các dung môi hữu cơ với nhiều tỷ lệ khác nhau, việc tìm hệ dung môi dựa vào SKLM Thông thường người ta nạp silica gel vào cột dưới dạng sệt (nạp ướt) do silica gel có khả năng trương nở khi bị solvat hóa

Các vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel là nhóm silanol, mỗi nhóm cách nhau 5amstrong Muốn điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel chỉ cần thêm hoặc loại bớt nước Khi silica gel hấp phụ nước, các phân tử nước sẽ che khuất những vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel làm hạt giảm hoạt tính, muốn tăng hoạt tính trở lại của silica gel chỉ cần đun nóng để loại bỏ nước

Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol –OH, đây

là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chất được sắc kí Do đó các hợp chất hữu cơ phân cực (có mang nhóm chức –OH, NH2, -COOH, ) bị giữ chặt trong cột và bị giải ly ra muộn hơn so với những chất kém phân cực như alcan, terpen (là những chất không có những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị giữ lại sẽ ra muộn hơn

Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher sạch ở bên dưới cột, dung môi này được rót trả lại lên đầu cột

Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột

Trọng lượng chất phân tích

Tỷ lệ = Trọng lượng chất hấp phụ

Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để cột được nạp chặt hơn, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất

Trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, luôn luôn phải có dung môi phủ trên phần đầu cột

Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp phụ ở đầu cột phải nằm ngang Nếu mặt thoáng không nằm ngang phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn một phần chất hấp phụ ở trên đầu cột, để yên, chất hấp phụ lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng, để đảm bảo việc tách các chất được đồng đều Để cột ổn định trong một khoảng thời gian, sau đó mới tiến hành nạp mẫu vào đầu cột

Trước khi nạp mẫu vào cột cần trộn một ít chất hấp phụ và sấy khô để mẫu chất phân bố đều Hòa mẫu chất đã tiền hấp phụ với một lượng tối thiểu dung môi, cho vào đầu cột một cách đều đặn bằng pipeet được rây đều trên thành cột sắc kí Quá trình nạp mẫu được xem là kết thúc khi dung môi trên đầu cột sắc kí trong suốt

3.3.1.2 Giải ly sắc kí cột pha thường

Giải ly cột với các dung môi có độ phân cực tăng dần để đuổi các chất ra khỏi cột theo thứ tự độ phân cực tương ứng Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực cao hơn vào dung môi cũ đang sử dụng Nếu tăng tính phân cực nhanh thì sẽ làm gãy cột Nguyên nhân do chất hấp phụ khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi bị quá nhiệt cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách chất không tốt

Vận tốc chảy của dung môi rửa cột cũng phải điều chỉnh cho phù hợp, không được quá nhanh vì dung môi không kịp cân bằng với chất hấp phụ, cũng không được quá chậm hoặc cho ngừng lại một thời gian sẽ làm cho chất tan bị khuếch tán ảnh hưởng đến hiệu quả tách

Khi sử dụng dung môi giải ly là Me hoặc nước, hai loại dung môi này có thể hòa tan một lượng nhỏ silica gel khiến cho dung dịch giải ly hứng được có chứa một ít silica gel, gây hiểu lầm là hợp chất thu được Silica gel dễ dàng hòa tan trong nước pH<7

3.3.1.3 Theo dõi quá trình giải ly cột sắc kí

Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột

có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau,

cột Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau

Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự Dung dịch trong những lọ hứng được sẽ được SKLM trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có kết quả SKLM giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn, cô quay đuổi dung môi ở áp suất kém thu được các cao của phân đoạn đó

3.3.2 Sắc kí lớp mỏng

3.3.2.1 Nguyên tắc

Sắc ký lớp mỏng (hay sắc ký bản mỏng) còn gọi là sắc ký phẳng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ như silica gel G hoặc oxit alumin Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic nhờ sulfat canxi khan, tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ Trong silica gel thương phẩm, nếu có tiếp vị ngữ

“G” nghĩa là silica gel có trộn thêm chất kết dính sulfat calci nửa phân tử nước [CaSO4(0,5H2O)] Sự hiện diện của ion calci hầu như không cản trở quá trình sắc

kí, thường trộn với chất kết dính với tỉ lệ 10% Các tấm bản mỏng silica gel tráng sẵn thường trộn thêm chất phát huỳnh quang, được ghi trên hộp là silica gel 60 F254

Bình sắc ký là một chậu, hũ, lọ… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng nhưng

có nắp đậy để dung môi bão hòa, ổn định trong bình Pha tĩnh là một lớp mỏng khoảng 0,25 mm

Mẫu chất phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau, nhờ một ống vi quản sử dụng khoảng 1µl dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, , được đưa lên lớp pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình sắc ký

Pha động là dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản, mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với một vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các tương tác với pha tĩnh và pha động của các thành phần trong mẫu chất Đối với pha tĩnh là silica gel các chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các chất phân cực sẽ

di chuyển chậm

3.3.2.2 Giải ly bản mỏng

Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng

Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu Cần sử dụng bình nhỏ nhất có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình Mực dung môi không được cao hơn vị trí chấm mẫu trên bản mỏng

Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất, để quá trình bão hòa dung môi được nhanh người ta phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc

Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung môi giải ly khoảng 0,5-1 cm Hệ dung ly phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,6

