Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật

Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

ĐỒ ÁN MÔN HỌC CHUYÊN NGÀNH

TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI

HUỲNH QUANG TẠI CHỖ_FISH

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự thành kính, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

ƒ Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Huyền – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án này

ƒ Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu có liên quan đến đề tài

ƒ Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM –

đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc

TÓM TẮT NỘI DUNG

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ_ FISH (fluorescence in situ hydridization) ra đời từ năm 1989 và đến nay được xem là công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán và phát sinh loài Bằng 5 bước xử lý cơ bản: chuẩn bị mẫu và đầu dò, cố định mẫu, lai, rửa mẫu, quan sát ta có thể thu được các thông tin chính xác về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay thành phần môi trường của đối tượng nghiên cứu Trên thế giới đã ứng dụng FISH trong nhiều lĩnh vực, trong tương lai FISH sẽ sử dụng để tăng cường hiệu quả biểu hiện của nhiều công cụ nghiên cứu khác Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT NỘI DUNG iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH VẼ vi

DANH SÁCH BẢNG BIỂU vi

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH 3

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH 5

3.1 Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH 5

3.2 Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang 6

3.3 Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ 10

3.4 Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu 11

3.5 Quan sát và xử lý tín hiệu 11

CHƯƠNG 4 NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH 14

4.1 Kết quả không chính xác 14

4.1.1 Các chất tự phát huỳnh quang 14

4.1.2 Đầu dò thiếu tính đặc hiệu 15

4.2 Kết quả âm tính 16

4.2.1 Số lượng đầu dò quá ít 16

4.2.2 Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích 17

4.2.3 Hàm lượng rRNA thấp 17

4.2.4 Ảnh chụp bị mất màu 18

4.3 Biện pháp khắc phục 18

CHƯƠNG 5 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT FISH 19

5.1 Sự đa dạng của vi sinh vật 19

5.2 Hệ vi sinh vật trong nước thải 22

5.3 Vi khuẩn cộng sinh 23

5.4 FISH trong y học 24

5.4.1 Các quần thể vi khuẩn phức tạp 24

5.4.2 Phát hiện mầm bệnh trong các mô cấy và dụng cụ vô trùng 29

5.4.3 Nấm 30

5.4.4 Thuốc thú y 31

5.4.5 Các mầm bệnh ở thực vật 31

5.4.6 Phát hiện các mầm bệnh bằng phương pháp lai không sử dụng chất huỳnh quang 32

CHƯƠNG 6 TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH 33

6.1 Trên thế giới 33

6.2 Tại Việt Nam 36

CHƯƠNG 7 TỔNG KẾT 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH SÁCH HÌNH VẼ

Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH 4 Hình 2: Các cách đánh dấu đầu dò 7 Hình 3: Kính hiển vi quét laze đồng tiêu 11 Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida albicans 12Hình 5: Kết quả hiển thị cho quá trình lai để phát hiện các vi khuẩn Bacillus ribotype DA001 với ba chất nhuộm khác nhau trên một mẫu đất 19 Hình 6: Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng 22 Hình 7: FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I 23

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH 8

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

ISH : In Situ Hybridization

FISH : Florescence In Situ Hybridization rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid

DNA : Deoxyribonucleic Acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

CCD : Charged Coupled Device

CLSM : Confocal Laser Scanning Microscope TSA : Tyramid Signal Amplification

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Việc nhận biết sự có mặt của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên chủ yếu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy cổ điển bằng phương pháp cấy chuyền kết hợp với lựa chọn môi trường đặc hiệu gặp khó khăn trong nghiên cứu các loài vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng chậm hoặc chưa phân lập Một nhược điểm nữa là tốn nhiều thời gian

và có tính chọn lọc cao Hơn nữa, kỹ thuật này không phản ánh được sự mối tương quan giữa đối tượng nghiên cứu với môi trường xung quanh [9]

Từ thực tế trên, nhiều kỹ thuật hiện đại ra đời như PCR, lai liên tiếp, lai trình tự, tuy nhiên vẫn không khắc phục hoàn toàn những nhược điểm kể trên của kỹ thuật nuôi cấy cổ điển Nguyên nhân chính là để thực hiện những kỹ thuật này đòi hỏi phải có một lượng mẫu lớn, điều này nghĩa là cũng phải đi qua giai đoạn cấy chuyền mất nhiều thời gian; và quan trọng hơn là các phương pháp hiện đại này chỉ chứng minh sự có mặt của đối tượng nghiên cứu mà không cung cấp chính xác thông tin về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống của vi sinh vật

Kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời từ năm 1961 do hai nhóm nghiên cứu độc lập Pardue, Gall và John đề xuất đã khắc phục được tất cả các vấn

đề kể trên Tuy nhiên do tính không an toàn đối với con người, môi trường và khá phức tạp trong thao tác mà kỹ thuật ISH đã được cải tiến thành FISH Lai huỳnh quang tại chỗ FISH (fluorescence in situ hydridization) từ khi ra đời đã trở thành một công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán và phát sinh loài

FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào

vi khuẩn FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ về điều kiện và môi trường nuôi cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ

thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụ nghiên cứu hữu hiệu nhất

Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong môi trường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden [88], tại vịnh hẹp ở Na-uy [115], sinh vật phù du ở sông hoặc biển [6,52,73,82], tuyết hồ trên núi cao [155], trong đất [37] và trên bề mặt rễ thực vật [92] FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnh lây qua đường máu, ung thư…) FISH còn được sử dụng để chẩn đoán thường qui sự bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của thai nhi

Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển

Nhận thức được vai trò, tầm quan trọng và triển vọng phát triển của FISH trong nghiên cứu về thế giới vi sinh vật, tôi tiến hành đi vào tìm hiểu kỹ thuật này trong khuôn khổ bài báo cáo đồ án môn học

CHƯƠNG 2 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH

Năm 1969 : kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời bởi hai nhóm nhà khoa học độc lập Pardue, Gall và John Trong phương pháp này, DNA hoặc 28S-RNA có đánh dấu phóng xạ được đem lai với DNA có trong noãn bào chủng

vi khuẩn Xenopus, sau đó được dò tìm bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Kỹ thuật này

cho phép các chuỗi acid nucleic xâm nhập vào trong tế bào mà không làm chết tế bào, làm thay đổi đến hình thái của tế bào hay tính toàn vẹn của các bộ phận bên trong tế bào

Khi phân tích ở cấp độ đơn bào bằng phương pháp lai tại chỗ có thể cung cấp một bức tranh chi tiết hơn về vi sinh vật so với lai dot blot Nó không chỉ xác định được hình thái tế bào của một loài vi sinh vật chưa từng được nuôi cấy mà còn phân tích được sự phân bố không gian của chúng Xác định số lượng các tín hiệu phát ra bằng các oligonucleotide rRNA đích cho phép ước tính được tỷ lệ tăng trưởng của các tế bào riêng lẻ

Từ khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự tiến hóa của nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung thư bạch cầu

và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài

Cuối cùng vào năm 1988, Giovanoni và cộng sự đã áp dụng thành công phương pháp này trên vi khuẩn, họ là những người đầu tiên sử dụng các đầu dò oligonucleotide rRNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ để phát hiện vi khuẩn thông qua kính hiển vi Những năm sau đó, cùng với sự phát triển của các chất dán nhãn huỳnh quang [76,109,110], kỹ thuật đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ đã dần dần được thay thế bởi thuốc nhuộm huỳnh quang

Năm 1989, DeLong lần đầu tiên sử dụng oligonucleotide được đánh dấu chất huỳnh quang để dò tìm các vi sinh vật đơn bào So với các đầu dò phóng xạ, đầu dò huỳnh quang sử dụng an toàn hơn, ít gây hại đối với môi trường và sức khỏe con người, kết quả thu được chính xác hơn và không cần phải thực hiện bước dò tìm (vì

nhìn thấy trực tiếp) Hơn thế nữa, các đầu dò huỳnh quang có thể được đánh dấu với nhiều chất nhuộm, phát xạ tại những bước sóng khác nhau, vì vậy có thể dò tìm một vài trình tự đích chỉ với một lần lai Độ nhạy, sự chính xác và thời gian tiến hành ngắn là những ưu điểm nổi trội của FISH, giúp nó ngày càng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học nghiên cứu về vi sinh vật.

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH

3.1 Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào)

Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau:

- Chuẩn bị mẫu và đầu dò

- Cố định mẫu

- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào

- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai

- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp)

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả

Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH

3.2 Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang

Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụng

phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn Các đầu dò oligonucleotide ứng với mỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến các chi và loài cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đích [10,53] Với sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thông tin di truyền trong các cơ

sở dữ liệu chung và thương mại [93,145], đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác Điều này đặc biệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưa từng nuôi cấy đặc hiệu Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ số lượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH Việc lựa chọn vị trí trình tự đích và quá trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thận trọng cao nhất Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S [10,82,94,104,143], rRNA 18S [83,86,87,133] và gần đây là mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm FISH

Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng xâm nhập vào trong tế bào Một đầu dò oligonucleotide điển hình thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự động Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại mang được ít các trình tự đánh dấu Trong FISH, các trình tự đích thông dụng nhất

là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và

số lượng các bản sao nhiều Do đó, các đầu dò được lựa chọn thường là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một số sản phẩm được thương mại hóa Chúng có thể lưu trữ được ở -200C trong tối khoảng vài tháng

Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò là cách thông dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhất bởi vì chúng không đòi hỏi phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai Một hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với oligonucleotide trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên kết amino ở đầu 5’

của đầu dò (hình 2a), hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các

nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dò (hình 2b) [100] Ngoài

ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu

so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp [31] Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quang trên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng như những miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệu huỳnh quang [133]

Trong một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ được

dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang (Hình 2c) [162] Độ nhạy của FISH còn có thể được tăng lên đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu

về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụng vào định danh vi khuẩn (1996) Ban đầu, mỗi oligonucleotide vẫn sẽ được đánh dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dò tìm bằng một thể kháng digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzyme phosphatase kiềm Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thể này tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi kết hợp với Fast Red TR Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này

có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãn huỳnh quang duy nhất Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng

được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín hiệu Tyramide” (TSA) (Hình 2d) Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên khoảng 10 – 20 lần Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhất một chất huỳnh quang Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhập của các chất cao phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dò vào trong tế bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp này chủ yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạp.

Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dò polyribonucleotide (e) (Moter et al., 2000).

Độ nhạy của FISH khi áp dụng trên các mẫu tự nhiên sẽ tăng lên đáng kể khi sử dụng đầu dò polyribonucleotide được đánh dấu bằng một số phân tử huỳnh quang [30]

Có lẽ phương pháp hiệu quả nhất là kết hợp việc sử dụng các đầu dò polyribonucleotide, được đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thống

khuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA) Kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công

khi dò tìm và phát hiện trực quan các độc tố trong Listeria (Hình 2e) [149]

Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang

đều có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau nên cho phép phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật khi chỉ lai một lần duy nhất Cùng với việc quan sát trực quan bằng kính hiển vi đa màu FISH, các bộ lọc màng nhiều dải cũng có thể được sử dụng Các chất huỳnh quang tổng hợp có những điểm phát

xạ sắc nét khác nhau nên sẽ loại bỏ được hiện tượng các phổ huỳnh quang chồng lên nhau giữa các đầu dò, đồng thời hạn chế các vấn đề về màu nền và sự dây, nhem màu Chất màu huỳnh quang có màu sáng nhất và bền quang học nhất nên sử dụng để dò tìm các trình tự đích mà lượng mẫu rất ít Các chất nhuộm thường sử dụng cho FISH trong vi sinh vật học là fluorescein-derivates (Fluorescein-Isothiocyanate (FITC), 5(6)carboxyfluorescein-N-hydroxysuccimide-ester (FluoX)) và rhodamine-derivates (Tetramethyl-Rhodamine-Isothiocyanate (TRITC), Texas Red), ngoài ra còn có các loại thuốc nhuộm cyanine khác như là Cy3 và Cy5 (Bảng 1)

Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH

Kích thích (nm) Phát xạ (nm)

TRITC*** 557 576 Đỏ

Bước sóng có thể thay đổi ít nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất Quang phổ phát xạ

có thể thay đổi trong các dung môi khác nhau hoặc đặc tính của mẫu.

*FITC : Fluorescein–isothiocyanate

**FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester

***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate

3.3 Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ

Trước khi tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật và các đầu dò phải được ngâm trong các hợp chất tạo tủa như ethanol hoặc methanol, hợp chất tạo được liên kết ngang như aldehyde hoặc hỗn hợp các chất trên để các đầu dò huỳnh quang có thể thấm vào bên trong tế bào và bảo vệ các rRNA không bị biến tính bởi các RNAse nội bào Các điều kiện và phương pháp cố định mẫu có thể khác nhau tùy thuộc vào vi sinh vật đích và loại mẫu Quá trình cố định mẫu tối ưu sẽ đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng Cố định đầu dò vào mẫu hiệu quả sẽ ảnh hưởng rất tích cực đến kết quả của FISH, nhưng việc cố định rất khó để có thể tối ưu hóa Thông thường một lượng dung dịch formaldehyde hoặc paraformaldehyde 3-4% (v/v) thì phù hợp cho hầu hết các loại

vi khuẩn Gram âm Đối với các vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗn hợp ethanol/formalin (tỉ lệ 9:1 v/v) hoặc xử lý nhiệt là những biện pháp thông dụng nhất; ngoài ra có thể bổ sung thêm bước xử lý sơ bộ để tăng tính thấm của đầu dò Trong một số trường hợp, như trong các tế bào Gram dương, khi xử lý bằng

enzym lysozyme, lysostaphin, hoặc hỗn hợp các enzyme có thể sẽ cần thiết để tách

peptidoglycan Đối với loài Actinomycetales có chứa acid mycolic như phức hệ Mycobacterium, Norcardia hoặc Microthrix parvicella, hiệu quả khi sử dụng các

kỹ thuật thẩm thấu như thủy phân bằng acid yếu HCl 1M hoặc xử lý với Mutanolysin hay 1,4 dithio-L-threitol [35,91,127] đã được kiểm định Đối với các mẫu có tỷ lệ G + C cao, quá trình cố định mẫu và thao tác xử lý sơ bộ phụ thuộc vào giống vi sinh vật, và kỹ thuật phân tích các mẫu nhiễm tạp tự nhiên có chứa các vi khuẩn này vẫn còn gặp khó khăn [91,116]

Khi áp dụng phương pháp FISH trên mẫu chứa nhiều đoạn mô khác nhau, các quá trình tiền xử lý bắt buộc phải được áp dụng để tăng khả năng tiếp cận của các đầu dò đối với các trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế được các liên kết

không đặc hiệu Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào được ngâm trong dung dịch keo lạnh [101] Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mô của các tế bào rất hoàn chỉnh mà không hề có bất cứ quá trình tiền xử lý nào

3.4 Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu

Trước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vào một mặt kính Để quá trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyên nên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính ngoài Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin [8], poly-L-lysine [80] hay các hợp chất tạo muối [101]

Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặt nhằm kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, quá trình làm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kết hợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng Sự chính xác khi bắt cặp bổ sung có thể được điều khiển bằng cách thay đổi nồng độ formamide hay nhiệt độ của quá trình Formamide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử bằng cách làm suy yếu liên kết hydro, từ đó cho phép tiến hành quá trình nhuộm ở nhiệt độ thấp những vẫn đảm bảo độ chính xác cao

Quá trình lai xảy ra trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ Sau đó, rửa mẫu bằng nước cất

để loại bỏ các đầu dò không liên kết được với trình tự đích Cuối cùng, rửa lại với nước một lần nữa, sấy và cố định các phân tử lai, có thể bổ sung thêm các chất chống phai màu

3.5 Quan sát và xử lý tín hiệu

Để có thể quan sát được các tín hiệu huỳnh quang đa sắc trong thí nghiệm FISH, kính hiển vi thông thường sẽ được trang bị thêm một bộ lọc dải hẹp nhiều

tần Ngoài ra, để thu nhận và phân tích được các hình ảnh đó cần phải sử dụng một máy ảnh CCD (charged coupled device) kết hợp với phần mềm phân tích xử lý ảnh

kỹ thuật số Đây là hệ thống cảm biến chính xác nhất hiện nay và nó rất hữu dụng khi quan sát những mẫu vi sinh vật quan trọng, những nơi có cường độ tín hiệu thấp Hệ thống này cũng đã được sử dụng để kiểm tra số lượng các tế bào vi sinh vật [83] và xác định hoạt tính các dòng tế bào đơn trong màng sinh học thông qua việc xác định hàm lượng rRNA [111] Gần đây, phương pháp phân tích sự phân bố không gian của vi khuẩn đã được cải tiến hơn nữa khi sử dụng kính hiển vi quan sát huỳnh quang dải rộng [96] Một loại kính hiển vi khác được sử dụng cho thí nghiệm FISH là kính hiển vi quét laze đồng tiêu (CLSM) Thông qua việc hạn chế

hệ thống tín hiệu trong những khoảng hẹp của đối tượng nghiên cứu, các tín hiệu huỳnh quang bị lệch tiêu sẽ bị loại bỏ, tạo ra những hình ảnh rõ nét Điều này rất hữu dụng cho mẫu có độ phân bố dày đặc, như các lớp bùn, màng sinh học hay đoạn mô [50,79,95,101,147,148] Hiện nay, một số gói phần mềm được lập trình sẵn cho phép tái tạo hình ảnh ba chiều Tuy nhiên, do nhanh chóng tẩy trắng các tín hiệu lệch tiêu, nên khi sử dụng kính hiển vi quét laze đồng tiêu thường đòi hỏi chất lượng tín hiệu huỳnh quang cao hơn Các tín hiệu huỳnh quang trong phương pháp FISH còn có thể thu được khi sử dụng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy, đây là một kỹ thuật cho đếm, kiểm tra, và phân loại các hạt nhỏ lơ lửng trong một dòng chất lỏng Do đó, phương pháp này không đưa ra được bất cứ thông tin về hình thái hay sự phân bố không gian của vi sinh vật, nó chỉ thực sự phát huy hết khả năng khi phân tích định lượng tự động, phân tích vi khuẩn trong dịch huyền phù hay hỗn hợp vi sinh vật phù du và nó chỉ thực hiện được khi các đối tượng vi sinh vật có tần

số cao [7,131,150,152]

Hình 4 Kính hiển vi quét laze đồng tiêu

CHƯƠNG 4 NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH4.1 Kết quả không chính xác

4.1.1 Các chất tự phát huỳnh quang

Khi gặp phải những chất có khả năng tự phát huỳnh quang, phương pháp FISH

sẽ có nhiều hạn chế Vấn đề khó khăn nhất chính là khả năng tự phát huỳnh quang của bản thân vi sinh vật Những trở ngại này đều đã được kiểm chứng trên nhiều loài nấm mốc hay nấm men khác nhau [55,97], trên một số loại vi khuẩn như Pseudomonas [21], Legionella [34,157], Rhodospirillum centenum [5], vi khuẩn lam [123] và gần đây nhất là sự thí nghiệm trên các loại vi khuẩn cổ như methanogenes [132] đều thể hiện những phức tạp của FISH khi phân tích môi trường vi sinh vật

Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida

albicans(Moter et al., 2000)

Sự tự phát huỳnh quang cũng có thể tìm thấy trong vật chất, trong môi trường xung quanh vi khuẩn như bùn hoạt tính, thực vật hay thậm chí nước uống và đó là nguyên nhân hình thành nên các mảnh vụn vô cơ hay các chất sinh học tự phát huỳnh quang [146] Tương tự như vậy, các loại mô khác nhau có chứa eslatin và colagen hay các tế bào máu như hồng cầu hay bạch cầu hạt đều thường xuyên biểu hiện sự phát sáng huỳnh quang [99,144] Mặc dù một số ít chất nền tự phát huỳnh

quang có thể hữu ích khi hoạt động như một chất phản nhuộm cho phép định hướng trong các phần mô, nhưng nhìn chung các chất tự phát huỳnh quang làm giảm tỷ lệ tín hiệu nhiễu lẫn tín hiệu đặc trưng Trong lĩnh vực nghiên cứu di truyền và miễn dịch, các đoạn mô tự phát huỳnh quang có thể loại bỏ thành công bằng cách xóa dần từng điểm ảnh trong xử lý ảnh kỹ thuật số [141,144]

Những phân tích, nghiên cứu hoàn chỉnh về hiện tượng tự phát huỳnh quang và cách hạn chế các tín hiệu nhiễu đối với FISH là rất hiếm, tuy nhiên sự phát triển các phương tiện, các kỹ thuật định hình và hệ thống thiết bị có vẻ như đã có những ảnh hưởng đáng kể đến cường độ tín hiệu [54,132] Phương pháp sử dụng bộ lọc dải hẹp và hệ thống khuếch đại tín hiệu đã được đưa ra nhằm khắc phục những khó khăn mà sự tự phát huỳnh quang gây ra [123,132] Những nghiên cứu trên Candida albicans đã chỉ ra rằng: tùy thuộc vào sự cố định mẫu và chiều dài bước sóng kích thích, sự tự phát huỳnh quang sẽ biểu hiện khác nhau trên cùng một dòng vi khuẩn đơn [54] Vì vậy việc giải thích các tín hiệu huỳnh quang thu được khi nghiên cứu trên nấm men và nấm mốc phải được thực hiện cẩn thận Tuy nhiên, sự dò tìm đặc hiệu nấm mốc và nấm men trong nuôi cấy mô tế bào, trong thí nghiệm với các mô nhiễm độc, và trong mẫu máu người đã được thực hiện [86,87] Tuy nhiên, khi phân lập với các chủng vi khuẩn tạp hay các đoạn mô, phải có một bước kiểm tra chất tự phát huỳnh quang trước khi tiến hành FISH

4.1.2 Đầu dò thiếu tính đặc hiệu

Độ chính xác và độ tin cậy của FISH phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của các đầu dò oligonucleotide Thiết kế cẩn thận và đánh giá giới hạn của các đầu dò mới

là điều thiết yếu Điều quan trọng cần lưu ý rằng mỗi một oligonucleotide chỉ phù hợp với duy nhất một dữ liệu thông tin mà nó có chung nguồn gốc Do sự báo cáo thiếu chính xác thông tin của các trình tự và sự mở rộng nhanh chóng của cơ sở dữ liệu [16], nên các trình tự đầu dò cần được kiểm tra một cách thường xuyên để cập nhật các thông tin mới nhất Khi phân lập các vi sinh vật khó nuôi cấy hoặc chưa biết môi trường đặc hiệu, việc cập nhật thông tin các trình tự tỏ ra rất hữu ích để

kiểm tra tính đặc hiệu trước khi lai thử nghiệm như các phương pháp lai dot-blot [86,100,160] Nếu vẫn khó khăn với sự chính xác và đặc hiệu của đầu dò, có thể tiến hành bổ sung các kỹ thuật phân lập Vì vậy, việc thiết kế và đánh giá tính đặc hiệu của các đầu dò nên được thực hiện trong phòng thí nghiệm với những kỹ thuật thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử.

Mặc dù các đầu dò đã được thiết kế và kiểm tra kỹ lưỡng, nhưng sự liên kết của các đầu dò với các trình tự đích bổ sung với nó ngay lập tức không mô tả được vi sinh vật, điều này là không thể tránh khỏi khi phân tích quần thể vi khuẩn hỗn tạp

Để đảm bảo các vi khuẩn được phát hiện chính xác, hai đầu dò đặc hiệu ứng với hai vị trí khác nhau trên cùng một trình tự đích rRNA 16S được đánh dấu với các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau sẽ được sử dụng Các tế bào được phát hiện ra bởi cả hai đầu dò và biểu hiện hai màu huỳnh quang có thể được xem như là những sinh vật đích [102] Tuy nhiên, phương pháp này có một nhược điểm khiến nó không được sử dụng rộng rãi, đó là phạm vi sử dụng của các trình tự đích đặc hiệu ứng với từng loài vi sinh vật

4.2 Kết quả âm tính

4.2.1 Số lượng đầu dò quá ít

Cường độ tín hiệu thấp có thể do sự thâm nhập không đủ của đầu dò vào bên trong tế bào vi khuẩn Các đầu dò polyribonucleotide khi thấm vào tế bào vi sinh vật gram âm thường không gặp phải bất cứ vấn đề nhỏ nào Đối với vi sinh vật gram dương, đặc biệt là những đầu dò có trình tự dài hoặc trung bình thì sử dụng các acid mycolic kết hợp với cố định đặc hiệu và tiền xử lý có thể rất cần thiết

FISH đã được sử dụng trên các cầu khuẩn gram dương [14,75], Corynebacterium [119], Actinomyces [116,127], Bacillus [37] và Listeria [149].

Tuy nhiên, các đặc điểm của thành tế bào đôi khi lại được sử dụng thuận lợi; FISH đã được sử dụng để đánh giá tính chất của thành tế bào vi khuẩn [17] Sử

dụng các đầu dò được đánh dấu HRP, Lactococcus lactis không thể phát hiện được bởi FISH trừ khi nó bị nhiễm độc tố từ bacteriophage, dẫn đến sự biểu hiện của các

enzyme tự phân và tính thấm của tế bào Tấn số các tế bào lai sẽ chỉ ra mức độ tự phân trong môi trường nuôi cấy

4.2.2 Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích

Do cấu trúc ba chiều của rRNA nên không phải tất cả các chuỗi trình tự đích đều tiếp cận được với các đầu dò tương ứng Cấu trúc vòng hoặc kẹp tóc cũng như

sự tương tác giữa rRNA và protein cản trở dẫn đến sự cảm biến khác nhau của các đầu dò oligonucleotide Điều này giải thích tại sao các đầu dò sử dụng tốt trong các phương pháp lai thông thường có giai đoạn biến tính RNA hoặc DNA đã không cho kết quả khả quan trong FISH [43] Một hệ thống nghiên cứu nhằm giải quyết vấn đề này đã được công bố bởi Fuchs và cộng sự (1998) Các nhà nghiên cứu đã tạo ra hơn 200 đầu dò oligonucleotide, xác định cụ thể những vị trí khác nhau trên 16S rRNA của E.coli, rồi sử dụng phương pháp flow cytometry đo cường độ tín hiệu của chúng bằng thí nghiệm FISH Dựa trên đầu dò phát sáng nhất, các oligonucleotide được phân thành 6 mức độ sáng khác nhau và dựng sẵn một biểu

đồ thể hiện khả năng tiếp cận của 16S rRNA E.coli Kể từ khi rRNA 16S được bảo quản tốt hơn, biểu đồ này có thể đơn giản việc thiết kế đầu dò hợp lý không chỉ đối với E.coli, mà còn cho tất cả các vi sinh vật khác Tuy nhiên, theo một số nhà nghiên cứu khác, đây là điều bắt buộc để đánh giá và tối ưu hóa thiết kế tất cả các đầu dò tương ứng với các vi sinh vật và thích nghi với những ảnh hưởng tiêu cực trước khi được áp dụng trên các mẫu hỗn tạp và chưa xác định được thành phần

4.2.3 Hàm lượng rRNA thấp

Mặc dù thông thường rất phong phú, nhưng hàm lượng rRNA của các tế bào vi khuẩn khác nhau rất đáng kể không chỉ giữa các loài, mà còn có sự khác nhau giữa các tế bào của cùng một chủng tùy theo các đặc điểm sinh lý liên quan trực tiếp đến tốc độ tăng trưởng của chúng [29,71,111,150] Hoạt tính sinh lý thấp có thể khiến cho cường độ tín hiệu bị yếu hoặc kết quả bị âm tính Khi dò tìm các loài vi sinh vật có tốc độ phát triển chậm, các loại thuốc nhuộm huỳnh quang có độ sáng cao như Cy3 luôn luôn được khuyến khích sử dụng Để tăng cường độ tín hiệu và độ

nhạy của phương pháp, có thể tiến hành đánh dấu đầu dò bằng nhiều chất huỳnh quang khác nhau Hai hay nhiều đầu dò đặc hiệu được đánh dấu với cùng một loại thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để làm tăng số lượng các phân tử huỳnh quang trên mỗi tế bào [81] Kỹ thuật này tất nhiên sẽ bị hạn chế bởi số lượng các trình tự đích có sẵn ứng với các đầu dò bổ sung đặc hiệu.

Như đã đề cập ở trên, độ nhạy của FISH cũng có thể được tăng lên nhờ sử dụng

hệ thống khuếch đại tín hiệu hoặc các đầu dò polyribonucleotide

4.2.4 Ảnh chụp bị mất màu

Nhiều chất nhuộm huỳnh quang bị phai màu nhanh chóng theo sự kích thích của bước sóng ánh sáng, dẫn đến không thể phục hồi những chỗ hư hỏng Những lần phơi sáng chỉ từ vài giây đến vài phút nhưng có ảnh hưởng rất quan trọng, đặc biệt với ảnh chụp qua kính hiển vi Để khắc phục những khó khăn này, việc sử dụng bộ lọc dải hẹp, thuốc nhuộm cyanine bền quang học và các công cụ chống phai màu được khuyến khích mạnh mẽ

4.3 Biện pháp khắc phục

Sử dụng đầu dò vi khuẩn : Cách kiểm soát tốt nhất cho những kết quả bị âm

tính về khía cạnh phương pháp là sử dụng một đầu dò vi khuẩn Nếu tiến hành lai với một đầu dò phổ biến cho được kết quả khả quan trong FISH, thì việc cố định,

sự thẩm thấu và hàm lượng rRNA của vi khuẩn không còn là chỉ số hạn chế EUB338 [7] là đầu dò thường được sử dụng cho mục đích này Tuy nhiên, các

phân tích gần đây đã chỉ ra rằng một số ngành vi khuẩn bao gồm Planctomycetales

và Verhowrucomicrobia vẫn còn bị thiếu đầu dò này [28] Vì vậy, sử dụng một tập

hợp nhiều đầu dò vi khuẩn là điều rất cần thiết để có một cái nhìn toàn diện hơn khi phân tích các quần thể vi khuẩn phức tạp Để kiểm soát những liên kết không đặc hiệu giữa các đầu dò của vi khuẩn nhân thật với 16S rRNA đích hay với các thành phần khác của tế bào so với acid nucleic, việc bổ sung đầu dò có tên là NON338 [150] có thể được sử dụng và nó không phải đưa ra bất cứ tín hiệu nào trong FISH

CHƯƠNG 5 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT FISH

5.1 Sự đa dạng của vi sinh vật

Người ta đã thừa nhận số lượng các loài vi khuẩn trong môi trường tự nhiên vượt xa số lượng các loài đã được phát hiện và mô tả Trong một thời gian dài, sự

đa dạng của vi sinh vật bị đánh giá thấp Trong các mẫu môi trường khác nhau, số lượng tế bào quan sát được qua kính hiển vi đã vượt xa số lượng tế bào vi khuẩn được nuôi cấy theo nhiều quy mô khác nhau [38,74,136] Các phương pháp trước đây hầu như không thể mô tả được chính xác và đầy đủ các loài vi sinh vật này Ngược lại, FISH đã đưa ra hình ảnh chi tiết của môi trường vi sinh mà không có bước làm sạch hay khuếch đại, nên nó đã được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau về môi trường FISH đã được sử dụng trên toàn thế giới để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong tự nhiên như môi trường sống dưới nước,

ví dụ như trầm tích biển Wadden [88], tại vịnh hẹp ở Na-uy [115], sinh vật phù du

ở sông hoặc biển [6,52,73,82], tuyết hồ trên núi cao [155], trong đất [37] và trên bề mặt rễ thực vật [92] Tuy nhiên, khi phân tích trên các mẫu môi trường vi mô phức tạp, sự tự phát huỳnh quang cần phải được hạn chế tối đa

Một ví dụ điển hình là nghiên cứu của Felske năm 1998 _“phát hiện sự nổi trội

chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà Lan” Đây là một loại vi khuẩn hình que,

có chứa ribotype DA001 16S rRNA (ribotype có liên quan đến sự xác định dấu vết

di truyền của DNA, chứa toàn bộ hoặc một phần các đoạn gen mã hóa cho phân tử 16S rRNA hoặc 23S rRNA; ribotype DA001 có trình tự 5’-CTTTGGGAGC TTGCTCCCA-3’) Đầu tiên, vi khuẩn được chiết xuất từ đất, sau đó được cố định

và tiền xử lý cho quá trình lai tại chỗ Quá trình lai được thực hiện trong dung dịch đệm (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2) với sự hiện diện của formamide 20%, 5 lần thể tích chất phản ứng Denhardt, 10 pmol đầu

dò oligonucleotide REX72 (5’-TGGGAGCAAG CTCCCAAAG-3’), và 10pmol đầu dò LGC353b (5’-GCGGAAGATT CCCTACTGC-3’) ở 45oC trong 4h Sau khi lai, dung dịch được ủ với hai lần dung dịch đệm ở 45oC trong 20 phút, và rửa sạch bằng nước khử ion và sấy khô Sau đó nhuộm với dung dịch chứa 1mg 4,6-

diamidino-2-phenylindole (DAPI) trên mỗi ml dung dịch (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2) Những tín hiệu huỳnh quang khi quan sát trên vi khuẩn trong đất tương đối không ổn định so với tín hiệu quan sát trên các môi trường trong phòng thí nghiệm Sử dụng một đầu dò huỳnh quang duy nhất đã không mang lại kết quả thuyết phục Do tín hiệu từ các hạt đất không chứa

vi khuẩn cao, nên rất khó để chứng minh sự khác biệt giữa các tín hiệu đặc trưng

và các tín hiệu nhiễu Đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang tạo ra tín hiệu yếu màu xanh lá cây tương phản lại màu nền từ xanh lục sẫm đến nâu sẫm do các đầu

dò không đặc trưng và sự tự phát huỳnh quang của các hạt đất Vì vậy, chúng tôi sử dụng ba chất huỳnh quang có màu sắc khác nhau nhằm tăng cường tín hiệu và đưa

ra sự tương phản màu sắc giữa các tế bào mục tiêu với nền Đầu tiên DAPI, một thuốc nhuộm huỳnh quang của DNA, được sử dụng để nhận biết tất cả các vi sinh vật với tín hiệu màu xanh Trong thí nghiệm, DAPI đã dò tìm được khoảng 108 loại vi khuẩn trên mỗi gam đất Thứ hai, các đầu dò LGC252b sẽ được nhuộm với Cy3 để phát hiện các tế bào vi khuẩn Bacillus và bào tử với tín hiệu màu đỏ của nó (màu đỏ tía khi nó bổ sung với các tín hiệu màu xanh của DAPI) Khoảng 40% các hạt phát hiện bởi DAPI cũng được phát hiện bởi LGC353b; các hạt này chủ yếu là

có cấu trúc hình cầu, có đường kính nhỏ hơn 1µm và đôi khi phân bố thành cụm (Hình 6a) Các điểm đánh dấu lần thứ ba mang tính đặc hiệu rất cao, đó là sự liên kết giữa các đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang với các ribotype DA001 của

Bacillus Với phương pháp nhuộm nhiều lần này, các tế bào có chứa ribotype

DA001 cần phải có được màu xanh của DAPI trên DNA, màu đỏ của LGC353b trên các trình tự đích đặc hiệu trong rRNA 16S của Bacillus, và màu xanh lá cây của đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang trên các đoạn ribotype Vì ánh sáng màu xanh, đỏ và xanh lá cây hòa vào nhau sẽ tạo ra ánh sáng trắng (Hình 6b), nên các tế bào có chứa DA001 sẽ mang ánh sáng trắng mà được phân biệt rõ ràng từ các tín hiệu nền và vi khuẩn khác Trong một số trường hợp, khi quan sát có thể thấy các tín hiệu là các dấu chấm, các tín hiệu này có thể là bào tử hoặc có thể là các tế bào được quan sát theo chiều thẳng đứng

Mặc dù các tế bào lai với đầu dò REX72 rất nổi bật và phong phú, nhưng các nhà nghiên cứu vẫn gặp phải những vấn đề khi dò tìm các tín hiệu tích cực Để giải quyết điều này, các nhà nghiên cứu phải điều chỉnh nồng độ của vi khuẩn giống như của các hạt trong huyền phù Khi các mẫu vi khuẩn từ đất được pha loãng dưới

200 lần (sau khi ly tâm), các nhà nghiên cứu không thể phát hiện được các tín hiệu tích cực trong tất cả các tín hiệu huỳnh quang có màu sáng Khi mẫu chuẩn bị đã được pha loãng hơn 1000 lần, số lượng các tín hiệu là quá thấp cho các tài liệu hình ảnh đại diện Điều này tương ứng với phạm vi pha loãng vào khoảng 103 đến 104 vi khuẩn trên 1µl

Kết quả thu được đã chỉ ra rằng ribotype DA001 thực sự có nguồn gốc từ một trong những chủng vi khuẩn chiếm đa số trong đất ở đồng cỏ Drentse A (Hà Lan) Hình ảnh và kích thước của các tín hiệu tích cực cho thấy rằng các tế bào dinh dưỡng Bacillus ribotype DA001 có tồn tại Tuy nhiên, đến bây giờ những nỗ lực của các nhà nghiên cứu nhằm nuôi cấy được loài Bacillus này vẫn chưa thành công

FISH không những cung cấp hình ảnh chụp nhanh trong từng thời điểm nhất định mà còn được sử dụng để kiểm soát các mạng lưới vi khuẩn trong dòng chảy liên tục của trầm tích nước biển [22], trong suốt quá trình thay đổi theo mùa của hồ núi cao [108] và thành phần các sinh vật phù du đáp ứng lại với sự gia tăng thảm sinh vật nguyên sinh [64] Hơn nữa, những loài vi sinh vật hoang hóa hoặc mới được định danh gần đây trong ngành vi khuẩn đã được phát hiện bằng cách sử

dụng FISH, như các chủng của loài Holophaga/Acidobacterium [90], một chủng

Bacillus hoang trong đất đồng cỏ Hà Lan [37], và gần đây là chủng Aquabacterium

trong hệ thống nước uống ở Berlin (Đức) [68]

Hình 5 Kết quả hiển thị cho quá trình lai (a)Phát hiện các vi khuẩn Bacillus ribotype DA001 với

ba chất nhuộm khác nhau trên một mẫu đất trích ly được pha loãng 320 lần Độ phóng đại 1200 lần (b)màu sắc dự kiến của ba chất nhuộm trên lý thuyết (c)Phản ứng của đầu dò LGC353b với một mẫu cố định của B.cereus riêng rẽ nhằm chứng minh tính thấm của các bào tử Độ phóng đại

1600 lần (d)Thuốc nhuộm DAPI [37].

