phương pháp phân tích đạm amin, đạm thối

phương pháp phân tích đạm amin- đạm thối; các phương pháp xác định đạm amin: xác định đạm amin bằng phương pháp chuẩn độ Formol; xác định đạm amin bằng phương pháp Pope- stevens; xác định đạm amin bằng phương pháp chuẩn độ bằng pH kế; các phương pháp xác định đạm thối: xác định đạm thối bằng phương pháp Nesler; xác định đạm thối bằng phương pháp Kjedahl; xác định đạm amin là xác định gì; xác định đạm thối là xác định gì

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Môn học: KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

LƯƠNG THỰC THỰC PHẨM VÀ AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM

Chủ đề

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐẠM AMIN - ĐẠM THỐI

- Phương pháp chuẩn độ Formol.

- Phương pháp Pope – Stevens.

Xác định hàm lượng nitơ formol là xác định hàm lượng tổng số các acid amin

và muối amoni có trong thực phẩm Trong thực thế, lượng muối amoni là rất ít, nên

có thể xem như xác định niơ formol chủ yếu là xác định acid amin

1 Đạm amin (Đạm formol)- Phương pháp xác định

1.1 Phương pháp chuẩn độ

Formol

Nguyên tắc:

Các acid amin trong nước thì trung tính, do trong phân tử các acid amin đều

có chứa nhóm amin và nhóm cacboxyl

Khi acid amin gặp formol thì tạo thành nhóm –N=CH2 (metylenic) làm cho tính acid của nhóm –COOH tăng lên

Có thể định lượng nhóm –COOH bằng dung dịch kiềm chuẩn và chỉ thị. 

Phản ứng chuẩn độ bởi kiềm

Khi có mặt của formaldehyde

Hóa chất & Dụng cụ

Formol trung tính

Dung dịch Ba(OH)2 bão hòa

Cân chính xác P (g)/ V (mL) chất thử đã xay nhuyễn

cho vào bình định mức 100mL + 50mL nước cất Lắc

Tiến hành

Xác định lại nồng độ của NaOH bằng

H2C2O4 0,1N với chỉ thị phenolphtalein.

Hút 20mL dung dịch xác định cho vào bình tam giác 250mL Thêm 20mL dung dịch formol trung tính

Chuẩn độ bằng NaOH 0,2N cho đến màu đỏ tươi.

Tính toán kết quả

- Đối với mẫu rắn:

- Đối với mẫu lỏng:

Chú ý

Ảnh hưởng đến kết quả

phân tích

Phản ứng kết thúc khi PP chuyển màu đỏ tươi chứ không phải màu hồng như thông thường

Cần phải loại bỏ bằng cách kết tủa với BaCl2

và Ba(OH)2

Điểm chuyển màu rất khó nhận vì khó xác định lúc nào là chuyển sang màu đỏ tươi

1 2 Phương pháp Pope – Stevens

Nguyên tắc:

Để định lượng acid amin của dung dịch nghiên cứu cần cho thêm vào môi trường base yếu dung dịch

đồng phosphate dư trong dung dịch đệm borate (pH 9,2).

Các acid amin kết hợp với muối đồng thành phức amin đồng hòa tan theo phản ứng:

Đồng phosphate dư được loại bỏ bằng cách lọc, sau đó cho thêm CH3COOH và KI Xác định lượng

đồng bằng cách chuẩn độ với dung dịch thiosulfate (Na2S2O3):

2Cu2+ +4KI  2CuI + I2 I2 + Na2S2O3  Na2S4O6 + 2NaI

Hòa tan trong NaCl bão hòa.

Pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc 0,1N đã được chỉnh bởi KIO3.

0,25g thymolphtalein hòa tan trong 100mL dung dịch etanol 50%.

Tinh thể KI

Hóa chất

& Dụng cụ

Bình định mức 25mL

Pipet 1mL

Cốc thủy tinh

Pipet 10mL Pipet 5mL

Quy trình thực hiện

Lấy 2mL dung dịch chứa acid amin vào bình

định mức 25mL + 2 giọt thymolphtalein + từng giọt

NaOH 1N khi xuất hiện màu xanh nhạt (pH khoảng 10).

Cho 10 - 15mL CuSO4 (đủ dư với amino acid) + nước vào bình đến 25mL và lắc kỹ, để yên 5 phút Kết tủa (đồng phosphate dư) được li tâm hoặc lọc qua giấy lọc.

Lấy 5 - 10mL dịch li tâm hoặc dịch lọc cho vào cốc, cho thêm 0,5 mL CH3COOH đặc và 0,2 – 0,5 g KI trộn đều

Đậy nắp để yên nơi tối vài phút.

Chuẩn độ I2 giải phóng bằng Na2S2O3 0,01N cho đến màu vàng nhạt Gần kết thúc chuẩn độ cho thêm khoảng 2-4 giọt hồ tinh bột 1% và tiếp tục chuẩn cho đến khi mất màu xanh tím Ghi nhận thể tích Na2S2O3.

Tiến hành tương tự với mẫu trắng

Tính toán kết quả

Trong đó:

mN là khối lượng nitơ (g).

A là số mL Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm.

B là số mL Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình kiểm tra (mẫu trắng) 0,28 là 1mL Na2S2O3 0,01N tương ứng với 0,25mg nitơ.

Chú ý

Khi sử dụng phương pháp này phải loại bỏ đồng phosphate dư trong dung dịch nghiên cứu, vì nó sẽ làm tăng kết quả chuẩn độ Ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng được nitơ amin của acid amin khi có một lượng nhỏ amoniac và ngay cả 1 lượng lớn ure

Điều kiện xác định

Ta coi nhóm cacboxyl được chuẩn độ bằng kiềm chính là số phân tử acid amin trong mẫu

Đối với các acid amin dicacbonxylic thì phải trung hòa trước nhóm cacboxylic tự do đến pH = 7

Từ lượng NaOH 0,2N đã dùng để chuẩn độ suy ra lượng nitơ trong mẫu

Do đó khó nhận biết lúc chuyển màu nên thường dung dịch màu tiêu chuẩn như sau: lấy 100mL Na2HPO4 0,1N và cho thêm 0,5mL phenolphtalein 0,1%

Quy trình tiến hành

* Chuẩn bị dung dịch mẫu:

Nghiền nhuyễn, cân chính xác 3 - 5g mẫu cho vào bình

định mức 100mL + 50mL nước cất, lắc mạnh cho tan

hết, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc đều, để yên

trong 10 phút, lọc qua giấy lọc.

Dùng pipet lấy chính xác 10mL cho vào bình định mức 100mL, cho nước cất đến vạch định mức.

OR

* Trung hòa mẫu:

Dùng pipet lấy chính xác 20mL dung dịch

mẫu cho vào bình nón 250mL.

Cho tiếp 2mL phenolphtalein 0,5% 20mL nước cất, trung hòa dung dịch với NaOH 0,1N.

Trung hòa NaOH nếu mẫu có tính acid cho đến màu hồng nhạt hoặc trung hòa dung dịch mẫu với HCl 0,1N.

Trung hòa NaOH nếu mẫu có tính bazơ cho đến khi không màu

và lấy lại màu hồng nhạt bằng vài giọt NaOH 0,1N.

Quy trình tiến hành

Chuẩn độ dung dịch đã trung hòa bằng NaOH 0,1N từ màu hồng nhạt sang màu hồng.

Cho 10mL formol trung tính dung dịch sẽ mất màu, tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi

Tính toán kết quả Hàm lượng nitơ formol được tính bằng công thức:

+ Đối với sản phẩm khô hay ướt:

+ Đối với sản phẩm lỏng:

Trong đó:

Vo: thể tích bình định mức (mL).

V’: thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ (mL).

V: Số mL NaOH 0,2N tiêu tốn để chuẩn.

Vm: số mL mẫu phân tích.

m: lượng cân mẫu (g).

0,0028: lượng nitơ ứng với 1mL NaOH 0,2N (g).

Nhận xét

Người phân tích khó nhận biết được điểm tương đương do sự chuyển màu của chỉ thị không quá đột ngột Do đó để nhận biết chính xác sự đổi màu của chất chỉ thị thì mắt người phân tích phải tốt, nhận biết màu đỏ thắm quen và có dung dịch chuẩn

Điều kiện xác định

Đối với mẫu

Điều kiện chuẩn độ Điều kiện phản ứng thế

Phản ứng thế xảy ra tương đối chậm

 Khuấy trộn để tạo áp suất trong dung dịch

lớn hơn áp suất bên ngoài  tránh oxi xâm

nhập.

Khi cho HCHO vào thì pH giảm chuẩn từng giọt NaOH cho đến khi pH = 8,3 dừng chuẩn độ.

m: khối lượng mẫu (g).

ĐN: đương lượng gam của nitơ.

N: nồng độ đương lượng của OH-.

V: thể tích của OH-.

f: hệ số pha loãng.

2 Phương pháp xác định đạm thối

Nguyên tắc

Trong nguyên liệu, thường chứa một loại nitơ dưới dạng vô cơ (muối amonium hay những amin dễ bay hơi) Đây là dạng nitơ được tạo thành do sự phân hủy của protein

Trong các phương pháp định lượng nitơ toàn phần, nitơ formol (dung lượng acid amin) đều có định lượng kèm cả NH3 Do đó khi xác định NH3 trong thực phẩm một mặt

sẽ xác định độ hư hỏng của thực phẩm, mặt khác đánh giá được giá trị thật của protid, acid amin trong thực phẩm

2.1 Phương pháp Kjedahl

Nguyên tắc:

Chưng cất khi dùng một base mạnh hơn NH3 để đẩy NH3 ra khỏi

muối Sau đó, chuẩn lượng NH3 bay ra bằng một acid

Điều khác biệt so với quy trình xác định đạm tổng số là:

− Không trải qua giai đoạn vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc.

− Không dùng chất kiềm quá mạnh để đẩy amoniac để tránh ảnh hưởng

đến thực phẩm

Trong phương pháp này ta sử dụng kiềm NaOH 2N Dùng hơi nước kéo amoniac đã được giải phóng ra thể tự

do sang bình chuẩn độ và kết hợp lượng dư H2C2O4 0,1N Chuẩn lượng dư H2C2O4 sau khi cất xong bằng kiềm NaOH với chỉ thị Tashiro

Hóa chất

Dung dịch NaOH 0,1 và 2N

Dung dịch H2C2O4 0,1NChỉ thị Tashiro

Thiết bị

Hệ thống chưng cất Kjeldahl

Quy trình tiến hành

5

6 Ở bình hướng dịch có chứa sẵn 20mL H2C2O4 0,1N + 3 giọt chỉ thị Tashiro.

Đưa toàn bộ phần dung dịch qua lọc vào bình chưng cất, dùng nước cất 2 lần trung tính để tráng

rửa.

Chuẩn bị mẫu

Quy trình tiến hành

Cho 25mL NaOH 2N qua phễu, sau đó xả từ từ cho

đến khi còn 1mL, thêm 5mL nước cất, xả cho đến

khi còn 2 – 3 mL thì khóa lại

Tiến hành cất cho đến khi thu được dịch cất khoảng 100mL (thử hết NH3) dùng nước để rửa cuống phễu

Chuẩn lượng acid dư sau khi hấp thụ dung dịch cất bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi dung dịch từ màu tím hồng chuyển sang màu xanh lơ

Ghi nhận VNaOH

Nồng độ (g/l) đạm thối trong mẫu thực phẩm được tính theo công thức:  

Tính toán kết quả

Trong đó:

V1: thể tích H2C2O4 0,1N cho vào bình hứng (mL).

V2: thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn trong chuẩn độ (mL) N: đương lượng dung dịch NaOH 0,1N.

F: hệ số điều chỉnh dung dịch NaOH.

V: thể tích mẫu (mL).

2.2 Phương pháp Nessler

Nguyên tắc:

Đẩy amoniac ra thể tự do bằng MgO, cất kéo hơi nước và định lượng amoniac với thuốc thử Kali Mercuri – Iodua (thuốc thử Nessler), so màu vàng hình thành với thang mẫu hoặc ở quang sắc kế Cường độ màu phụ thuộc vào lượng NH3 có trong mẫu

Amoniac tác dụng với thuốc thử Nessler trong môi trường kiềm cho ra sản phẩm có màu vàng Đo độ hấp thu của dung dịch khi phản ứng xảy ra sau 10 phút tại λ = 430nm

2K2HgI4+ NH3 + 3KOH  (NH2)Hg-O-HgI + 7KI + 2H2O

( màu vàng )Phương pháp Nessler áp dụng cho mẫu có nồng độ N-NH3 (Ammonia-nitrogen) nhỏ hơn 20µg/L

Điều kiện xác định

Để đảm bảo phương pháp so màu được chính xác cần phải tránh:

− Sự phân hủy dễ dàng của phức chất “amoniac + kali mercuri – iodua” ( K2HgI4)

− Sự kết tủa của phức chất do một lượng amoniac thừa

− Sự vón cục hoặc kết tủa do lắc quá mạnh

Do đó cần phải tiến hành định lượng ở môi trường kiềm có muối kép natri kali tactrat (C4H4KNaO6)

Hòa tan 3,82g NH4Cl nguyên chất

vào 1000mL nước cất

1mL dung dịch chứa 10µg nitơ amoniac

Hóa chất

Dung dịch amoniac clorua tiêu

chuẩn (1)

Hòa tan muối kép natri kali tactrat vào nước cất, cho thêm NaOH và KOH

Để yên ít nhất là 2 ngày, lúc nào cũng có cặn ở đáy chai , khi sử dụng chỉ hút nước ở mặt trên

Hóa chất

Dung dịch muối natri kali tactrat kiềm (2)

Lúc nào cũng sẽ

có cặn ở đáy chai, khi dùng chỉ được hút nước bên trên

Cho nước vừa

đủ 1000mL, để yên ít nhất trong hai ngày

Cho thêm dung dịch KOH với khoảng 100mL nước cất

Hòa tan khoảng

0,1   2,0   2,0   50,0   10,0   12,14  

1,5   2,0   2,0   50,0   15,0   18,21  

2,0   2,0   2,0   50,0   20,0   24,28

2,5   2,0   2,0   50,0   25,0   30,36

3,0   2,0   2,0   50,0   30,0   36,43

3,5   2,0   2,0   50,0   35,0   42,50

4,0   2,0   2,0   50,0   40,0   48,56

4,5   2,0   2,0   50,0   45,0   54,63

5,0   2,0   2,0   50,0   50,0   60,71

Sau khi hết ammoniac, ngừng cất và chuyển dịch sang bình định mức.

Cân hoặc hút chính xác mẫu vào bình cùng với một lượng MgO cần thiết để tạo môi

trường kiềm

Chuẩn bị mẫu thử

Quy trình tiến hành

5

6 Lắc nhẹ để 10 phút rồi so sánh với thang mẫu.

Cho vào ống Nessler khác 50mL dịch thử đã pha, thêm 2mL muối natri kali tactrat kiềm và 2mL thuốc

thử Nessler.

Chuẩn bị mẫu

Thank you for your listening