Hiện hình các vết sau khi giải ly

Sử dụng máy soi UV ở các bước sóng 254 và 365 nm

Nhúng bản mỏng trong dung dịch 20% H2SO4 trong metanol Sau đó hong khô

hơ bản mỏng trên bếp điện ở nhiệt độ khoảng 110oC đến khi các vết hiện rõ

Các vết chấm mẫu trên bản mỏng

Bình triển khai sắc ký Nắp đậy bình

Hình 3.4 Triển khai SKLM

3.4 Phương pháp chuẩn bị cao [4]

Trong cây cỏ có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ không phân cực đến phân cực, vì thế muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc kí cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn Do đó thường cần phải chuẩn bị một loạt cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết tương đối ít hợp chất, giúp cho quá trình cô lập chất dễ dàng hơn Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan vào nhau”, dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực

3.4.1 Dung môi

3.4.1.1 Dung môi để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây

Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử (polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào vi sinh vật) tương đối trơ, không hoà tan trong dung môi hữu cơ Vì thế, việc khảo sát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu

có mức độ phân cực khác nhau, nhưng đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất có tính

ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các

Tiền tuyến dung môi

Mức xuất phát

a

b

Hình 3.5 Cách tính giá trị Rf

a

Đoạn đường di chuyển của hợp chất Đoạn đường di chuyển của dung môi

Rf = a

=

loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng metanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

* Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tuỳ thuộc vào đặc tính của chất có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cô lập Các hợp chất tự nhiên có cấu trúc và

độ phân cực khác nhau nên chưa có một quy trình tổng quát nào áp dụng cho tất cả các nhóm, mà mỗi nhóm có một số quy trình chiết tách đặc trưng Vì vậy, trước khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn được quy trình phù hợp

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-40C vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại các hợp chất kém bền nhiệt

Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hoà tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể được loại

bỏ dễ dàng Cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như dietyl ete, carbon tetraclorua… Trường hợp cần khảo sát đối với một

số nhóm chất đặc biệt có thể sử dụng dung môi có điều chỉnh pH (trong trường hợp chiết alkaloid, flavonoid…) Khi sử dụng các dung môi dễ cháy cần phải thực hiện

ở một nơi có điều kiện phòng cháy chữa cháy tốt và cách ly với các phòng thí nghiệm khác

3.4.1.3 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất

Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai, lọ bằng thủy tinh để tránh lẫn các tạp chất, thường là chất hóa dẻo do chứa trong các thùng nhựa Cloroform, diclorometan có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid như brucin, strychnin, ephedrine… để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác Tương tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước, sự đồng phân hoá cho vài hợp chất hữu cơ

Dietyl ete ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp, dễ cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxid dễ gây nổ Peroxid này rất hoạt tính, có thể oxid hoá các hợp chất có mang nhiều nối đôi liên

3.4.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết Soxhlet… Ngoài ra, còn có thể chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (lưu chất siêu tới hạn), chiết có sự hỗ trợ của vi sóng

3.4.2.1Kỹ thuật chiết rắn lỏng

a Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp

Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy

bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng

để chứa dung môi tinh khiết

Cách tiến hành: Bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu được xay quá mịn sẽ có tính nhầy nhựa hoặc

có thể trương nở… sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột

Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên sau một thời gian, thường là 12-24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này Hiệu quả phương pháp: So sánh với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết

b Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không

gỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất có chứa trong cây

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đều xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên

ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một

số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Chúng ta có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung

ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến khi đạt mức bão hòa, không thể thêm được nhiều hơn nên có ngâm lâu cũng chỉ làm mất thời gian

Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau

Hình 3.6 Kỹ thuật chiết ngâm dầm

c Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet

Máy có bán sẵn với nhiều kích cỡ khác nhau, từ bình cầu 250 mL đến 15 L

Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong ống D hoặc tốt nhất là đặt trong một túi vải để dễ lấy bột cây ra khỏi máy Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D

để tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E Không được để lượng bột cây trong ống D cao vượt hơn mức cong của ống thông nhau E

Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài (2), như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (thể tích dung môi trong bình cầu không được vượt quá 2/3 thể tích bình cầu)

Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Khi dung dịch trong bình cầu sôi, dung môi tinh khiết sẽ bốc hơi sao đó theo ống B lên cao hơn rồi theo ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột cây Dung môi ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E vì đây là ống thông nhau Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô

tả lúc đầu Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây

Hình 3.7 Kỹ thuật chiết bằng máy Soxhlet

Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi thu được cao chiết

Khi thực hiện chiết với dung môi có nhiệt độ sôi thấp, phòng thí nghiệm ở xứ nóng, cần lưu ý xem ống ngưng hơi có đủ sức làm ngưng tụ hơi hay không Nếu thấy đầu trên cao của hệ thống ngưng hơi có khí bốc ra, cần tìm cách nối dài thêm ống ngưng hơi nhưng không làm ống bị bít

Ưu điểm của kỹ thuật: Tiết kiệm dung môi, chỉ một lượng ít dung môi mà chiết kiệt được mẫu cây Không tốn công lọc và châm dung môi mới, chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu là máy sẽ thực hiện sự chiết Chiết kiệt hợp chất trong bột cây vì bột cây luôn được liên tục chiết bằng dung môi tinh khiết

Nhược điểm: Kích thước máy Soxhlet làm giới hạn lượng bột cây cần chiết Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột cây được trữ lại trong bình cầu A nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi, vì thế nếu có hợp chất nào kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị hư hại Do toàn bộ hệ thống của máy đều bằng thủy tinh và được gia công thủ công nên giá thành một máy khá cao, dễ vỡ

3.4.2.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với metanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Người ta dùng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau