kỹ thuật lai huỳnh quang
Trang 1TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRÊN VI
Trang 2MỤC ĐÍCH
Cung cấp chính xác thông tin về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống của vi sinh vật.
Trang 31 Quy trình thực hiện
• Chuẩn bị mẫu và đầu dò.
• Trộn mẫu với đầu dò.
• Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào.
• Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai.
• Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp).
• Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.
Trang 51 Quy trình thực hiện
Đầu dò
- Đầu dò: Là những oligonucleotide dài
từ 15 đến 30 bp, có trình tự bổ sung với các rRNA 16S của
tế bào vi sinh vật.
Trang 71 Quy trình thực hiện
Trang 81 Quy trình thực hiện
Thuốc nhuộm huỳnh quang
Đặc điểm quan trọng: các chất huỳnh quang
có các mức năng lượng kích thích và phát xạ khác nhau.
Cho phép phát hiện đồng thời hai hay nhiều
vi sinh vật khi chỉ lai một lần duy nhất.
Trang 91 Quy trình thực hiện
Thuốc nhuộm huỳnh quang
Tên thuốc nhuộm
Bước sóng
Màu Kích thích
(nm)
Phát xạ (nm) AMCA 351 450 Xanh dương FITC* 492 528 Xanh lá cây FluoXE** 488 520 Xanh lá cây TRITC*** 557 576 Đỏ
Texas Red 578 600 Đỏ Cy3 550 570 Cam/Đỏ Cy5 651 674 Hồng ngoại
Trang 101 Quy trình thực hiện
Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ
Mục đích: đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối
đa số lượng các trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng
Hình thức: ngâm mẫu trong các dung dịch hoặc xử lý bằng enzym
Trang 111 Quy trình thực hiện
Lai
Yêu cầu:
Kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng với số lượng lớn nhất.
Trang 121 Quy trình thực hiện
Lai
Điều kiện:
Môi trường tối ẩm.
Nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC
Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ.
Trang 141 Quy trình thực hiện
Kính hiển vi laze quét đồng tiêu
Trang 152 Trở ngại của FISH
Kết quả không chính xác
Trang 162 Trở ngại của FISH
Không thu được kết quả
Cấu trúc của đầu dò hay trình tự đích quá phức tạp
Trang 173 Ứng dụng của FISH
Sự đa dạng của vi sinh vật
FISH được sử dụng trên toàn thế giới
để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong tự nhiên như môi trường dưới nước, trong đất hay trên bề mặt rễ thực vật.
Trang 183 Ứng dụng của FISH
Sự đa dạng của vi sinh vật
Một ví dụ điển hình khi sử dụng FISH
để phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus
trong đất đồng cỏ tại Hà Lan.
Đây là một loại vi khuẩn hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA
Trang 193 Ứng dụng của FISH
Sự đa dạng của vi sinh vật
Quá trình lai được thực hiện trong dung dịch bao gồm:
Dung dịch đ ệm (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2)
Formamide 20%
Đầu dò oligonucleotide REX72 TGGGAGCAAG CTCCCAAAG-3’).
(5’- Đầu dò LGC353b (5’-GCGGAAGATT CCCTACTGC-3’).
Trang 203 Ứng dụng của FISH
Sự đa dạng của vi sinh vật
Cuối cùng, mẫu được nhuộm với dung dịch chứa 1mg 4,6-diamidino-2- phenylindole (DAPI).
Trang 213 Ứng dụng của FISH
Sự đa dạng của vi sinh vật
DAPI nhận biết tất cả các vi sinh vật với tín hiệu màu xanh
Các đầu dò LGC252b sẽ được nhuộm với Cy3 để phát hiện các tế bào vi khuẩn Bacillus và bào tử với tín hiệu màu đỏ
Đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang
với các ribotype DA001 của Bacillus.
Trang 223 Ứng dụng của FISH
Sự đa dạng của vi sinh vật
Dò tìm vi khuẩn bacillus mang gen DA001 sử dụng
ba chất nhuộm khác nhau trên cùng một mẫu đất
Trang 233 Ứng dụng của FISH
Hệ vi sinh vật trong nước thải
FISH sử dụng các đầu dò oligonucleotideđược tạo ra bằng những kỹ thuật phân tử như PCR để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong nước thải, bùn hoạt tính.
Trang 243 Ứng dụng của FISH
Vi sinh vật cộng sinh
Khi sử kỹ thuật FISH với các trình tự rRNA 16S, các vi khuẩn cộng sinh có thể được phát hiện, từ đó tiến hành định danh
và phân cấp phát sinh loài
Trang 263 Ứng dụng của FISH
Ứng dụng vào y học
Nghiên cứu và phát hiện các bệnh có nguồn gốc
từ nấm Candida đối với các bệnh nhân suy giảm
miễn dịch.
Trang 273 Ứng dụng của FISH
Ứng dụng vào y học
Xác định chính xác các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật và thực vật để từ đó kiểm soát và triệt tiêu mầm bệnh này.
Khoai tây mục héo và hóa nâu do vi
khuẩn Ralstonia solanacearum Pena eus vannamei gây
bệnh trên loài tôm trắng
Trang 284 Triển vọng của FISH
Trên thế giới
- Thực hiện hoàn toàn tự động, nhanh chóng chẩn đoán chính xác vi sinh vật.
- Kết hợp FISH với đánh dấu miễn dịch, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn.
Trang 294 Triển vọng của FISH
Trên thế giới
- Kỹ thuật FISH với độ nhạy cao, sử dụng được đối với mRNA, một trình tự không ổn định và có số lượng bản sao thấp.
- Sử dụng đầu dò acid nucleic peptide trung hòa điện thay cho oligonucleotide.
Trang 304 Triển vọng của FISH
Tại Việt Nam
FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền:
• Việc chẩn đoán trước sinh và sau sinh những bất thường
về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể của thai nhi.
• Phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di
truyền.
• Xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc.
• Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư.
Trang 314 Triển vọng của FISH
Tại Việt Nam
Việc phát triển kỹ thuật FISH ở Việt Nam trong tương lai có nhiều triển vọng vì đầu tư cho kỹ thuật này phù hợp với điều kiện kinh tế và khoa học kỹ thuật của nước ta.
Trang 32Cám ơn sự lắng nghe của quý thầy cô và tất
cả các bạn!