Tất cả những nghiên cứu này có một ý nghĩa to lớn đối với sự hiểu biết về thành phần và môi sinh của cộng đồng vi khuẩn tự nhiên và động lực quần thể của chúng

để phản ứng lại những tác động của tự nhiên và loài người

5.2 Hệ vi sinh vật trong nước thải

Ardern và Lockett (1914) đã phát triển hệ thống hoạt hóa bùn đầu tiên để thanh lọc nước thải tại Manchester Tuy nhiên, vai trò của quần thể vi sinh vật trong quá trình này vẫn chưa được hiểu hết Bởi vì những kỹ thuật nuôi cấy thông thường đã được thực hiện là quá chọn lọc để cung cấp một bức tranh toàn diện và đáng tin cậy của toàn bộ mạng lưới vi khuẩn [69,147], phân tích tập hợp các phân tử rRNA đã tìm thấy nhiều ứng dụng rộng rãi cho kỹ thuật phân tích của một số môi trường như bình phản ứng sinh học hay nhà máy xử lý chất thải Các chuỗi trình tự được tạo ra bằng những kỹ thuật phân tích phân tử như kỹ thuật PCR đã được sử dụng để tạo ra các đầu dò oligonucleotide mới cho FISH để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn, như trong bùn hoạt tính [11,127,130] Gần đây, vào năm 1999 Bond và cộng sự đã tiến hành xác định các nhóm vi khuẩn trong bùn với sự tăng cường loại bỏ photpho

sinh học Một số nhóm nhà nghiên cứu khác thì tập trung vào Actinomycetes có

chứa acid mycolic được cho là có chứa nhiều sợi nhỏ tạo bọt trong nhà máy xử lý nước thải [116,117,127] Ngoài các cá thể của nhóm khuẩn cổ, đặc biệt là

methanogen (một loại khuẩn cổ kị khí có khả năng tạo khí methal), đã được tìm

thấy bằng phương pháp FISH trong quá trình phân hủy kị khí và trong hạt bùn nhỏ, mặc dù khả năng tự phát huỳnh quang của chúng rất mạnh [118,132] Gần đây, sự kết hợp giữa FISH và bộ vi cảm biến cho phép phân tích đồng thời quần thể vi khuẩn và các hoạt động trao đổi chất, qua đó phát hiện ra các vi khuẩn kị khí nằm trong các khe nhỏ thiếu oxy trong môi trường hiếu khí [126]

5.3 Vi khuẩn cộng sinh

Hầu hết các vi sinh vật cộng sinh bắt buộc đều chưa tiến hành nuôi cấy được

Sử dụng rRNA 16S, chúng có thể được định danh và phân cấp phát sinh loài Việc khoanh vùng vi sinh vật trong những bộ phận khác nhau của vật chủ bằng FISH có thể chứng minh được tính chất cộng sinh của chúng, như Amann và cộng sự (1991)

đã làm, người đã xác định được vi khuẩn nội cộng sinh chưa nuôi cấy thuộc chi

Holospora trên lông của Paramecium caudatum Từ khi loài Holospora được tìm

thấy trong nhân của các vi sinh vật có lông mịn, nó có thể được nhận biết rõ ràng từ

vi khuẩn tiêu hóa hiện diện trong các túi thức ăn Tương tự, FISH cũng được sử

dụng để chứng minh Paramecium caudatum cũng chứa Caedibacter caryophila,

một “kẻ” tiêu diệt vi sinh vật nội cộng sinh mà sự phát triển có liên quan đến loài

Rickettsia [134] Gần đây, những vi khuẩn nội cộng sinh mới cũng liên quan đến Rickettsia, điều này đã được chứng minh trên các loài Acanthamoeba [44] Có một

điều thú vị là các giống amip tương ứng đều đã được phân lập từ các lớp mô mỏng

giác mạc người Sarcobium lyticum, một loại vi khuẩn có liên quan mật thiết đến chi Legionella, cũng đã được chứng minh có trong amip được lấy từ mẫu nước bọt

của bệnh nhân viêm phổi [135] Những chứng minh này cho thấy rằng amip không những được xem là nguồn gây bệnh cho con người mà còn là vật truyền cho nhiều loại vi khuẩn cộng sinh khác nhau Đây có thể là những trường hợp các vi khuẩn

nội cộng sinh không bắt buộc như Legionella pneumophila đã được tìm thấy trong

tế bào Acanthamoeba castellani [56] và trong Tetrahymena pyriformis có lông

[95] Trong các môi trường nước nghèo dinh dưỡng, Legionellae có thể sống sót

nhưng ở trạng thái vô hoạt, trong đó chúng không bị phát hiện bằng các kỹ thuật nuôi cấy thông thường Phục hồi những tế bào vô hoạt trở lại trạng thái hoạt động

đã được điều khiển thành công bằng FISH trong tế bào chủ tự nhiên Acanthamoeba

castellanii [139] Những nghiên cứu này có một tác động to lớn đối với ngành dịch

tễ học của những mầm bệnh này

Sử dụng các cách thức lai tại chỗ (ISH) khác nhau, vi khuẩn nội cộng sinh đã

được tìm thấy trong mang của động vật thân mềm hai vỏ Solemya reidii Sinh vật

này đã xử lý như một khuôn mẫu để đánh giá kỹ thuật cố định metacrylate và tách acetone nhằm tăng cường độ tín hiệu và nâng cao độ nhạy của ISH trên các đoạn

mô [153] Gần đây, Methanobrevibacter – một loài có liên quan với vi khuẩn cổ –

đã được tìm thấy bằng FISH trong một lượng nội bào của Reticulitermes speratus,

một loài mối cánh được thu thập từ các quần đảo Nhật bản [128]

5.4 FISH trong y học

5.4.1 Các quần thể vi khuẩn phức tạp

a Khoang miệng

Phân tích các quần thể bằng FISH đã thể hiện sự đặc biệt hữu ích trong việc mô

tả các hỗn hợp vi khuẩn phổ biến hay các hệ vi sinh vật nhiễm tạp Những phân tích này đã cho thấy trong khoang miệng người có chứa hơn 300 loài vi khuẩn khác nhau, trong đó có nhiều loài rất phức tạp khi tiến hành nuôi cấy hoặc chưa từng được nuôi cấy Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên quan đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt

sẽ chỉ có được sự xem thường đối với đa dạng vi sinh vật Những lợi ích khi sử dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện trên những vi khuẩn kị khí gram âm, như

Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythus và Prevotella intermedia trong

thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng [48,49] Phân tích sâu hơn trên môi trường phân tử cho thấy một sự đa dạng không ngờ của các loại xoắn khuẩn trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng