Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

Tuy nhiên, có một vài chuyển đoạn hay đột biến gen là đặc trưng của một loại ung thư nhất định, ví dụ như 90% bệnh nhân mắc u lympho thể Burkitt có chuyển đoa ̣n đă ̣c trư ng t8;14 đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN XUÂN HUY

XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN

Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội– Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN XUÂN HUY

XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN

Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ

Tôi xin được cảm ơn các đồng nghiệp trong khoa Di Truyền và Sinh học phân tử – Bệnh viện Nhi TW đã nhiệt tình giúp đỡtrong thời gian tôi thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh học, trường Đại học khoa học tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể thực hiện tốt việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn giúp

đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày …… tháng …… năm 2016

Học viên

Nguyễn Xuân Huy

MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC BẢNG 2

DANH MỤC HÌNH 3

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Lịch sử nghiên cứu 6

1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh 6

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng 6

1.2.2 Phân loại u NBTK 8

1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK 9

1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng của u NBTK 10

1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh 14

1.3.1 Khuếch đại gen MYCN 14

1.3.2 Các bất thường nhiễm sắc thể 17

1.4 Mô hình di truyền trong u NBTK 19

1.5 Tính cấp thiết của đề tài 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Hóa chất thiết bị 22

2.2.1 Hóa chất 22

2.2.2 Trang thiết bị 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Nuôi cấy tế bào mẫu bệnh phẩm tủy xương 22

2.3.2 Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ 23

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Xác định khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân u NBTK bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 26

3.2 Đánh giá khuếch đại gen MYCN với một số yếu tố tiên lượng khác 31

3.2.1 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tuổi 31

3.2.2 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới tính 33

3.2.3 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo mô bệnh học 34

KẾT LUẬN 39

KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

1

1 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

DMs Double-Minute chromatin bodies Đoạn nhiễm sắc thể kép ngắn

FISH Fluorescent in-situ hybridization Kỹ thuật lai huỳnh quang tại

Risk Group Staging System

Hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh theo nhóm nguy cơ

Staging System

Hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh

2

2 DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INSS 9

Bảng 1.2 Các giai đoạn theo INRGSS 10

Bảng 1.3 Chỉ số MKI 13

Bảng 1.4 Bảng phân loại mô bệnh học 14

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào 22

Bảng 3.1 Kết quả xác định gen MYCN trên bệnh nhân UNBTK 28

Bảng 3.2 Danh sách 11 bệnh nhân u NBTK có khuếch đại gen MYCN 29

Bảng 3.3 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31

Bảng 3.4 Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31

Bảng 3.5 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK 34

Bảng 3.6 Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK 35

Bảng 3.7 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học 36

Bảng 3.8 Phân bố khôngkhuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học 37

3

3 DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các vị trí xuất hiện khối u[26] 7

Hình 1.2 Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ [34] 11

Hình 1.3 Cơ chế khuếch đại gen [27] 16

Hình 1.4 Mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh [10] 19

Hình 2.1 Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 24

Hình 3.1 Khuếch đại gen MYCN trên tế bào u 26

Hình 3.2 Khuếch đại gen MYCN trên tế bào tủy xương 27

Hình 3.3 Khuếch đại gen MYCN theo 2 dạng HSR và DMs 27

Hình 3.4 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân U NBTK 29

Hình 3.5 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31

Hình 3.6 Tỷ lệ khuếch không đại gen MYCN theo nhóm tuổi 32

Hình 3.7 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới 33

Hình 3.8 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới 33

Hình 3.9 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u 34

Hình 3.10 Tỷ lệ không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u 35

Hình 3.11 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lượng MBH 36

Hình 3.12 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lượng MBH 37

4

4 MỞ ĐẦU

Ung thư là một rối loạn về phát triển của các tế bào, ở đó các tế bào tăng sinh không kìm hãm, kết quả là hình thành các khối u trong cơ thể Khối u là một tập hợp các tế bào có chung các đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các

cơ quan tổ chức xung quanh Ung thư có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi,trong đó ung thư nhi chiếm khoảng 2% tổng số các loại ung thư

U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm, ở đó

tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chưa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh, chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (dưới 6 tuổi), hiếm khi tìm thấy trên trẻ hơn 10 tuổi Bê ̣nh chiếm khoảng 7% số ca ung thư ở trẻ em trên toàn th ế giới [43] Tỷ lệ mắc mới tại bệnh viện Nhi Trung Ương là khoảng 50 ca/năm Con số này

ổn định trong nhiều năm gần đây Độ tuổi chẩn đoán của bệnhtrung bình là 18 tháng Các biến đổi di truyền ở các tế bào ung thư rất phong phú, từ các bất thường về cấu trúc, số lượng nhiễm sắc thể đến các đột biến gen; dẫn đến làm thay đổi hoạt động của tế bào Tuy nhiên, có một vài chuyển đoạn hay đột biến gen là đặc trưng của một loại ung thư nhất định, ví dụ như 90% bệnh nhân mắc u lympho thể Burkitt có chuyển đoa ̣n đă ̣c trư ng t(8;14) (đầu của nhiễm sắc thể 8 đã được chuyển đến phần cuối của nhiễm sắc thể 14) hay 20-25% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh có đột biến khuếch

đại gen MYCN[40]

Hiện nay các bất thường di truyền này được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong việc tiên lượng và phân nhóm nguy cơ cho các b ệnh nhân u nguyên bào thần kinh Tuy vậy, ở Việt Nam, việc phát hiện các biến đổi di truyền này vẫn chưa được thực hiện, gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ lâm sàng trong vi ệc tiên lượng bê ̣nh và lựa chọn phác đồ đi ều trị cho bệnh nhân Vì vậy, từ nhiều năm nay, việc cần thiết có các xét nghiệm di truyền cho bệnh u nguyên bào thần kinh luôn được đặt ra

Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, nghiên cứu đề tài “Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ” được thực hiện với các mục tiêu sau:

ở trẻ em, có đặc điểm tế bào giống với các tế bào thần kinh nguyên thủy của tuyến tủy thượng thận bào thai Vì vậy, ông đã đặt tên hiện tượng này là “u nguyên bào thần kinh”[31] Các kiểu di căn của u NBTK cũng được mô tả với công bố của bác sĩ William Pepper về các nốt di căn gan của trẻ u NBTK giai đoạn 4S và công bố của bác sĩ Robert Hutchison về các ổ di căn tại mắt [31]

UNBTK ban đầu được phẫu thuật cắt bỏ và xạ trị tại Bệnh viện Nhi Boston từ những năm 1940 [31] Đồng thời, giá trị tiên lượng của tuổi chẩn đoán và di căn xương cũng được xác định Hóa trị liệu bắt đầu được sử dụng vào năm 1951 bởi Farber [17]và 1964 bởi Thurman[34] với một vài thành công bước đầu

1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh

U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm Ở đó

tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chưa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh Chính vì thế, u NBTK thường xảy ra ở trẻ nhỏ[10]

Tỷ lệ mắc mới của u NBTK là 10,2 ca trên một triệu trẻ em dưới 15 tuổi; là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán trong năm đầu tiên của cuộc đời [8, 10, 32]

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng

Khối u bắt nguồn từ các mô c ủa hệ thần kinh giao cảm, điển hình là từ tủy tuyến thượng thận và các hạch thần kinh dọc hai bên cột sống, và vì vậy u có thể xuất hiê ̣n ở nhiều vi ̣ trí khác nhau như ở cổ, ngực, bụng và tiểu khung

7

Hình 1.1 Các vị trí xuất hiện khối u[26]

Các biểu hiện lâm sàng rất đa da ̣ng phu ̣ thuô ̣c vào vi ̣ trí u tiên phát và các biểu hiê ̣n di căn Các triệu chứng như chướng bụng, đau bụng, nôn và kém ăn hay gặp trường hợp u ổ bụng Các khối u ở lồng ngực thường được chẩn đoán một cách tình cờ khi bệnh nhân được chụp X quang tim phổi trong những trường hợp chấn thương hay nhiễm trùng Trong các trường hợp khác, bệnh nhân có thể có các bệnh lý hô hấp kèm theo như viêm phổi, tràn dịch màng phổi Các khối u nằm cao trong lồng ngực hay ở

cổ có thể có triệu chứng sụp mi mắt một bên, co đồng tử, giảm tiết mồ hôi (Hội chứng Horner) Những khối u rất to ở cạnh lồng ngực có thể gây chèn ép cơ giới các cơ quan xung quanh[1]

U NBTK di căn theo đường bạch huyết và đường máu Tế bào u theo đường bạch huyết di căn vào hạch lympho khu vực hoặc hạch xa Theo đường máu tế bào u thường di căn vào tủy xương, xương, gan, da, hiếm khi vào phổi hay não[7, 30].Các bệnh nhân ở giai đoạn này thường có biểu hiện toàn thân như sốt, mệt mỏi, sụt cân

8

Biểu hiện di căn trên lâm sàng ở trẻ dưới 1 tuổi có một số đặc điểm khác biệt với trẻ lớn: hay gặp di căn gan và da, di căn vào tủy xương và xương ít gặp hơn[29, 39].Các

trường hợp di căn não thường có khuếch đại gen MYCN và mô bệnh học không thuận

lợi Các bệnh nhân này có tiến triển xấu, thường nhanh chóng tử vong U NBTK còn

có thể di căn vào phổi, màng phổi[5]

1.2.2 Phân loại u NBTK

ChẩnđoánmôbệnhhọcuNBTKchủyếudựatrênhìnhtháihọc Năm 2003, Hiệp hội

Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế (INPC, International Neuroblastoma Pathology Committee) đã thống nhất đưa ra HệthốngphânloaiuNBTKquốctếdựatrêncácbiếnđổihìnhtháiphốihợpvớiquátrìnhbiệthoácũngnhưcácyếutốtiênlượngMBH,phânloạiuNBTKthành4nhómnhưsau[31]

UNBTK(neuroblastoma)là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm dưới

50% toàn bộ khối u Dựa trên thành phần nguyên bào thần kinh, các u nguyên bào thần kinh được chia thành chưa biệt hóa, ít biệt hóa và đang biệt hóa:

 U nguyên bào thần kinh chưa biệt hóa (undifferentiatedneuroblastoma) chiếm

khoảng 2-3% tổng số u nguyên bào thần kinh

 U nguyên bào thần kinh ít biệt hóa (poorly differentiatedneuroblastoma),

chiếm tới 65-75% các u nguyên bào thần kinh

 U nguyên bào thần kinh đang biệt hóa (differentiatingneuroblastoma) chiếm

khoảng 5% các u nguyên bào thần kinh

UhạchNBTK,hỗnhợp(ganglioneuroblastoma, intermixed) là các khối u giàu mô

đệm Schwann, quá trình biệt hóa chưa hoàn thành, chiếm 2-3% các u nguyên bào thần kinh

UhạchTK(ganglioneuroma) bao gồm u hạch thần kinh đang biệt hóa và u hạch

thần kinh biệt hóa U hạch thần kinh đang biệt hóa là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm ưu thế chủ yếu kèm theo các tế bào đang biệt hóa (nguyên bào thần kinh, tế bào hạch) và đã biệt hóa hoàn toàn (tế bào hạch trưởng thành) Khác với u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp, thành phần tế bào ở đây rất ít, không tạo thành các ổ vi thể mà chỉ là các tế bào riêng lẻ pha trộn lẫn vào U hạch thần kinh biệt hóa bao gồm mô đệm Schwann và các tế bào hạch trưởng thành, không có thành phần

9

nguyên bào thần kinh U hạch thần kinh chiểm tỷ lệ thấp hơn 1% các u nguyên bào thần kinh

UhạchNBTK,nốt(ganglioneuroblastoma, nodular) thường là các ổ nguyên bào

thần kinh chảy máu trên đại thể (nghèo mô đệm Schwann); kèm theo u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp (giàu mô đệm Schwann) và u hạch thần kinh (mô đệm Schwann chủ yếu)[35]

Ngoài racókhoảng4-5 %các uNBTKkhông xếp loại được

1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK

Hệ thống phân loại u NBTK được sử dụng rộng rãi hiện nay là hệ thống INSS

(International Neuroblastoma Staging System), sử dụng kết quả của cuộc mổ đầu tiên,

ra đời năm 1988 bởi Brodeur và cộng sự (Bảng 1.1)[41]

Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INSS

1 Khối u khu trú có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, có hoặc không có tồn

dư bệnh vi thể; biểu hiện qua không di căn hạch bạch huyết 1 bên cơ thể ở mức độ vi thể

2A Khối u khu trú không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, biểu hiện qua

không có di căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể ở mức độ

vi thể

2B Khối u khu trú có hoặc không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn; có di

căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể Hạch bạch huyết mở rộng đối bên phải không có tế bào u di căn ở mức độ vi thể

3 Khối u 1 bên không thể cắt bỏ đã vượt qua đường giữa cơ thể, có

hoặc không có di căn hạch bạch huyết lân cận

4 Bất kỳ khối u tiên phát nào đã di căn các hạch bạch huyết ở xa, tủy,

tủy xương, gan, và/hoặc các nội tạng khác 4S Khối u tiên phát khu trú, đã di căn có giới hạn đến da, gan và/hoặc

tủy xương (tỷ lệ di căn ít hơn 10%), giới hạn với trẻ nhỏ hơn 12 tháng

10

Hệ thống phân loại INRGSS (International Neuroblastoma Risk Group Staging System) (Bảng 1.2) sử dụng hệ thống các yếu tố nguy cơ về hình ảnh chặt chẽ[28]

Bảng 1.2 Các giai đoạn theo INRGSS

L1 Khối u khu trú không liên quan đến các tạng thiết yếu và giới hạn ở

một bên của cơ thể L2 Khối u khu trú ở một khu vực kèm theo một hoặc nhiều hơn yếu tố

nguy cơ về hình ảnh

M Bệnh đã di căn xa (trừ giai đoạn MS)

MS Bệnh di căn ở trẻ ít hơn 18 tháng tuổi, và vị trí di căn là da, gan

và/hoặc tủy xương

Tuy nhiên, với INRGSS, giai đoạn MS còn phải xem xét đến 2 yếu tố là tuổi chẩn đoán (từ 12 đến 18 tháng) và khối u tiên phát lớn không thể cắt bỏ được Bên cạnh đó, nghiên cứu một số lượng lớn bệnh nhân đã cho thấy việc sử dụng 18 tháng làm mốc chia nhóm tuổi chẩn đoán có nhiều ý nghĩa với lâm sàng hơn so với việc sử dụng 12 tháng tuổi như trước đó.Hiện nay, việc sử dụng hệ thống phân giai đoạn INSS hay INRGSS tùy thuộc vào cơ sở vật chất và bác sĩ INSS được lựa chọn ở những nơi

có cơ sở vật chất hay bác sĩ chẩn đoán hình ảnh có nhiều hạn chế Do đó, việc xác định giai đoạn sẽ dựa vào phẫu thuật và điều trị sẽ dựa theo phân loại đó Còn ở những nơi có cơ sở vật chất và tay nghề bác sĩ tốt hơn, các nhà lâm sàng lại sử dụng hệ thống INRGSS Vì khi đó, nhiều bệnh nhân không cần có sự can thiệp về y tế mà vẫn có thể khỏi bệnh, đặc biệt là các khối u khu trú ở trẻ ít hơn 1 tuổi

1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng của u NBTK

1.2.4.1 Sự khuếch đại gen MYCN

Nhiều biến đổi di truyền đã được xác định ở u NBTK có ý nghĩa tiên lượng bệnh, dựa trên đó có thể xác định được các bệnh nhân có nguy cơ tái phát hoặc có xu

hướng tiến triển nặng Trong đó việc xác định khuếch đại gen MYCN có giá trị tiên

lượng cao được sử dụng để phân nhóm nguy cơ [11]

11

Sự khuếch đại MYCN thường xảy ra ở các u nguyên bào thần kinh tiên phát trên

các bệnh nhân chưa được điều trị Sự khuếch đại này thường gặp ở các giai đoạn muộn của bệnh với kết quả điều trị thấp, nhưng cũng có thể được tìm thấy ở các u tiến triển nhanh và có tiên lượng xấu, hoă ̣c th ậm chí ở trẻ sơ sinh hay bệnh nhân ở giai

đoạn khu trú Tỷ lệ khuếch đại MYCN ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh là 20 –

25% [6, 11, 20]

Hình 1.2 Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ [34]

Nhóm bệnh nhân nguy cơ cao:

- Bệnh nhân u NBTK ở giai đoạn 1,2,3 hoặc 4S có khuếch đại gen MYCN

- Bệnh nhân u NBTK ở giai đoạn đoạn 4 và tuổi chẩn đoán ≥12 tháng

- Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuối chẩn đoán ≤ 12 tháng, và có khuếch đại

gen MYCN

Nhóm bệnh nhân nguy cơ trung bình:

- Bệnh nhân u NBTK không có khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 2 hoặc 3,có

mất đoạn 1p

Phân nhóm nguy cơ u NBTK

2004

Giai đoạn 1-3 hoặc 4S Không khuếch đại

Mất đoạn 1p Không mất đoạn 1p

Giai đoạn 2 Giai đoạn 3

Tuổi 2 Tuổi < 2

12

- Bệnh nhân u NBTK không có khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 3, không mất

đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≥24 tháng

- Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuổi chẩn đoán ≤ 12 tháng, không có khuếch

đại gen MYCN

Nhóm bệnh nhân nguy cơ thấp:

- Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 1 hoặc 4S không có khuếch đại gen MYCN

- Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 2, không có khuếch đại gen MYCN, không mất

đoạn 1p

- Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 3, không có khuếch đại gen MYCN, không mất

đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≤24 tháng

1.2.4.2 Tuổi của bệnh nhân u NBTK

Ngay từ những thời điểm đầu nghiên cứu và chẩn đoán u nguyên bào thần kinh (1950), các nhà lâm sàng đã nhận thấy sự liên hệ giữa tuổi chẩn đoán của bệnh nhân với tiên lƣợng điều trị Các bệnh nhân sơ sinh có đáp ứng điều trị tốt hơn so với các bệnh nhân nhi lớn tuổi[16]

Đến năm 1971, Breslow và McCann đã chứng minh rằng tuổi chẩn đoán vừa là một yếu tố tiên lƣợng quan trọng, vừa là một yếu tố tham gia vào việc xác định giai đoạn cho bệnh nhân [9]

Năm 2009, trong báo cáo của tổ chức Ung thƣ Trẻ em (Children’s Oncology Group - COG) do Susan Cohn và cộng sự công bố, điểm cắt giữa 2 nhóm tuổi chẩn đoán có những tiên lƣợng khác nhau đã đƣợc thông qua với sự đồng thuận quốc tế là

18 tháng Tuy nhiên với các bệnh nhân giai đoạn M và không có khuếch đại gen

MYCN, việc đánh giá tiên lƣợng về tuổi sẽ áp dụng điểm cắt về tuổi là 12 tháng [14]

Có 3 nhóm nguy cơ đƣợc xác định tỷ lệ sống sót trong vòng 5 năm dựa trên độ

tuổi, giai đoạn và trạng thái của gen MYCN nhƣ sau:

 Các bệnh nhân ở giai đoạn 1, 2, hay 4S ở tất cả các độ tuổi mà không có

khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó là 95% [23]

 Các bệnh nhân ở giai đoạn 3 cũng nhƣ các bệnh nhân sơ sinh ở giai đoạn

4, không có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó khoảng 75% [10]

 Các bệnh nhân lớn hơn 1 tuổi ở giai đoạn 4, ở giai đoạn 2 hay 3 mà có

Chỉ số MKI được chia thành 3 loại (Bảng 1.3):

Bảng 1.3 Chỉ số MKI

Tỷ lệ phần trăm Số lượng tế bào

Chỉ số MKI cao thường gặp ở các u NBTK chưa hoặc ít biệt hóa có khuếch đại

gen MYCN[31]

Tiên lượng mô bệnh học

Hiệp hội Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế phân biệt thành 2 nhóm tiên lượng mô bệnh học: mô bệnh học thuận lợi và mô bệnh học không thuận lợi (Bảng 1.4) Việc phân chia bệnh nhân vào 2 nhóm tiên lượng này dựa vào tuổi chẩn đoán, trạng thái biệt hóa của khối u và một số đặc điểm khác như chỉ số nhân chia/nhân tan (MKI), nốt canxi hóa

Từ các yếu tố tiên lượng trên kết hợp với tuổi chẩn đoán của bệnh nhân, hai nhóm mô bệnh học được phân chia

14

Bảng 1.4 Bảng phân loại mô bệnh học

Nhóm mô bệnh học thuận lợi

U NBTK ít biệt hóa MKI trung bình Ít hơn 1,5 tuổi

U NBTK đang biệt hóa MKI trung bình Ít hơn 1,5 tuổi

U hạch NBTK thể hỗn hợp Không áp dụng Mọi độ tuổi

U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi

Nhóm mô bệnh học không thuận lợi

U NBTK ít biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi

U NBTK đang biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi

U NBTK đang biệt hóa Không áp dụng Trên 5 tuổi

U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi

Nhiều nghiên cứu đã xác định yếu tố MBH có giá trị tiên lượng quan trọng, nhóm u có MBH thuận lợi có kết quả điều trị tốt hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm MBH không thuận lợi Yếu tố MBH được sử dụng trong nhiều phác đồ để phân nhóm nguy cơ [21, 31, 32]

1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh

1.3.1 Khuếch đại gen MYCN

Gen MYCN là một gen tiền ung thư, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 2

tại vị trí 2p24.3 Gen có kích thước 2602 bp gồm có 3 exon, mã hóa cho protein

MYCN gồm 464 axit amin[19]

15

Là một gen trội điển hình, sự biểu hiện của MYCNcó thể thấy trong các tế bào

xô-ma, và thường có sự kết hợp với các yếu tố gây ung thư khác Sự biểu hiện quá

mức của genMYCN có thể biến đổi các tế bào nguyên bào sợi từ giai đoạn bào thai sang giai đoạn lão hóa Đồng thời, sự có mặt với số lượng lớn của protein MYCN

trong các dòng tế bào nguyên bào thần kinh có có thể làm chậm sự phát triển hoặc giảm quá trình biệt hóa [25]

Mặc dù sự khuếch đại genMYCN đã được khẳng định trong bệnh u nguyên bào thần kinh với tiên lượng xấu, protein MYCN có vai trò khuếch đại trong khối u hay

không vẫn còn gây nhiều tranh cãi Một số các dòng tế bào u nguyên bào thần kinh có

biểu hiện mức độ cao với protein MYCN mà không có khuếch đại gen.Điều này có thể

do sự thay đổi trong chu trình suy thoái protein hơn là trong quá trình tự điều hòa dịch

mã gene MYCN

Ở giai đoạn đầu, sự biểu hiện của protein MYCN có thể được tìm thấy ở tất cả các giai đoạn của bệnh Điều này được cho rằng sự biểu hiện của MYCN không liên

quan đến kiểu hình lâm sàng Tuy nhiên, trong nhóm các khối u không có sự khuếch

đại genMYCN, một số nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện protein MYCN có liên quan

tới khả năng sống sót; trong khi đó, một số nghiên cứu khác lại không thấy sự liên quan nào Trong tương lai, với các nghiên cứu lớn hơn về việc điều trị bệnh nhân với các phương pháp tiêu chuẩn là cần thiết để tìm hiểu về mức độ biểu hiện protein

MYCN có liên quan đến tiên lượng tiến triển các khổi u khi thiếu sự khuếch đại genMYCN[25]

Các nghiên cứu đầu tiên về u nguyên bào thần kinh cho thấy các tế bào u nguyên

bào thần kinh đều có các mảnh nhỏ chất nhiễm sắc kép (double-minute chromatin bodies (DM)) cũng như các vùng bắt màu đồng nhất (homogeneously staining regions (HSR)) trên các nhiễm sắc thể lớn Về sau, những bất thường nhiễm sắc thể này đều

được khẳng định là biểu hiện về mặt di truyền tế bào của một sự khuếch đại, gen

MYCN Tuy nhiên, sự khuếch đại MYCN thường được tìm thấy ở ngoài vị trí này:

hoặc trong vùng HSR của nhiễm sắc thể khác, hoặc trong DM ngoài nhiễm sắc thể, hoặc cả hai

16

Hình 1.3 Cơ chế khuếch đại gen[27]

Cơ chế khuếch đại MYCN đến nay vẫn chưa được hiểu hết Theo nghiên cứu của

Matsui A và cộng sự (2013), đầu tiên DSB (Double - stranded break) xuất hiện ở vùng đứt gẫy telomere trên nhiễm sắc thể Để thay thế, sợi chromatid bị mất vùng telomere được tái tạo Hai đầu bị mất vùng telomere được ghép nối và tạo thành dạng nhiễm sắc thể có hai tâm (dicentric chromosome) Tại thời điểm phân bào, hai tâm này

sẽ được kéo về hai đầu tâm động của thoi vô sắc và tạo thành cầu nối chromatid Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể sẽ gây ra các vị trí đứt gẫy ngẫu nhiên của các cầu nối chromatid, và tạo ra các vùng kết thúc mới nhưng thiếu đoạn telomere mới Cuối giai đoạn phân bào sẽ tạo ra một tế bào sẽ có dạng nhiễm sắc thể hai tâm và một

tế bào sẽ có một đoạn nhiễm sắc thể thiếu vùng telomere Các chu kỳ trên sẽ được lặp

17

lại và khuếch đại với các trình tự lặp đảo ngược (HSR) - (A) hoặc khuếch đại tăng sinh nhiễm sắc thể (DMs) - (B) (Hình 1.3)[27]

Trong quá trình nhân lên của tế bào, gen MYCN nằm trên NST số 2 cũng được

nhân lên theo chu trình tế bào Tuy nhiên, khi có rối loạn trong quá trình đó, gen

MYCN được khuếch đại lên nhiều bản sao ở các NST khác tạo nên cùng HSRhoặc gen

1 đoạn lặp nhỏ gen MYCN tách trực tiếp khỏi NST hình thành vòng lặp (DM) Các

DM này có thể được tích lũy lại nhờ quá trình phân chia không đều trong phân bào, hoặc trong một số trường hợp khác, các DM sẽ tập hợp thành một locus nhiễm sắc thể

để tạo nên HSR[12, 16, 24, 37]

Vùng khuếch đại trên NST số 2 có kích thước thay đổi từ 350-2000kb nhưng luôn có một cùng khuếch đại bảo thủ dài 130kb Theo Westermann F (2008)trong

một công bố của mình đã giả thiết rằng khuếch đại gen MYCN là một tính chất sinh

học xuất hiện ngay từ đầu ở nhóm U NBTK ác tính cao và các khối u không có khuếch đại gen tại thời điểm chẩn đoán hiếm khi có đặc điểm sinh học này Khuếch

đại gen MYCN hiện nay được chấp nhận rộng rãi có liên quan đến tiên lượng bệnh và trong phần lớn các phác đồ điều trị hiện nay đều cần có kết quả trạng thái gen MYCN

trước khi bắt đầu điều trị cho bệnh nhân [38]

1.3.2 Các bất thường nhiễm sắc thể

1.3.2.1 Bất thường số lượng nhiễm sắc thể

Phần lớn các khối u đều có nhiễm sắc đồ thể lưỡng bội Các khối u ở giai đoạn sớm của bệnh thường ở thể đa bội hay gần tam bội Nhiễm sắc đồ của các tế bào u có thể có giá trị tiên lượng, nhưng phân tích nhiễm sắc thể khá khó khăn Trạng thái bội thể này có ý nghĩa tiên lượng vào vi ệc dự báo kết quả điều trị ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh dưới 1 tuổi nhưng không có ý nghĩa tiên lư ợng đối với các bệnh nhân lớn Điều này có thể là do ở các bệnh nhân dưới 1 tuổi thể đa bội hay gần tam bội có thêm cả nhiễm sắc thể mà không có các biến đổi cấu trúc, trong khi với các bệnh nhân lớn hơn, các biến đổi này đi kèm với sự thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể [36]

đoạn dị hợp tử 1p rất hay đi kèm với sự khuếch đại MYCN Ý nghĩa tiên lượng

độc lập của mất đoạn dị hợp tử 1p vẫn còn đang được tranh luận nhưng các bằng chứng hiện nay chỉ ra rằng mất đoạn dị hợp tử ở vị trí 1p36 đi kèm với kết quả điều trị thấp và là yếu t ố tiên lượng xấu ở các b ệnh nhân nguy cơ thấp và trung bình [4]

 Thêm đoạn ở cánh dài nhiễm sắc thể số 17 (17q)

Biến đổi di truyền hay gặp nhất ở các bệnh nhân u NBTK là thêm đoạn ở cánh dài nhiễm sắc thể số 17 (17q) (khoảng 50% số ca) Bên cạnh một phần nhất định số ca thêm đoạn 17q là kết quả của sự thêm đoạn không cân bằng xảy ra độc lập, phần nhiều các trường hợp là do sự chuyển đoạn không cân bằng giữa 17q và nhiễm sắc thể khác Vị trí chuyển đoạn với 17q hay gặp nhất là 1p, và

tiếp theo sau là 11q [36]

 Các biến đổi khác

Ngoài 3 biến đổi di truyền nói trên, gần đây trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh, người ta còn đánh giá thêm sự mất đoạn trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 11 (11q23.3) và 14 (14q23-32) Mất đoạn 11q xảy ra ở 43% u nguyên bào thần kinh và là mô ̣t trong các m ất đoạn phổ biến nhất đối với loại ung thư này (tỷ lệ mất đoạn 14q là 23%) [13] Mất đoạn 11q và 14q thường xảy ra cùng

nhau và ngược với sự khuếch đại MYCN và mất đoạn 1p

19

1.4 Mô hình di truyền trong u NBTK

Dựa trên tất cả các biến đổi di truyền nói trên, một mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh đã được đề xuất nhưHình 1.4

Hình 1.4 Mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh [10]

Theo đó, từ các tế bào ban đầu, phụ thuộc vào các dạng đột biến xảy ra, u nguyên bào thần kinh sẽ đi theo một trong hai nhánh lớn:

Nhánh thứ nhất được xác định bởi sự hoạt động giảm phân không bình thường, dẫn đến thể đa bội hay gần tam bội (3N) với sự tăng số lượng các nhiễm sắc thể, có rất

ít sự thay đổi về cấu trúc Các khối u này thiên về hướng biệt hóa tiếp hay chết theo chương trình (apoptosist), tùy thuộc vào sự có mặt hay không nhân tố phát triển thần kinh trong môi trường nội bào Các bệnh nhân thuộc nhánh này thường dưới 1 tuổi, khối u khu trú ở giai đoạn 1, 2 hoặc 4S và có tiên lượng tốt (tỷ lệ sống trong 5 năm là 95%)

Nhánh thứ hai thường có thể lưỡng bội (2N) hay tứ bội (4N), nhưng được xác định chủ yếu nhờ các bất thường nhiễm sắc thể lớn, trong đó nhiều nhất là thêm đoạn 17q Tại đây có hai nhóm nhỏ hơn được xác định phân biệt nhau Một nhóm có sự mất đoạn 11q và/hoặc có mất đoạn 14q Các bệnh nhân ở nhóm này thường lớn hơn 1 tuổi,