Khảo sát thành phần hóa học cây cành giao euphorbia tirucalli l thu hái ở tỉnh bình thuận

Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cây cành giao với mong muốn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần nâng cao g

CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L

GVHD : TS Bùi Xuân Hào

ThS Dương Thúc Huy SVTH : Lê Thị Kim Dung

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L

GVHD : TS Bùi Xuân Hào ThS Dương Thúc Huy SVTH : Lê Thị Kim Dung MSSV : K38.201.015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

NH ẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn

Thầy Bùi Xuân Hào và thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Tất cả quý thầy cô Khoa Hóa, đặc biệt quý thầy cô Bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình dạy dỗ, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu trong suốt bốn năm qua

Các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, chia sẻ những vui buồn trong quá trình làm khóa luận

Ba, Mẹ và những người thân trong gia đình là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất giúp

em vượt qua mọi khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận này

MỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN i

M ỤC LỤC ii

DANH M ỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU v

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC vi

L ỜI MỞ ĐẦU - 1 -

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN - 2 -

1.1 ĐẶCĐIỂMTHỰCVẬTCÂYCÀNHGIAO[1] -2-

1.1.1 Mô tả chung[1] - 2 -

1.1.2 Vùng phân bố - 2 -

1.2 CÁCNGHIÊNCỨUVỀDƯỢCTÍNH -3-

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền - 3 -

1.2.2 Nghiên cứu về dược tính - 4 -

1.2.3 Độc tính - 4 -

1.2.4 Ứng dụng khác - 4 -

1.3 CÁCNGHIÊNCỨUVỀTHÀNHPHẦNHOÁHỌC -5-

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM - 10 -

2.1 HOÁCHẤT,THIẾTBỊ -10-

2.1.1 Hoá chất - 10 -

2.1.2 Thiết bị - 10 -

2.2 NGUYÊNLIỆU -10-

2.2.1 Thu hái nguyên liệu - 10 -

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu - 11 -

2.4 CÔLẬPCÁCHỢPCHẤTHỮUCƠTRONGCAOETHYLACETATE -11-

2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate - 11 -

2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6 - 12 -

2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6.12 - 12 -

2.4.4 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.2.4 - 12 -

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN - 14 -

3.1 KHẢOSÁTCẤUTRÚCHỢPCHẤTG.B1 -14-

3.2 KHẢOSÁTCẤUTRÚCHỢPCHẤTG.C2 -17-

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT - 19 -

4.1 KẾTLUẬN -19-

4.2 ĐỀXUẤT -19-

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 20

DANH M ỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

ddd Doublet of doublet of doublets Mũi đôi đôi đôi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

 HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây cành giao 2

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập được từ E.tirucalli 7

Hình 3.1 C ấu trúc vòng A của hợp chất G.B1 15

Hình 3.2 C ấu dạng và tương quan HMBC của G.B1 15

Hình 3.3 Công th ức cấu tạo và tương quan HMBC của G.C2 18

Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethyl acetate 19

 SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quá trình ly trích và cô lập từ cây cành giao 13

 BẢNG BIỂU B ảng 1.1 Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây 4

B ảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây 6

B ảng 2.1 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate 11

B ảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất G.B1 16

B ảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất G.C2 18

có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh Tuy nhiên nhiều cây thuốc chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống, trong đó có cây cành giao

Cây cành giao mọc hoang tại nhiều vùng ở Việt Nam Tuy nằm trong từ điển cây thuốc Nam nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu hóa sinh học về cây cành giao được thực hiện Những nghiên cứu đi trước về Euphorbia tirucalli L cho thấy cây cành giao là loại cây có nhiều tiềm năng

Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cây cành giao với mong muốn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Tên thông thường: Cành giao

Tên gọi khác: lục ngọc thụ, xương khô, bút chì, thanh san hô, san hô xanh, nọc rắn Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Tên khoa học: Euphorbia tirucalli L

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Toàn cây cành giao có vị cay, hơi chua, tính mát, hơi có độc, có tác dụng thúc sữa, sát trùng, khử

phong, tiêu viêm, giải độc Dân gian thường dùng cành giao để trị đau nhức, côn trùng đốt, chấn thương…

Theo Schmelzer, Gurib-Fakim (2008) và Van Damme (1989) thì ở Đông Phi, mủ của cành giao được sử dụng để chống liệt dương, mụn cóc, động kinh, đau răng, trĩ, rắn cắn Ở Malaysia, rễ hoặc thân cành giao được dùng để chữa trị loét mũi, trĩ và các chỗ sưng Các mảnh rễ trộn với dầu dừa chữa đau dạ dày Ở Ấn Độ, Kumar (1999) ghi lại rằng cành giao là loại cây không thể thiếu trong vườn nhà và được sử dụng như là một phương thuốc cho các bệnh như: phì lá lách, hen suyễn, bệnh phù, bệnh phong, huyết trắng, khó tiêu, vàng da, đau bụng, các khối u, sỏi bàng quang Duke (1983) và Van Damme (1989)

đề cập rằng tại Brazil, cành giao được sử dụng chống lại bệnh ung thư, u dạng ung thư, ung thư biểu mô, bướu thịt, các khối u và mụn cóc mặc dù vẫn còn tranh cãi về cơ sở khoa học

về hợp chất chống ung thư của cây Ở Malabar (Ấn Độ) và Moluccas, mủ được sử dụng như thuốc gây nôn và trị giang mai Ở Indonesia, dịch của rễ được sử dụng trị đau nhức xương trong khi thuốc đắp của rễ hoặc lá cây được sử dụng điều trị loét mũi, trĩ Nước sắc

từ thân cây để chữa bệnh phong và tê liệt tay chân sau khi sinh con (Duke, 1983) Ở Java,

mủ được sử dụng để chữa trị các bệnh về da và gãy xương.[15]

Một số bài thuốc theo y học cổ truyền:

Chữa viêm xoang, viêm mũi dị ứng: dùng khoảng 15 đốt cành cây cành giao, cắt nhỏ từng đoạn 5 mm, cho vào túi nilon đập nát rồi cho vào ấm có vòi với lượng nước vừa

đủ, đun sôi, dùng giấy cuộn thành ống lắp vào đầu vòi, cho vào mũi để hít hơi nước, hơi thuốc vào mũi, thỉnh thoảng hít cả vào miệng Thời gian xông 10-15 phút Xông liên tục 3-

5 ngày, bệnh nặng có thể xông 7-10 ngày Cần chú ý không dùng cho phụ nữ có thai.[22]

Chữa côn trùng, ong đốt, rắn cắn, bò cạp đốt…: dùng cành cây cành giao giã nhỏ, đắp lên vết thương.[22]

Chữa mụn cơm: dùng nhựa mủ cây cành giao đắp lên mụn cơm.[22]

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Cao chiết các bộ phận của cây được thử nghiệm các loại hoạt tính sinh học và dược học, được mô tả trong bảng 1.1

Avelar 2011[2]

Betancur-Galvis 2002[3]Kháng ung thư và điều trị AIDS Cao chiết cây Dias 2006[4]

Kháng oxi hóa và chức năng bảo vệ gan Cao chiết cây Jyothi 2008[9]

Chất diệt côn trùng và sinh vật gây hại:

Các loài Euphorbia đều chứa nhựa nhưng nhựa cây cành giao được xem độc nhất

Cây cành giao có nhiều diterpenoid loại phorbol gây độc tuy không gây chết người nhưng làm tổn thương nặng da và mắt Nhựa của cây cành giao có thể làm phồng da và xung huyết da, gây nôn mửa với liều lớn nhưng nó lại là thuốc tẩy với liều nhỏ và chữa trị đau răng, đau tai, thấp khớp, mụn cóc, ho, thần kinh và bọ cạp cắn.[5][6]

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Nông lâm nghiệp: Với đặc tính chống hạn cây được sử dụng ở các vùng đất bán hạn hán để bảo vệ đất.[15]

Euphorbia tirucalli có chứa chất nhựa màu trắng như sữa trong toàn cây khi cắt ngang Nhựa cây có thể chiếm tới 28% trọng lượng khô, trong đó gồm 21-27% các hợp chất tan trong nước, 59-63% resin và 12-14% các hợp chất như cao su.[15]

Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L

tương đối ít và thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene, diterpene, polyphenol…(Uchida Hidenobu Y.H và cộng sự, 2009; Lin S.-J và cộng sự, 2001; Yoshida T và cộng sự, 1991).[11][18][21] Nhựa của Euphorbia tirucalli L cũng được nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene thuộc khung sườn ingenane

và tigliane (Fuerstenberger G và cộng sự, 1985; Fuerstenberger G., 1977).[5][6]

Năm 1977, Fuerstenberger G và Hecker E cô lập được 4 hợp chất mới từ mủ của

cây Euphorbia tirucalli Đó là các hợp chất 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1), phorbol (2),

3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) và ingenol (4).[5]

Năm 2001, Lin S.-J đã cô lập được 14 hợp chất, đó là

3,3',4-tri-O-methyl-4-O-rutinosyl ellagic acid (22), gallic acid (23), 1-O-galloyl- β-D-glucoside (24),

1,2,3-tri-O-galloyl-β-D-glucoside (25), corilagin (26), pedunculagin (27), casuariin (28), quercitrin

(29), putranjivain B (30), putranjivain A (31), 2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-D

-glucopyranoside (32) và 5-desgalloylstarchyurin (33) [10]

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Toàn cây Uchida và cộng sự 2010

Cycloeuphordenol (12) (triterpene) Nhựa cây Khan 2010

Cyclotirucanenol (13) (triterpene) Nhựa cây Khan và Ahmed 1988

Euphol (14) và β-amyrin (15)

(triterpenoid)

Toàn cây Uchida và cộng sự 2010

Euphorbin A (polyphenol) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991

Euphorcinol (16) (pentacyclic triterpene) Vỏ thân cây Khan 1989

Taraxerane triterpene (18) Vỏ thân cây Rasool 1989

Tirucalicine (6) (diterpene) Nhựa cây Khan 2010

Tirucallin A (19) (tannin) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991

Tirucallin B (20) và euphorbin F (21)

(dimer)

Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991

Trimethylellagic acid Nhựa cây Chatterjee và cộng sự 1977

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

HO O

H HO

OH OH H H

H H

CH2OH

O

HO HO HO

O

H HO

OH OH H H

H

HO

H

H H

H

Campesterol (7)

HO

H H

H

HO

H H

HO

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

H HO

Euphorbol (17)

O O

O O

O

OH HO

OH

OH HO HO

OH OH OH

O O

OH OH

O

OH HO

OH

OH HO

OH OH OH

O

O

O O

O

O O

H

O OH

OH

OH OH OH

OH

OH HO OH HO

HO

OH

OH HO

O O

O O

O

O O O

O

O

OH OH HO

OH HO

HO

OH OH

OH OH

OH OH

OH

OH OH OH

3,3',4-tri-O-methyl-4'-O-rutinosyl ellagic acid (22)

OMe

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

O galloyl

HOOHO

galloyl

1,2,3-tri-O-galloyl-b -D-glucoside (25)

O O OH

O galloyl HO

O HO

OH

1-O-galloyl-b -D-glucoside (24)

galloyl =

OH OH OH O

CO OCH2

O COO

OH HO HO HO HO OH

O O CO

CO HO

HO OH HO OH

OH

Pedunculagin (27)

O O O O

HO H O O O O

H HO

OH OH OH

OH OH OH

OH

OH HO

OH HO

O

OH HO HO

Quercitrin (29)

O

O O

OH HO

Putranjivain B (30)

O O

OH

2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside (32)

C C

H

OH OH OH

OH HO HO HO HO OH

C O

C O

O O O

5-desgalloylstarchyurin (33)

OH HO

O O O

CO

O CH2O CO

CO

O OH O

HO

OH OH

CO

O O

OOC

OH OH OH

HO

Putranjivain A (31)

ợp chất cô lập từ E tirucalli (tiếp)

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là thân cây cành giao Euphorbia

tirucalli L được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 3 năm

2015

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô rồi xay thành bột mịn Sau đó tiến hành đun hoàn lưu với ethanol và phân lập các hợp chất

Bột cây 3.5 kg được trích kiệt với ethanol mỗi lần 10 lít và lặp lại hai lần theo phương pháp đun hoàn lưu trong vòng 7 giờ, lọc, cô quay thu hồi dung môi Trong quá trình cô quay thu hồi dung môi, thấy kết tủa xuất hiện, lọc riêng phần tủa ethanol thô (250.4 g) và phần dịch ethanol thô Et1 (290.3 g) Tiếp tục hòa phần tủa ethanol thô với

ethanol đun nóng, thu được phần dịch Et2 (101.2 g) và phần tủa còn lại (149.2 g) Cao ethanol Et1, Et2 được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và

butanol thu được các cao tương ứng như minh họa trong sơ đồ 2.1

Sắc ký cột cao ethyl acetate - EA1, EA2 trên silica gel pha thường sử dụng hệ dung hexane: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 50% đến 100% ethyl acetate Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn

Phân

đoạn

1 HA.1.1 (1.58 g) HA.2.1 (0.37 g) Nhiều vết Vệt dài Chưa khảo sát Chưa khảo sát

2 HA.1.2 (2.76 g) HA.2.2 (3.14 g) Vệt dài Nhiều vết Chưa khảo sát Đã khảo sát

3 HA.1.3 (1.15 g) HA.2.3 (2.12 g) Nhiều vết Nhiều vết Chưa khảo sát Chưa khảo sát

4 HA.1.4 (2.48 g) HA.2.4 (4.21 g) Nhiều vết Nhiều vết Chưa khảo sát Đã khảo sát

5 HA.1.5 (2.35 g) HA.2.5 (2.69 g) Vệt dài Nhiều vết Chưa khảo sát Chưa khảo sát

6 HA.1.6 (2.50 g) HA.2.6 (3.15 g) Nhi ều vết Nhiều vết Đã khảo sát Chưa khảo sát

7 HA.1.7 (1.95 g) HA.2.7 (1.84 g) Nhiều vết Nhiều vết Đã khảo sát Chưa khảo sát

8 HA.1.8 (0.24 g) HA.2.8 (0.89 g) Nhiều vết Vệt dài Đã khảo sát Chưa khảo sát

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Phân đoạn HA.1.6 cho SKLM nhiều vết nên phân đoạn HA.1.6 được thực hiện SKC

sillica gel với hệ dung môi rửa giải H-EA (1:4) Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn Kết quả thu được 12 phân đoạn (HA.1.6.1-HA.1.6.12), được trình bày trong sơ đồ 2.1

2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6.12

Phân đoạn HA.1.6.12 cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn HA.1.6.12 được

thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải H:EA:Et:AcOH (5:1:0.2:0.1) Dịch giải

ly qua cột được hứng vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn Kết quả thu được 15 phân

đoạn (HA.1.6.12.1-HA.1.6.12.15)

Phân đoạn HA.1.6.12.11 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu cam ẩn dưới vết dơ

kéo thành đuôi dài Từ phân đoạn HA.1.6.12.11 (356.0 mg), tiếp tục SKC nhiều lần với hệ

dung môi C:Me:W (4:0.38:0.02) thu được hợp chất kí hiệu là G.C2 (6.5 mg) có dạng bột màu trắng Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1

Phân đoạn HA.2.4 cho SKLM nhiều vết, tách rõ và xuất hiện kết tủa Lọc thành 2

phần tủa và dịch Lấy phần tủa rửa nhiều lần bằng acetone thu được hợp chất kí hiệu là

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

Đun hoàn lưu với ethanol, lọc,

cô quay thu hồi dung môi

Sơ đồ 2.1 Quá trình ly trích và cô lập từ cây cành giao

Hệ dung môi A

H:EA:Et:AcOH (5:1:0.2:0.1)

H ệ dung môi B

C:Me:W (4:0.38:0.02)

Khóa luận tốt nghiệp Lê Thị Kim Dung

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

giúp xác định hợp chất G.B1 là một triterpene có khung sườn olean

So sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất G.B1 và oleanolic acid [20], nhận thấy các tín hiệu của G.B1 và oleanolic acid giống nhau, ngoại trừ các tín hiệu của vòng A Qua

đó giúp xác định G.B1 có cấu trúc giống oleanolic acid ở các vòng B, C, D, E

Trên vòng A, phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của tín hiệu cộng hưởng tại vị trí

δH 3.56 (1H, d, J = 10.5 Hz) ghép cặp với proton ở vị trí δH 3.28 (1H, d, J = 10.5 Hz), cùng

với dữ liệu phổ HMBC giúp xác định chúng là hai proton của nhóm methylene không tương đương liên kết trực tiếp với oxygen Ngoài ra phổ 1H-NMR còn có tín hiệu cộng

hưởng của hai nhóm oxymethine H-2 (1H, ddd, J = 11.5, 9.5, 4.5 Hz) và H-3 (1H, d, J =

9.5 Hz) Phân tích hằng số ghép của hai proton này chứng tỏ chúng ghép cặp lẫn nhau với J

= 9.5 Hz giúp xác định vị trí axial của chúng

So sánh hợp chất G.B1 và oleanolic acid, cho thấy G.B1 mất đi một nhóm methyl –

CH ở vị trí 23, thay vào đó là sự hiện diện của nhóm hydroxylmethylene H -23 Phổ